宣肺化痰活血法對(duì)哮喘大鼠氣道重塑及TGF－β1／Smad信號(hào)通路的影響＊

林曉冰 劉小虹 許麗梅 單麗囡 陳文桂 劉 瓊 廣州中醫(yī)藥大學(xué)（廣州 510006）

氣道重塑是氣道炎癥慢性化發(fā)展的必然結(jié)果，是哮喘的一個(gè)主要特征。由于氣道長(zhǎng)期持續(xù)性的炎癥反復(fù)發(fā)作，反復(fù)修復(fù)，導(dǎo)致組織增生而發(fā)生重塑。其主要病理學(xué)改變包括基底膜（Basement Membrane，BM）增厚、膠原沉著、平滑肌細(xì)胞（Airway Smooth Muscle Cell，ASMC）增生／肥大、血管增生、粘液腺（Mucous Gland）增生等［1］。能夠?qū)е職獾栏叻磻?yīng)性（Airway Hyperresponsiveness，AHR）和氣道狹窄。一般認(rèn)為，氣道重塑在哮喘發(fā)病初期就已經(jīng)開(kāi)始，導(dǎo)致臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，增加治療的難度。目前多項(xiàng)研究提示TGF－β1可能參與哮喘氣道重塑，Smads家族是TGF－β1下游信號(hào)通路的關(guān)鍵元件，TGF－β1對(duì)氣道重塑的生物學(xué)活性可以通過(guò)其下游蛋白Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)。從祖國(guó)醫(yī)學(xué)角度來(lái)說(shuō)，痰、瘀是哮喘氣道重塑中兩個(gè)重要的病理因素。本實(shí)驗(yàn)借助哮喘氣道重塑模型，旨在探討宣肺化痰活血法對(duì)哮喘大鼠氣道重塑和TGF－β1／Smad信號(hào)通路的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 美國(guó)sigma公司進(jìn)口分裝卵清蛋白（OVA）由北京索來(lái)寶科技有限公司提供，批號(hào)A2512；TGF－β1兔多抗、Smad3兔多抗、Smad7兔多抗、免疫組化試劑盒由北京博奧森生物技術(shù)有限公司提供；EasyScript First－Strand cDNA Synthesis SuperMix 、TransStart TM Green qPCR Super－Mix由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供。魚(yú)躍402AI超聲霧化器醫(yī)用霧化器由江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司生產(chǎn)；LEICAEG1140H石蠟包埋機(jī)、LEICA RM2255全自動(dòng)輪轉(zhuǎn)切片機(jī)由德國(guó)萊卡儀器有限公司生產(chǎn)；3K30型冷凍離心機(jī)由美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)；Bio－RADiCycler實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀由美國(guó)bio－rad公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組 6周齡SPF級(jí)SD大鼠72只，體重150±20g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。適應(yīng)喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為A組（空白組）、B組（模型組）、C組（中藥高劑量組）、D組（中藥中劑量組）、E組（中藥低劑量組）、F組（地塞米松組），每組12只。

1.3 藥物制備 宣肺化痰活血中藥組成：炙麻黃、射干、地龍、北杏仁、法半夏、桔梗、細(xì)辛、桃仁等藥物組成，加水煎煮，水浴濃縮成含生藥量4g／mL。對(duì)照藥物醋酸地塞米松片由廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供，批號(hào)091004。

1.4 動(dòng)物模型復(fù)制及給藥方法 除A組，其余各組參照文獻(xiàn)在第l、8天腹腔注射lmL OVA／AL（OH）3混合液（含OVA l0mg和AI（OH）3200mg）致敏，第15天開(kāi)始應(yīng)用超聲霧化器于自制簡(jiǎn)易霧化箱中以一定濃度的OVA生理鹽水溶液霧化激發(fā)，每次20min，隔日1次，持續(xù)8周。激發(fā)濃度分別為第1、2周1%，第3、4周1.5%，第5、6周2%，第7、8周2.5%［2］。C、D、E組于第15天開(kāi)始每次霧化前0.5h按40g／kg、20g／kg、10g／kg劑量給與中藥灌胃。F組則于第15天開(kāi)始每次霧化前0.5h給予0.5mg／kg地塞米松灌胃。A組不造模，給予等量生理鹽水代替藥物。

1.5 取材及檢測(cè)方法 末次給藥后2h，用10%水合氯醛350mg／kg腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈抽血后處死，開(kāi)胸結(jié)扎，迅速取左肺中葉組織塊置于凍存管中－80℃凍存，用于RNA抽提；取出右肺，用4%多聚甲醛灌注及固定，石蠟包埋，用于HE染色及免疫組化檢查。

