祛瘀解毒消癥湯對子宮內(nèi)膜異位癥大鼠腹腔液中IL－6、IL－8水平的影響

張曉峰 張明亮 西安市中醫(yī)醫(yī)院（西安 710001）

子宮內(nèi)膜異位癥（EMT）既是婦科常見病、多發(fā)病，也是難治性疾病，因此近年來一直是婦科領(lǐng)域研究的熱點。國內(nèi)外學(xué)者［1－2］研究發(fā)現(xiàn)，腹腔微環(huán)境中巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，而EMT患者腹腔液中許多細(xì)胞因子的水平高于正常婦女，提示細(xì)胞因子參與改變腹腔環(huán)境的免疫動態(tài)平衡，在EMT的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本研究旨在觀察祛瘀解毒消癥湯對EMT模型大鼠腹腔液中細(xì)胞因子白細(xì)胞介素－6（IL－6）、白細(xì)胞介素－8（IL－8）水平的影響，為臨床以祛瘀通絡(luò)、解毒化濁、消癥止痛為法組成的中藥復(fù)方制劑治療本病的有效性提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法 1.1 實驗材料 1.1.1 實驗動物：選取SPF級9周齡的健康性成熟未交配SD大鼠60只，體重180±20ɡ／只，動物合格證：SCXK（陜）2007－001號，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫25±5℃，濕度55±5%，空氣清新，通風(fēng)良好，自由進食標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料、自來水。

1.1.2 實驗主要藥品及試劑：祛瘀解毒消癥湯：由陜西中醫(yī)學(xué)院制劑室，將中藥煎煮濃縮成含生藥2.0g／mL的湯劑。丹莪婦康煎膏：由昆明滇虹藥業(yè)有限公司生產(chǎn)提供，批號：091208，以1%的甲基纖維素鈉（CMC－Na）溶解成含生藥0.2g／mL的溶液。IL－6、IL－8酶免試劑盒：購自西安永屹生物技術(shù)有限公司。10%水合氯醛250g／瓶：西安楊森制藥廠生產(chǎn)，批號：0911635。0.9%氯化鈉500mL／瓶：西安康華制藥廠生產(chǎn)，批號：0912089。75%酒精500mL／瓶：西安康華制藥廠生產(chǎn)，批號：1001920。注射用青霉素鈉80萬單位／支：哈藥集團制藥總廠，批號：A090801910。苯甲酸雌二醇注射液：2mg／mL，由上海通用藥業(yè)股份有限公司提供，批號：100103。

1.1.3 藥物制備：根據(jù)施氏法以每千克體重折算系數(shù)計算出給藥劑量［3］，配備好的試驗組及對照組藥物均置冰箱4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 實驗主要儀器及設(shè)備：電子分析天平、全自動酶標(biāo)儀由上海恒平科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG－9075）由上海一恒科技有限公司生產(chǎn)；高速旋轉(zhuǎn)離心機由北京東訊天地儀器有限公司生產(chǎn)；快速混勻器（sk－1型）由常州國華電器有限公司生產(chǎn)；手提式壓力蒸汽消毒器（YX－280B型）由江陰濱江醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)；NR－B17CC型冰箱由日本松下公司生產(chǎn)。

1.2 實驗方法 1.2.1 模型制備、動物分組：EMT模型制備：采用經(jīng)典的造模法［3］。建模成功的標(biāo)志為異位病灶呈米粒大小之結(jié)節(jié)，切面可見線形閉合水孔，異位內(nèi)膜組織均形成囊狀，囊內(nèi)為無色透明液體，有的囊形成多個串珠狀，周圍可見豐富血管形。在造模成功的大鼠中隨機選出40只，隨機分為5組，加空白組共6組，具體分組情況如下：A組為空白組，B組為模型組，C組為丹莪婦康煎膏組，D組為祛瘀解毒消癥湯低劑量組，E組為祛瘀解毒消癥湯中劑量組，F(xiàn)組為祛瘀解毒消癥湯高劑量組。

1.2.2 給藥方法：每日清晨對大鼠稱重后，采取同一時間灌胃給藥，具體給藥方法如下。

A組：生理鹽水灌胃，10mL／kg·d，連續(xù)28d；B組：生理鹽水灌胃，10mL／kg·d，連續(xù)28d；C組：丹莪婦康煎膏溶液，2g／kg·d，連續(xù)28d；D組：祛瘀解毒消癥湯10g／kg·d，連續(xù)28d；E組：祛瘀解毒消癥湯20g／kg·d，連續(xù)28d；F組：祛瘀解毒消癥湯40g／kg·d，連續(xù)28d。

