血漿中莪術(shù)醇和吉馬酮的測(cè)定及其大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究

潘 瑜， 張 園， 向 錚 ， 嚴(yán)鵬程， 黃可新

(1.溫州醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，浙江溫州 325035;2.溫州醫(yī)學(xué)院分析測(cè)試中心，浙江溫州 325035)

莪術(shù)是姜科植物蓬莪術(shù)Curcuma phaeocaulisVal、廣西莪術(shù)Curcuma kwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang或溫郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling，習(xí)稱溫莪術(shù)的干燥根莖［1］，具有行氣破血，消積止痛之功效，是一種活血化瘀類的傳統(tǒng)中藥。莪術(shù)的主要成分為揮發(fā)油和姜黃素，揮發(fā)油的主要成分是莪術(shù)醇、莪術(shù)二酮、吉馬酮等，其中莪術(shù)醇具有抗肝纖維化、抗氧化等生物活性［2］，也是發(fā)展前景良好的抗腫瘤藥物［3］。吉馬酮對(duì)D-半乳糖胺/脂多糖誘導(dǎo)的肝疾病具有保護(hù)作用［4］，是抗腫瘤的活性成分，對(duì)癌細(xì)胞有一定的抑制作用［5］。許多傳統(tǒng)復(fù)方制劑如木香分氣丸、止痛化癥膠囊、保婦康栓、痛經(jīng)寶顆粒［6］等都包含莪術(shù);莪術(shù)也作為單味藥如莪術(shù)油等用于治療消積化滯、散結(jié)止痛、瘀血經(jīng)閉［6］。煎劑是中醫(yī)方劑用藥的基本形式，目前鮮有其煎劑的藥代動(dòng)力學(xué)研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立了大鼠口服莪術(shù)水提物血漿中莪術(shù)醇和吉馬酮 (如圖1)的高效液相色譜法分析方法，此方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，適用于莪術(shù)醇和吉馬酮的血藥濃度測(cè)定和藥動(dòng)學(xué)研究。

圖1 莪術(shù)醇 (A)和吉馬酮 (B)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Structures of curcumenol and germacrone

1 材料與方法

1.1 儀器 Agilent 1100高效液相色譜系統(tǒng) (美國(guó)Agilent公司);XW-80A型漩渦混合器 (上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠);Sartorius BS224S電子天平 (賽多利斯科學(xué)儀器 (北京)有限公司);TU-1901型雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);FD-1C型冷凍干燥機(jī)(北京德天佑科技發(fā)展有限公司)。

1.2 藥品與試劑 莪術(shù)醇標(biāo)準(zhǔn)品 (中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào):100185-200506)，吉馬酮標(biāo)準(zhǔn)品(中國(guó)藥品生物制品鑒定所，批號(hào):111665-200902)，甲醇、乙腈 (美國(guó)Spectrum公司，色譜純)，超純水 (Milli-Q系統(tǒng))，莪術(shù) (溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院中藥房提供)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠5只，雄性，6～7周齡，體質(zhì)量 (250±20)g，溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 給藥方案 莪術(shù)藥材經(jīng)水煎煮1 h后經(jīng)冷凍干燥成浸膏后4℃保存，給藥時(shí)用超純水配制成質(zhì)量濃度為0.15 g/mL(浸膏中含莪術(shù)醇的量為0.276 mg/g，吉馬酮為0.164 mg/g)。SD大鼠 5只，禁食不禁水12 h，按照1 mL/100 g的劑量，灌胃給予莪術(shù)提取液。于灌胃后 0，0.083，0.167，0.333，0.5，1，2，4，8，12，24 h 尾靜脈取血每次約0.5 ml，置于肝素化管中，4℃靜置5 min，13 000 r/min離心10 min，分離血漿保存在-20℃。

1.5 色譜條件 Hypersil ODS色譜柱(4.6 mm×250mm，5 μm，大連依利特分析儀器有限公司)，流動(dòng)相為乙腈-水 (0～20 min:63% ～66%)，體積流量為1.0 mL/min，柱溫25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量20 μL。

1.6 血漿樣品處理 取血漿室溫下融凍，各精密吸取200 μL于離心管中，精密加入300 μL乙腈，渦旋1 min，離心 (13 000 r/min)15 min，取上清液，進(jìn)樣20 μL作HPLC分析。

