薏苡仁油脂質(zhì)體包封率測(cè)定方法研究

雷筱芬，劉玉珍（江西工業(yè)貿(mào)易職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江西南昌330038）

薏苡仁（Coix lachryma-jobi L.var mayuen（Roman）stapf）是禾本科（Gramineae）薏苡屬（Coix L.）草本植物薏苡的干燥成熟種仁，是藥膳兩用原料，具有健脾、補(bǔ)肺、清熱、利濕的功效，《本草綱目》稱其為上品養(yǎng)心藥[1]。薏苡仁中含有約2%～7%左右的薏苡仁油、薏苡仁酯、植物固醇等多種成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，薏苡仁油具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒等方面的活性[2]。由于薏苡仁油中不飽和脂肪酸含量超過80%，易氧化，不但降低了其營養(yǎng)效價(jià)，而且極易導(dǎo)致食品安全問題。將薏苡仁油制備為脂質(zhì)體，不但提高了其穩(wěn)定性，而且可以實(shí)現(xiàn)靶向輸送[3]。包封率一直是脂質(zhì)體研究的熱點(diǎn)，測(cè)定方法主要分為兩種：一種是直接測(cè)定，另一種是將游離藥物與脂質(zhì)體分離后測(cè)定。常用的分離方法有透析法、柱層析法，離心法。由于包封率的測(cè)定次數(shù)十分頻繁，柱層析所需時(shí)間較長，操作過于繁瑣，且凝膠柱不適用于油脂的層析；冷凍超速離心只適于分離少量的小脂質(zhì)體（約10nm以下）[4]。測(cè)定方法也不盡相同，有紫外分析、氣相分析、高效液相分析等[5-7]。本實(shí)驗(yàn)擬采用透析法研究和測(cè)定薏苡仁油脂質(zhì)體的包封率。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆卵磷脂 上海源聚生物科技有限公司；膽固醇，BR級(jí) 上海政翔化學(xué)試劑研究所；薏苡仁油 廣州合誠三先生物科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（PBS），pH6.8 按《中華人民共和國藥典》2005年版標(biāo)準(zhǔn)配制；其余試劑 均為國產(chǎn)分析純。

JB-3定時(shí)恒溫磁力攪拌器 上海雷磁新涇儀器有限公司；JYT-10天平 上海醫(yī)用激光儀器廠；R205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技儀器廠；紫外可見光分光光度計(jì) 日本島津公司；紫外可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；透析袋14000 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；超聲波發(fā)生器 上海必能信超聲有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 薏苡仁油含量測(cè)定方法的建立 采用薏苡仁油、卵磷脂、膽固醇的紫外掃描法分析[8]。

分別稱取0.2g薏苡仁油、0.2g卵磷脂、0.2g膽固醇，用石油醚溶解并轉(zhuǎn)移至100mL容量瓶中，定容，然后掃描其最大吸收波長。

1.2.2 薏苡仁油脂質(zhì)體的制備[9]采用薄膜-超聲法制備薏苡仁油脂質(zhì)體。精密稱取一定比例的卵磷脂、膽固醇、薏苡仁油于小燒瓶內(nèi)，加入適量無水乙醚，搖動(dòng)使其完全溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去乙醚，形成均勻類脂薄膜；向小燒瓶中加入pH6.8的磷酸鹽緩沖液，超聲處理（時(shí)間30min，功率90W，90%）即得薏苡仁油脂質(zhì)體混懸液，置冰箱4℃保存。空白脂質(zhì)體的制備則稱取等量脂質(zhì)溶于乙醇，其余步驟同薏苡仁油脂質(zhì)體的制備。

1.2.3 薏苡仁油脂質(zhì)體破壁方法與破壁后混合物的分離純化

1.2.3.1 破乳劑種類的篩選 以乙醇、甲醇和Triton X-100（聚乙二醇辛基苯基醚）為破乳劑進(jìn)行考察。精密移取脂質(zhì)體混懸液1mL，置于25mL容量瓶中，加入其中一種破乳劑5mL，混勻，超聲破乳30min，加入50mL石油醚溶解，測(cè)定其吸光度，并分別測(cè)定同一批次空白脂質(zhì)體的吸光度作為各自空白對(duì)照。