1.2.3 實驗觀測指標(biāo)及檢測方法：1.2.3.1 大體觀察大鼠異位內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化：肉眼觀察模型組及藥物干預(yù)后各組大鼠異位內(nèi)膜液體積聚、血管形成及與盆腔腹膜、大網(wǎng)膜粘連等情況。

1.2.3.2 腹腔液的采集：末次給藥后，禁食不禁水12h，10%水合氯醛腹腔麻醉后，注入生理鹽水5mL／只，取腹腔液2mL，2000rpm，10min離心，取上清液－20℃凍存。

1.2.3.3 IL－6、IL－8水平測定：用酶聯(lián)免疫測定法（ELISA法）檢測腹腔液IL－6、IL－8含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書所示方法進行實驗操作。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，對數(shù)據(jù)進行分析處理。各組數(shù)據(jù)均用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）”表示，采用t檢驗，P＞0.05表示無統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05表示有顯著性差異，P＜0.01表示有非常顯著性差異。

2 實驗結(jié)果 2.1 肉眼觀察大鼠異位內(nèi)膜形態(tài)學(xué)變化模型組：種植在腹壁上的子宮內(nèi)膜呈透明的囊泡形狀，可見液體積聚，與盆腔腹膜、大網(wǎng)膜廣泛粘連，異位內(nèi)膜表面有血管形成。

祛瘀解毒消癥湯低劑量組：囊泡樣的異位內(nèi)膜較模型組有所縮小，與周圍組織粘連明顯，囊內(nèi)可見液體積聚。

祛瘀解毒消癥湯中劑量組：異位內(nèi)膜囊泡縮小的程度較低劑量組明顯，與周圍組織粘連較低劑量組減輕，但囊內(nèi)仍有少量的無色透明液體。

祛瘀解毒消癥湯高劑量組：異位內(nèi)膜囊泡較模型組明顯縮小，甚至消失，僅呈痕跡，個別異位內(nèi)膜與周圍組織有少量粘連，囊內(nèi)未見液體。

丹莪婦康煎膏組：異位內(nèi)膜縮小的程度與祛瘀解毒消癥湯中劑量組大體相似，但與周圍組織粘連較為明顯。

2.2 各組大鼠腹腔液IL－6水平的比較 見表1。

表1 腹腔液IL－6水平的比較（）

表1 腹腔液IL－6水平的比較（）

注：與模型組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01；與丹莪婦康煎膏組比較，◇P＜0.05。

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由上表可見，空白組大鼠腹腔液中IL－6含量的低表達(dá)，與模型組比較有非常顯著性差異（P＜0.01）；祛瘀解毒消癥湯高劑量組與模型組比較有非常顯著性差異（P＜0.01）；祛瘀解毒消癥湯低、中劑量組及丹莪婦康煎膏組，與模型組比較均有顯著性差異（P＜0.05）；祛瘀解毒消癥湯各劑量組與丹莪婦康煎膏組比較均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 各組大鼠腹腔液IL－8水平的比較 見表2

表2 腹腔液IL－8水平的比較（）

表2 腹腔液IL－8水平的比較（）

注：與模型組比較，▲P＜0.01；與丹莪婦康煎膏組比較，□P＜0.01。

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由上表可見，空白組腹腔液中IL－8水平的低表達(dá)，與模型組比較有非常顯著性差異（P＜0.01）；祛瘀解毒消癥湯各劑量組及丹莪婦康煎膏組IL－8均低表達(dá)，與模型組比較均有非常顯著性差異（P＜0.01）；祛瘀解毒消癥湯各劑量組與丹莪婦康煎膏組比較均無顯著性差異（P＞0.05）。

3 討 論 3.1 祛瘀解毒消癥湯對異位內(nèi)膜組織形態(tài)學(xué)的影響 本實驗利用大鼠建立EMT模型，予中藥祛瘀解毒消癥湯干預(yù)后，用肉眼大致觀察到各試驗組大鼠異位內(nèi)膜體積較模型組明顯縮小，與周圍組織粘連的程度有所減輕。初步顯示祛瘀解毒消癥湯有抑制異位內(nèi)膜生長和炎癥反應(yīng)、阻止新生血管的作用。