1.5.1 大鼠肺組織：HE染色評(píng)定肺組織病理形態(tài)學(xué)改變：將固定好的大鼠右肺組織切成0.2cm厚的組織塊，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋、切片，切片厚度為4μm，行HE染色，經(jīng)烘片、脫蠟、染色、脫水、封固后，將肺組織標(biāo)本切片在光學(xué)顯微鏡放大100倍下找到完整的細(xì)支氣管橫斷面，每張切片選取3支，采用圖像采集軟件采集圖像，評(píng)定肺組織病理形態(tài)學(xué)改變。再用圖像分析軟件測(cè)量分析，分別測(cè)算支氣管內(nèi)管壁（橫斷面）面積（WAi）、平滑?。M斷面）面積（WAm）、基底膜周長(zhǎng)（Pbm），用基底膜周長(zhǎng)對(duì)測(cè)定的內(nèi)管壁面積和平滑肌面積測(cè)量值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，得出WAi／Pbm和WAm／Pbm，此數(shù)值可以一定程度反映內(nèi)管壁和平滑肌厚度的變化。

1.5.2 免疫組化法檢測(cè)肺組織 TGF－β1、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)。將固定好的大鼠右肺組織切成0.2cm厚的組織塊，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋、切片，切片厚度為4μm，常規(guī)脫蠟、水化，進(jìn)行免疫組化染色。滴加一抗、4℃過(guò)夜，滴加生物素化二抗、鏈霉素化親和素試劑、DAB顯色、脫水、透明、封片、鏡檢。用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。每一標(biāo)本取1張切片，每張切片隨機(jī)取3個(gè)視野，用圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)各指標(biāo)PU值。

1.5.3 熒光定量PCR檢測(cè) TGF－β1、Smad3、Smad7mRNA相對(duì)表達(dá)。將50mg肺組織放入EP管中冰上剪碎，加入1mL TransZol試劑用電動(dòng)勻漿器中對(duì)組織進(jìn)行勻漿裂解，經(jīng)分離、沉淀、洗滌、溶解等步驟將提取的總RNA保存于－80℃。每例RNA溶液各取0.5μL稀釋250倍后測(cè)定提取的RNA樣品在波長(zhǎng)260nm和280nm處的OD值，各組隨機(jī)挑選6個(gè)OD值介于1.6－1.8樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。隨后將得到的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所用引物：TGF－β1上游引物序列（5’→3’）TGAGTGGCTGTCTTTTGACG，下游引物序列 （5’→ 3’）ACTTCCAACCCAGGTCCTTC，產(chǎn)物大小350bp［3］；Smad3上游引物序列（5’→3’）CAGGGCTTTGAGGCTGTCTA，下游引物序列（5’→ 3’）CTGGCATCTTCTGTGGTTTC，產(chǎn)物大小357 bp；Smad7上游引物序列（5’→3’）CAGGGCTTTGAGGCTGTCTA，下游引物序列（5’→ 3’）CTGGCATCTTCTGTGGTTTC，產(chǎn)物大小256bp［4］；Actb上游引物序列（5’→ 3’）GACCTTCAACACCCCAGC，下游引物序列（5’→3’）ACGCACGATTTCCCTCTC，產(chǎn) 物 大 小 256bp［5］。 反 應(yīng) 條 件 為：95℃預(yù)變性2min；95℃變性20sec，55℃退火25sec，72℃延伸30sec進(jìn)行40cycles。β－actin擴(kuò)增作為參照。采用qRT－PCR法計(jì)算各組中目的mRNA的相對(duì)表達(dá)量，PCR表達(dá)結(jié)果用2－▲CT進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法 數(shù)據(jù)用stata10.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用表示，當(dāng)方差齊性時(shí)各組處理效應(yīng)差異用單因素方差分析，組間兩兩比較用scheffe法；當(dāng)方差不齊時(shí)用Kruskal－Wallis檢驗(yàn)，組間兩兩比較用Nemenyi法，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果及分析

2.1 大鼠肺組織氣道學(xué)改變 B組氣道上皮細(xì)胞脫落，杯狀細(xì)胞增多氣道粘膜水腫明顯，氣道粘膜層、粘膜下層以及血管周?chē)M織可見(jiàn)有大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，以漿細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞為主。氣道管腔縮小，甚至完全閉塞，氣道腔內(nèi)可見(jiàn)大量粘液，氣管平滑肌增厚，個(gè)別肺泡出現(xiàn)融合現(xiàn)象。C、D、E、F組明顯減輕，氣道上皮不完整，氣道粘膜輕度水腫，氣道粘膜層、粘膜下層以及血管周?chē)M織可見(jiàn)有少量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，部分氣道管腔縮小，氣道腔內(nèi)可見(jiàn)少量粘液，氣管平滑肌輕度增厚（圖1）。圖像分析結(jié)果顯示，與A組相比，B組WAm／Pbm、WAi／Pbm明顯增加（P＜0.01）；與B組相比，C、D、E、F組明顯減小（P＜0.01）（表1）。