1.2.3.2 超聲破壁時(shí)間考察 采用超聲破壁并結(jié)合破乳劑的方法進(jìn)行脂質(zhì)體破壁，測(cè)定其包封率?？疾觳煌晻r(shí)間（10、20、30、40min）對(duì)脂質(zhì)體的破壁效果。

1.2.3.3 薏苡仁油、卵磷脂、膽固醇的溶解特性及薏苡仁油的分離 考察薏苡仁油、卵磷脂、膽固醇在石油醚、冷乙醇及熱乙醇中的溶解特性；用溶劑分離法分離薏苡仁油。

1.2.4 薏苡仁油石油醚標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及其脂質(zhì)體包封率的測(cè)定[10]

1.2.4.1 采用日本島津的紫外可見分光光度計(jì) 掃描薏苡仁油石油醚溶液的最大吸收波長；配制不同濃度的薏苡仁油標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別在最大吸收波長下測(cè)定其吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

本實(shí)驗(yàn)采用透析法除去未包封的薏苡仁油，加入破乳劑結(jié)合超聲法使包封薏苡仁油游離出來，并測(cè)定其吸光度，進(jìn)而換算出質(zhì)量。包封率EE（%）計(jì)算公式如下：

式中，Wlip為脂質(zhì)體中包封薏苡仁油的量；Wtot為脂質(zhì)體混懸液中薏苡仁油總量。

1.2.4.2 透析時(shí)間的確定實(shí)驗(yàn) 分別量取20mL新制備的脂質(zhì)體混懸液裝入6個(gè)透析袋中，扎口后放入燒杯中以磷酸鹽緩沖液回流。分別于10、12、14、16、18、20h取出透析后的脂質(zhì)體，測(cè)定其包封率。

1.2.4.3 分離法精密度考察 對(duì)同一批薏苡仁油脂質(zhì)體分別3次取樣透析，平行分離，分離后將袋中溶液倒入100mL容量瓶，加入破乳劑，結(jié)合超聲破壁（30min，功率90W，80%[9]），加入石油醚提取，將混合溶液進(jìn)行離心（3000r/min，3min），取10mL上清液于25mL容量瓶中，用有機(jī)溶劑定容，測(cè)定其吸光度A，計(jì)算精密度。

1.2.4.4 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取薏苡仁油適量，加入空白脂質(zhì)體中，分離后收集薏苡仁油溶解液10mL置于25mL容量瓶中，定容，測(cè)定其吸光度A，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 薏苡仁油、卵磷脂和膽固醇的紫外掃描和紫外掃描分析方法可行性

紫外掃描等分析方法測(cè)定各類脂質(zhì)體包封率已有報(bào)道；仵文英、徐云龍等[8，10-11]利用空白脂質(zhì)體和脂質(zhì)體芯材的最大吸收波長不同，通過紫外分光光度法測(cè)定頭孢他啶和茶樹油脂質(zhì)體包封率；晏亦林等[12]采用Sephadex G-50凝膠柱分離脂質(zhì)體和游離磷酸川芎嗪，紫外分光光度法測(cè)定磷酸川芎嗪納米脂質(zhì)體包封率和滲漏率。紫外法測(cè)定薏苡仁油包封率的原理是通過測(cè)定薏苡仁油溶液對(duì)檢測(cè)波長入射光的吸光度，由朗伯-比爾定律求得薏苡仁油的含量，對(duì)脂質(zhì)體破壁前后薏苡仁油進(jìn)行定量比較。