1.7 數(shù)據(jù)處理 利用藥理學(xué)計(jì)算軟件DAS 2.1.1版計(jì)算主要藥代學(xué)參數(shù)(t1/2、AUC等)。

2 結(jié)果

2.1 色譜行為 在1.5項(xiàng)色譜條件下，空白血漿、含藥血漿和含標(biāo)準(zhǔn)品血漿的色譜如圖2所示，各組分色譜峰充分分離，不受內(nèi)源性雜質(zhì)峰干擾，莪術(shù)醇的保留時(shí)間為10.095 min，吉馬酮的保留時(shí)間為13.595 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取莪術(shù)醇對(duì)照品和吉馬酮對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含莪術(shù)醇200 μg，吉馬酮200 μg的對(duì)照品貯備液。將上述配制好的莪術(shù)醇、吉馬酮對(duì)照品貯備液用甲醇依次稀釋成質(zhì)量濃度分別為50，25，10，5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05 μg/mL。取大鼠空白血漿200 μL，精密加入上述配制好的莪術(shù)醇、吉馬酮對(duì)照品稀釋液，得到一系列不同質(zhì)量濃度分別含莪術(shù)醇 5，2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05，0.025 μg/mL和 含 吉馬 酮 2.5，1，0.5，0.25，0.1，0.05，0.025 μg/mL。按照1.6項(xiàng)下進(jìn)行操作。以血漿中待測(cè)物對(duì)照品質(zhì)量濃度 (C)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積 (Y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸計(jì)算，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，如表1。

圖2 空白血漿 (A)、含標(biāo)準(zhǔn)品血漿 (B)及含藥血漿 (C)的HPLC色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank plasma(A)，blank plasma spiked with curcumenol and germacrone(B)and plasma sample(C)

表1 莪術(shù)醇和吉馬酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和定量限Tab.1 Standard curves，correlation coefficients，linear ranges and LOQs of curcumenol and germacrone

2.3 回收率和精密度 取空白血漿200 μL，精密加入已配制好的莪術(shù)醇和吉馬酮對(duì)照品溶液，配成高、中、低質(zhì)量濃度，按照1.6項(xiàng)下進(jìn)行操作，每一質(zhì)量濃度進(jìn)樣5次分析，計(jì)算求得其在大鼠血漿中的方法回收率、提取回收率，在1 d內(nèi)不同時(shí)間進(jìn)樣，測(cè)得3種質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)血漿的日內(nèi)變異系數(shù)，相同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)血漿在5 d內(nèi)的日間變異系數(shù)，結(jié)果如表2所示。

表2 莪術(shù)醇和吉馬酮在大鼠血漿中的回收率和精密度(±s，n=5)Tab.2 Recoveries and precisions of curcumenol and germacrone in rat plasma(±s，n=5)

表2 莪術(shù)醇和吉馬酮在大鼠血漿中的回收率和精密度(±s，n=5)Tab.2 Recoveries and precisions of curcumenol and germacrone in rat plasma(±s，n=5)

化合物 質(zhì)量濃度/(μg·mL-1) 方法回收率/% 提取回收率/% 日內(nèi)RSD/% 日間RSD/%5 95.8±1.08 95.9±2.46 1.43 1.68莪術(shù)醇 2.5 95.2±1.62 104.1±4.17 1.64 2.37 0.25 102.3±0.35 100.3±0.35 2.46 2.75 2.5 105.1±0.74 104.8±0.37 2.08 2.46吉馬酮0.25 103.6±0.44 96.3±1.05 3.05 3.12

2.4 穩(wěn)定性考察 制備高、中、低(含莪術(shù)醇5，2.5，0.25 μg/mL)的質(zhì)控樣品，分別室溫放置12 h，反復(fù)凍融2次，-20℃凍存1 d，1周后測(cè)定。結(jié)果樣品在室溫放置12 h，凍融前，凍融1次，凍融2次，冷凍1 d和7 d后，測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，穩(wěn)定性良好。

2.5 莪術(shù)醇和吉馬酮在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究 血漿按照1.6項(xiàng)下進(jìn)行操作，測(cè)得大鼠灌胃服用莪術(shù)水提液后的平均血藥濃度—時(shí)間曲線，結(jié)果見(jiàn)圖3。

利用藥理學(xué)計(jì)算軟件 DAS 2.1.1版處理，自動(dòng)推算、模型、權(quán)重選擇，擬合的血藥濃度—時(shí)間曲線符合二室模型，有關(guān)藥動(dòng)學(xué)參數(shù) (t1/2、AUC等)見(jiàn)表3。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了RP-HPLC測(cè)定莪術(shù)醇和吉馬酮