表1 肺組織形態(tài)學(xué)比較

2.2 肺組織 TGF－β1、Smadm3、Smad7蛋白表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，A組TGF－β1、Smad3在肺組織氣道周?chē)倭康年?yáng)性著色；與A組相比，B組表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01），主要表達(dá)于胞質(zhì)，主要分布于氣道上皮；與B組相比，C、D、F組表達(dá)明顯減輕（P＜0.01）。A組Smad7蛋白在肺組織氣道壁周?chē)休^多陽(yáng)性著色；與A組相比，B組表達(dá)明顯減弱（P＜0.01）；與B組相比，C、D、E、F表達(dá)明顯增強(qiáng)（P＜0.01）（表2）。

2.3 肺組織 TGF－β1、Smad3、Smad7mRNA 相對(duì)表達(dá)與B組相比，C、F組TGF－β1相對(duì)表達(dá)量都明顯下調(diào)（P＜0.01），D組也有所下調(diào)（P＜0.05），E組雖有所下調(diào)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2－a）。與B組相比，C、E 組Smad3表達(dá)明顯下調(diào)（P＜0.01），D組也有所下調(diào)（P＜0.05），F(xiàn)組雖有所下調(diào)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2－b）。與B組相比，C、D組Smad7表達(dá)有所上調(diào)（P＜0.05），E、F組雖有所上調(diào)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖2－c）?！?00

表2 大鼠肺組織TGF－β1、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)比較（PU值）（）

表2 大鼠肺組織TGF－β1、Smad3、Smad7蛋白表達(dá)比較（PU值）（）

注：與A組相比，▲P＜0.01。與B組相比，▲P＜0.01，◇P＜0.05

圖1 大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)比較（HE染色 ）

圖2 大鼠肺組織 TGF－β1、Smad3、Smad7mRNA 表達(dá)比較

3 討 論 哮喘發(fā)生時(shí)，氣道壁的各個(gè)組分都會(huì)出現(xiàn)異常改變包括上皮細(xì)胞脫落、平滑肌肥大和增生、粘膜下膠原纖維沉積導(dǎo)致的基質(zhì)成分增加、粘液腺增生肥大、新血管增生等，這些都可以導(dǎo)致氣道壁面積的增大。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，各種慢性炎癥反應(yīng)導(dǎo)致的組織增生，屬于痰、瘀范疇。哮喘氣道厚度的改變（氣道平滑肌增生、粘液腺增生、膠原沉著、基底膜增厚）屬于中醫(yī)無(wú)形之痰和血瘀相兼為病范疇。痰與瘀屬于人體常見(jiàn)的病理產(chǎn)物，常常相兼為病，互相影響。究其原因，痰瘀同屬陰津?yàn)椴〉牟煌憩F(xiàn)。祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，津血同源。津和血均源于飲食水谷精微，同屬人體的陰液。二者在生理上互相轉(zhuǎn)化，互相作用，參與體液調(diào)節(jié)，在病理上亦互相影響。故《景岳全書(shū)》云：“津凝血敗，皆化為痰”?，F(xiàn)代研究亦發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘病人急性發(fā)作期全血粘度（高、中、低切變率）、血漿粘度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)均明顯高于緩解期與對(duì)照組。哮喘緩解期血漿粘度、RAI恢復(fù)至接近正常對(duì)照組水平，但各切變率下的全血粘度仍高于正常對(duì)照組（P＜0.05）。表明支氣管哮喘病人急性發(fā)作期和緩解期存在不同程度的高粘滯血癥［6］。宣肺化痰活血中藥是在射干麻黃湯基礎(chǔ)上加減而成，前期的研究發(fā)現(xiàn)能夠改善哮喘的癥狀，能調(diào)節(jié)免疫、拮抗炎性介質(zhì)、能夠減少過(guò)敏性哮喘豚鼠電鏡下肺部膠原纖維，改善毛細(xì)血管增厚的基底膜［7－11］。該方著眼于伏藏于肺絡(luò)的痰和瘀，運(yùn)用射干、椒目降氣平喘，麻黃、細(xì)辛辛溫解表散寒，宣泄肺之郁氣，再加上半夏、桔梗等祛痰，地龍、桃仁活血通絡(luò)。諸藥合用，直達(dá)病所，達(dá)到改善氣道重塑的目的。