薏苡仁油、卵磷脂和膽固醇的掃描結(jié)果見圖1。

圖1 光譜掃描曲線Fig.1 Ultraviolet scanning spectrum

由圖1可知，在220～330nm波長范圍內(nèi)，薏苡仁油的吸收峰較大，而卵磷脂的吸光度在220～300nm范圍內(nèi)也較大，膽固醇在210nm附近也有一較小的吸收峰，脂材對(duì)薏苡仁油的紫外測(cè)定存在干擾。晏亦林等[12]發(fā)現(xiàn)脂材對(duì)磷酸川芎嗪的紫外測(cè)定存在干擾時(shí)，采用測(cè)定游離磷酸川芎嗪的量來間接計(jì)算脂質(zhì)體的包封率。由于本研究采用透析法分離游離薏苡仁油，需不時(shí)更換透析液，不適宜測(cè)定游離薏苡仁油的含量，故直接測(cè)定包封薏苡仁油的量。要準(zhǔn)確定量薏苡仁油的量，須從薏苡仁油脂質(zhì)體破壁后的混合物中將磷脂和膽固醇完全除去，然后在235nm處測(cè)定吸光度。

2.2 破乳劑種類的選擇

包封率的測(cè)定須用破乳劑破壞脂質(zhì)體包囊雙層膜，破乳效果完全才能使芯材完全從包囊的脂質(zhì)體中轉(zhuǎn)移到測(cè)定溶媒中，選擇破乳劑種類在包封率測(cè)定中至關(guān)重要。

乙醇、甲醇和Triton X-100對(duì)薏苡仁油脂質(zhì)體的破乳效果如表1所示。

表1 不同種類破乳劑破乳后吸光度Table 1 Absorbance of coix seed oil with different demulsifies

破乳后從表觀現(xiàn)象看，乙醇、甲醇、Triton X-100的加入都能將脂質(zhì)體壁材卵磷脂溶解，乳液包埋形成的脂質(zhì)體界面消失，破乳效果良好。從本質(zhì)來說，破乳效果越好，包封薏苡仁油轉(zhuǎn)移到測(cè)定溶媒中越多，吸光值越大。由表1可知，3種破乳劑破乳效果為：甲醇＞Triton X-100＞乙醇，由于加入的總薏苡仁油量相同，比較破乳后所得薏苡仁油量，可以看出3種破乳劑的破乳效果相差不是很大?？紤]溶劑毒性與成本，實(shí)驗(yàn)宜選用乙醇為破乳劑。

2.3 超聲破壁時(shí)間的考察

不同超聲破壁時(shí)間的吸光度見表2。

表2 不同超聲破壁時(shí)間的吸光度Table 2 Absorbance of coix seed oil with different ultrasonic time

脂質(zhì)體包封被破壁效果越好，乳化破壞程度也越高，因此吸光值越大。由表2可知，超聲破壁時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響較大，當(dāng)破壁時(shí)間超過30min時(shí)，能夠完全將脂質(zhì)體中的薏苡仁油釋放到石油醚中；30min超聲處理可以達(dá)到脂質(zhì)體破壁最大化，達(dá)到分離薏苡仁油的最佳效果。

2.4 薏苡仁油、卵磷脂、膽固醇的溶解特性及薏苡仁油的分離

薏苡仁油、卵磷脂、膽固醇在石油醚、冷乙醇及熱乙醇中的溶解性效果見表3。

表3 薏苡仁油、卵磷脂、膽固醇的溶解性Table 3 Solubility of coix seed oil，lecithin and cholesterol

由表3可知，薏苡仁油易溶于石油醚，微溶于熱乙醇，不溶于冷乙醇；而卵磷脂和膽固醇都易溶于熱乙醇；乙醇與水可以任意比例互溶，而石油醚不溶于水[13]。當(dāng)破乳脂質(zhì)體溶解在石油醚和冷乙醇水混合體系，靜置后會(huì)分為兩層，薏苡仁油溶解于上層石油醚體系，磷脂和膽固醇溶解于下層乙醇與水層。該方法可以將破乳脂質(zhì)體的磷脂、膽固醇和薏苡仁油分開，達(dá)到高效分離薏苡仁油的目的。