3.2 祛瘀解毒消癥湯對EMT大鼠腹腔液IL－6、IL－8水平的影響 自從1860年VonRokitansky等首先描述EMT至今，其確切的病因及發(fā)病機制尚不完全明了，但普遍認(rèn)為是遺傳、免疫、內(nèi)分泌等多種因素綜合作用的結(jié)果。而免疫因素在EMT的發(fā)生、發(fā)展中的作用機理，則是目前最為引人注目的研究熱點。國內(nèi)外研究已經(jīng)證實，細(xì)胞因子參與改變腹腔環(huán)境的免疫動態(tài)平衡，在本病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。細(xì)胞因子種類繁多，而許多研究表明［4－5］，由單核和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL－1、IL－2、IL－6、IL－8均屬于促炎細(xì)胞因子，參與細(xì)胞免疫反應(yīng)。近年研究發(fā)現(xiàn)，IL－6、IL－8與 EMT關(guān)系尤為密切［6］。IL－6是一種糖蛋白，其作為一種最常見的前炎癥介質(zhì)，具有非常廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。腹腔液中IL－6含量的增多，使得腹腔液中巨噬細(xì)胞和炎癥細(xì)胞被介導(dǎo)吸引活化，從而發(fā)生炎癥及免疫反應(yīng)，導(dǎo)致盆腔粘連及免疫異常，加速了EMT的形成和發(fā)展。此外，高水平的IL－6還能促進B淋巴細(xì)胞終末分化為漿細(xì)胞，血中IgG、IgM增高，相應(yīng)在體內(nèi)產(chǎn)生多種自身抗體，發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，各種免疫復(fù)合物隨即產(chǎn)生，造成患者機體免疫的損害［7］。本研究顯示，EMT模型大鼠腹腔液中細(xì)胞因子IL－6水平明顯高于空白組，證明細(xì)胞因子IL－6確實參與了子宮內(nèi)膜異位病灶的種植和生長，并且可能與疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)。而祛瘀解毒消癥湯干預(yù)后使IL－6水平降低，說明該方能調(diào)節(jié)和改善EM異常免疫狀態(tài)、抑制滲出、粘附、增生等炎癥反應(yīng)，從而抑制了模型大鼠異位內(nèi)膜的病理發(fā)展。

IL－8是一種低分子蛋白質(zhì)，來源于活化的T淋巴細(xì)胞、單核－巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等多種細(xì)胞，具有趨化中性、嗜酸性、嗜堿性粒細(xì)胞及T淋巴細(xì)胞的作用。已有研究表明［8］，IL－8在EMT病人的腹腔液和外周血中濃度明顯高于正常婦女；IL－8通過趨化炎性細(xì)胞聚集以及促使新生血管的形成，對盆腔內(nèi)炎癥、粘連產(chǎn)生及異位病灶中新生血管的生成等均有重要作用。本研究顯示，EMT模型大鼠腹腔中IL－8含量明顯高于空白組，再次證明細(xì)胞因子IL－8促進了子宮內(nèi)膜異位病灶的種植和生長，而用祛瘀解毒消癥湯干預(yù)后IL－8水平明顯降低，說明該方通過免疫調(diào)節(jié)，抑制了炎性細(xì)胞的聚集和新生血管的形成，從而阻止了模型大鼠異位內(nèi)膜的形成、發(fā)展。

3.3 祛瘀解毒消癥湯立法依據(jù)及組方特點 結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對EMT發(fā)病的基本認(rèn)識，中醫(yī)認(rèn)為本病源于“離經(jīng)之血”，屬于血瘀證范疇，故而運用活血化瘀法也就成為治療本病之根本大法［9］，而觀察用活血化瘀類中藥對于EMT患者免疫功能的影響亦屢有報道［10］。針對本病雖屬良性卻具有增生、浸潤、轉(zhuǎn)移及高復(fù)發(fā)等惡性行為的特征，新近有不少學(xué)者提出EMT的發(fā)病機理為瘀血、惡血壅阻于胞宮、胞脈，日久蘊而化毒，轉(zhuǎn)化為瘀毒，主張用祛瘀解毒法治療本?。?1］。我們在借鑒這些新的觀點的基礎(chǔ)上，結(jié)合當(dāng)代中醫(yī)新的絡(luò)病學(xué)說和濁、毒理論，認(rèn)為本病屬絡(luò)病，病位在胞宮、沖任之絡(luò)脈，瘀、濕、濁、毒互結(jié)損絡(luò)是其病理特征，“伏毒依時而發(fā)”是其發(fā)病特點。據(jù)此擬定祛瘀通絡(luò)、解毒化濁、消癥止痛治法，并擬定祛瘀解毒消癥湯。前期研究顯示，該方用于臨床不僅對EMT之痛經(jīng)、癥瘕有較好療效，還能降低其升高的血清CA125，轉(zhuǎn)陰血清抗子宮內(nèi)膜抗體［12］。本研究顯示祛瘀解毒消癥湯對模型大鼠腹腔液中異常升高的IL－6、IL－8水平具有改善作用，說明該方確能調(diào)節(jié)和改善EMT患者自身免疫功能的異常，此亦應(yīng)是其臨床有效性的作用機理之一。

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