TGF－β家族包括數(shù)種異構(gòu)體，是細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞外基質(zhì)合成和凋亡的主要調(diào)節(jié)者之一。巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞都能夠產(chǎn)生TGF－β1。TGF－β1是目前發(fā)現(xiàn)的刺激細(xì)胞外基質(zhì)沉積活性最強(qiáng)的細(xì)胞因子?；罨腡GF－β1能使Smad2／3磷酸化，并進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控相應(yīng)的基因表達(dá)，重組細(xì)胞骨架成分，誘導(dǎo)其向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化。肌成纖維細(xì)胞具有平滑肌和纖維細(xì)胞兩種特性，能合成、分泌細(xì)胞外基質(zhì)成分，特別是膠原纖維，是細(xì)胞外基質(zhì)增厚的重要原因。研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于正常人，中重度哮喘患者TGF－β1mRNA表達(dá)增加，且其表達(dá)量和上皮下纖維化直接相關(guān)［12－13］。在哮喘患者的氣道中，平滑肌細(xì)胞分泌大量的 TGF－β1，分泌出的 TGF－β1反過(guò)來(lái)又促進(jìn)平滑肌細(xì)胞和杯狀細(xì)胞增生肥大，增加膠原和纖維連接蛋白合成，并促進(jìn)其在細(xì)胞外基質(zhì)沉積，導(dǎo)致管腔狹窄和不可逆的肺功能改變。TGF－β1能夠通過(guò)減少M(fèi)MPs的表達(dá)、促進(jìn)PAI－1和TIMPs的合成來(lái)減少ECM的降解。還可以通過(guò)刺激ECM受體的合成，使整合素的合成增加而影響ECM的產(chǎn)生。

Smad蛋白為T(mén)GF－β1信號(hào)通路的下游信號(hào)關(guān)鍵傳導(dǎo)分子，可將信號(hào)從胞膜直接傳至胞核，介導(dǎo)TGF－β1胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)。Smad3是R－Smad蛋白家族成員，具有通路特異性；Smad7是ISmads蛋白家族成員，能抑制R－Smad的信號(hào)傳遞。Smad2和Smad3直接被TGF－βRI磷酸化，使得構(gòu)象發(fā)生改變從而從受體復(fù)合物中釋放出來(lái)。Smad7能通過(guò)與絲氨酸／蘇氨酸激酶受體相 關(guān) 蛋 白 （serine－thre－onine kinase receptor－associated protein，STRAP）作用，與R Smads競(jìng)爭(zhēng)TβRI，啟動(dòng)抑制功能。研究發(fā)現(xiàn)，在健康肺組織中幾乎不能檢測(cè)到Smad3表達(dá)，而在哮喘小鼠組Smad3表達(dá)水平顯著上調(diào)［14］。Smad7與活化的TGF－β1I型受體結(jié)合就會(huì)阻止Smad2與I型受體結(jié)合和磷酸化，從而抑制TGF－β1信號(hào)傳導(dǎo)，在哮喘機(jī)體起到拮抗氣道重塑的作用［15］。

本研究通過(guò)免疫組化法和qRT－PCR方法檢測(cè)肺組織TGF－β1、Smad3、Smad7的蛋白和 mRNA 的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，蛋白和基因表達(dá)兩個(gè)側(cè)面都顯示B組大鼠肺組織TGF－β1、受體調(diào)節(jié)型蛋白Smad3表達(dá)水平均較A組大鼠明顯升高（P＜0.01），抑制轉(zhuǎn)錄型蛋白Smad7的蛋白表達(dá)有所減少（但P＞0.05），說(shuō)明哮喘氣道重塑大鼠肺組織中TGF－β1／Smad信號(hào)通路處于激活狀態(tài)，從而使膠原纖維合成增加，導(dǎo)致ECM進(jìn)行性積聚。哮喘Smad7mRNA水平應(yīng)該表達(dá)明顯減少，此次雖然沒(méi)有能夠發(fā)現(xiàn)Smad7減少的表達(dá)與A組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但因?yàn)槎嘟M資料的非參數(shù)檢驗(yàn)的兩兩比較方法比較保守，因此，B組中Smad7mRNA水平升高仍然值得關(guān)注。

與B組相比，C、D組TGF－β1、Smad3的蛋白和 mRNA的表達(dá)都明顯減少（p＜0.05），C、D組Smad7的蛋白和mRNA的表達(dá)明顯增加（p＜0.05），表明宣肺化痰活血法對(duì) TGF－β1／Smad信號(hào)通路有抑制作用，其作用靶點(diǎn)可能是通過(guò)直接下調(diào)TGF－β1、Smad3的表達(dá)，同時(shí)也可能通過(guò)大量表達(dá)Smad7，從而與RSmads競(jìng)爭(zhēng)TβR1，減少Smad3／Smad4異聚體的形成，抑制對(duì)TGF－β1在胞漿內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減少膠原纖維沉著和氣道上皮纖維化，從而改善氣道重塑。

綜上所述，宣肺化痰活血法可改善哮喘大鼠氣道重塑，其機(jī)制可能與通過(guò)調(diào)節(jié)TGF－β1／Smad信號(hào)通路有關(guān)。

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