2.5 包封率的測(cè)定

根據(jù)紫外掃描圖譜選取235nm為檢測(cè)波長，在該條件下測(cè)定不同濃度薏苡仁油標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖2所示。薏苡仁油在0～13μg/mL范圍內(nèi)，吸光度與濃度成良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為：A=715.2C+0.0071，相關(guān)系數(shù)R2=0.9981。

透析時(shí)間對(duì)脂質(zhì)體包封率的影響見圖3。透析16h以前的脂質(zhì)體中游離薏苡仁油不能完全除去，導(dǎo)致所測(cè)的包封率偏高；透析時(shí)間16h時(shí)，游離薏苡仁油幾乎完全除去；故選取透析時(shí)間為16h。

圖2 薏苡仁油石油醚標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of coix seed oil in petroleum ether

圖3 透析時(shí)間對(duì)包封率的影響Fig.3 Effect of dialysis time on the entrapment efficiency

2.6 分離法精密度考察

精密度考察實(shí)驗(yàn)三次測(cè)得吸光度分別為：0.338、0.347、0.350，平均吸光度為0.345，RSD為1.81%，證明脂質(zhì)體中包封薏苡仁油的破壁分離精密度較好，具有實(shí)際應(yīng)用的可行性。

2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

加樣回收率結(jié)果如表5所示，平均回收率98.68%，RSD=1.98%，表明該法可行。

表4 加樣回收率測(cè)定結(jié)果Table 4 Method recovery of coix seed oil

3 結(jié)論

采用透析法分離包封與未包封薏苡仁油，對(duì)薏苡仁油脂質(zhì)體有良好的分離效果，脂質(zhì)體與游離薏苡仁油分離完全，分離法精密度RSD=1.81%，加樣回收率98.68%，RSD=1.98%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，建立的測(cè)定方法操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于薏苡仁油脂質(zhì)體包封率的測(cè)定。

[1]國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1993：329.

[2]江蘇新醫(yī)學(xué)院編.中藥大辭典（下冊(cè)）[M].上海：上海人民出版社，1997：2645.

[3]鄧英杰，顧學(xué)裘.新型藥物載體-脂質(zhì)體的作用特點(diǎn)及應(yīng)用[J].中國藥學(xué)雜志，1990，25（4）：195.

[4]陸彬.藥物新劑型與新技術(shù)[M].第二版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：134-138.

[5]夏書芹，許時(shí)嬰.吐溫80增溶-紫外分光光度法測(cè)定輔酶Q10脂質(zhì)體的載量及包封率[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（10）：131-135.

[6]Malgorzata J R，Latowski D，Strzalka K.Incorporation of plastoquinone and ubiquinone into liposome membranes studied by HPLC analysis：The effect of side chain length and redox state of quinone[J].Chemistry and Physics of Lipids，2001，110（1）：85-94.

[7]Xiangrong Song，Yu Zhao，Shixiang Hou，et al.Dual agents loaded PLGA nanoparticles：Systematic studyof particle size and drug entrapment efficiency[J].European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics，2008，69：445-453.

[8]仵文英，席枝俠，薛紅安，等.紫外分光光度法測(cè)定黃芩苷脂質(zhì)體的包封率和滲漏率[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2005，24（7）：624-626.

[9]李亮，熊華，黃軍，等.薏苡仁油脂質(zhì)體制備工藝研究[J].糧食與油脂，2008，33（12）：162-165.

[10]羅云敬，沈含熙，杜鳴，等.紫外分光光度法測(cè)定頭孢他啶脂質(zhì)體的包封率和泄漏率[J].中國抗生素雜志，1998，23（3）：2032-2041.

[11]徐云龍，楊欣欣，徐盛.茶樹油脂質(zhì)體的制備及質(zhì)量評(píng)價(jià)[J].華西藥學(xué)雜志，2006，21（2）：139-142.

[12]晏亦林，周莉玲，林紹瑜，等.磷酸川芎嗪納米脂質(zhì)體包封率的測(cè)定[J].藥物導(dǎo)報(bào)，2008，27（7）：824-825.

[13]程能林.溶劑手冊(cè)[M].第二版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，1995：106-285.