圖3 莪術(shù)提取物大鼠灌胃給藥后莪術(shù)醇和吉馬酮的血藥濃度—時(shí)間曲線Fig.3 Mean plasma concentration-time curves of curcumenol and germacrone after intragastric administration of zedoary turmeric aqueous extract

表3 莪術(shù)醇和吉馬酮的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tab.3 Pharmacokinetic parameters of curcumenol and germacrone

在大鼠體內(nèi)血藥濃度的方法，并進(jìn)行了藥代動(dòng)力學(xué)研究。根據(jù)紫外分光光度計(jì)測(cè)定，莪術(shù)醇的最大紫外吸收波長(zhǎng)是207 nm，吉馬酮的最大紫外吸收波長(zhǎng)是217 nm，二者在210 nm處均有較大吸收，故選擇此波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

中藥所含成分的復(fù)雜性、有效成分的不確定性以及成分微量等使分離測(cè)定的難度增加，血漿樣品處理的過(guò)程至關(guān)重要。莪術(shù)醇和吉馬酮為莪術(shù)中主要的活性成分，具有一定揮發(fā)性，其在氮?dú)鈸]干的過(guò)程中易損失導(dǎo)致定量結(jié)果不準(zhǔn)確，因此實(shí)驗(yàn)選用乙腈沉淀蛋白法代替乙酸乙酯萃取的方法處理血漿。

高效液相法的藥物體內(nèi)分析，通常因提取方法對(duì)含量準(zhǔn)確測(cè)定影響較大而采用內(nèi)標(biāo)法，但內(nèi)標(biāo)法測(cè)定操作過(guò)程較繁瑣，成本高。本實(shí)驗(yàn)因在210 nm處內(nèi)源性物質(zhì)干擾較多，難以在較短的保留時(shí)間內(nèi)選擇合適的內(nèi)標(biāo)物。此外，本實(shí)驗(yàn)血樣處理操作簡(jiǎn)單易行，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，精密度較好，回收率高，故選擇外標(biāo)法進(jìn)行含量測(cè)定。

藥代動(dòng)力學(xué)處理結(jié)果表明，大鼠灌胃服用莪術(shù)水提液后的藥代動(dòng)力學(xué)過(guò)程用二室模型描述較為合理。莪術(shù)醇在胃腸道能迅速吸收(Kα=6.625 h-1)，灌服莪術(shù)提取液后莪術(shù)醇的血藥濃度在0.333 h達(dá)到峰值，說(shuō)明莪術(shù)醇進(jìn)入大鼠體循環(huán)后迅速分布(α=5.364 h-1)，發(fā)揮藥效迅速。血漿中莪術(shù)醇的消除速率常數(shù)β為0.121 h-1，血中的t1/2(α)=0.129 h，t1/2(β)=5.745 h，t1/2(β)＞t1/2(α)，可知大鼠灌服莪術(shù)提取液后莪術(shù)醇在體內(nèi)消除也迅速，屬于吸收快、消除快的代謝過(guò)程。吉馬酮在胃腸道內(nèi)吸收稍慢 (Kα=0.184 h-1)，灌服莪術(shù)提取液后吉馬酮的血藥濃度在1 h達(dá)峰，表明吉馬酮進(jìn)入大鼠體循環(huán)后分布慢于莪術(shù)醇 (α=0.051 h-1)，血漿中吉馬酮的消除速率常數(shù)β為0.032 h-1，血中的t1/2(α)=13.633 h，t1/2(β)=22.002 h，提示大鼠灌服莪術(shù)提取液后吉馬酮屬于慢速消除類。莪術(shù)醇和吉馬酮的K12均大于K21，說(shuō)明二者從中央房室向周邊房室的轉(zhuǎn)運(yùn)速率大于從周邊房室向中央房室的轉(zhuǎn)運(yùn)速率。表明莪術(shù)提取液大鼠灌胃后以不同速度從腸道吸收，進(jìn)入體循環(huán)，隨機(jī)分布到體內(nèi)的組織、器官，然后分別表現(xiàn)出不同的清除過(guò)程。

經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，本方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，回收率、精密度均符合生物樣本中微量測(cè)定［7］要求，可用于莪術(shù)煎劑中藥代動(dòng)力學(xué)研究。

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