尿毒癥患者血清對(duì)血管平滑肌細(xì)胞鈣化及Ⅰ型膠原表達(dá)的影響

白亞玲，徐金升，牛哲哲，張俊霞，張勝雷，崔立文，張慧然

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊 050011)

近年來(lái)，慢性腎臟病(CKD)已成為我國(guó)常見的慢性疾病，患病率約為 10.8%［1，2］，并有逐年增高的趨勢(shì)。國(guó)外統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，CKD患者是心血管疾病(CVD)發(fā)生的高危人群，而血管鈣化作為CVD發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，近年研究顯示，CKD患者主要表現(xiàn)為中膜鈣化，血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)發(fā)生類成骨/成軟骨樣表型轉(zhuǎn)化，在血管鈣化中起著極為重要的作用。2011年1月～2012年9月，我們采用尿毒癥患者血清(以下簡(jiǎn)稱尿毒癥血清)模擬體內(nèi)環(huán)境刺激VSMCs，用不同濃度尿毒癥血清對(duì)VSMCs進(jìn)行干預(yù)，探討尿毒癥血清誘導(dǎo)VSMCs鈣化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2011年1月～2012年9月于河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院血液凈化中心行維持性血液透析的患者12例，正常健康志愿者10例，自河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)置清潔級(jí)SD大鼠數(shù)只，雄性，5周齡，體質(zhì)量80～100 g。

1.2 試劑與儀器 兔抗鼠Ⅰ型膠原多克隆抗體(美國(guó)Abcom公司)、熒光標(biāo)記抗兔的二抗(Cell signaling公司)、RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Fermentas公司)、凝膠成像系統(tǒng)FOTODYNE型(美國(guó)Image公司)、PCR儀ABI5700型(美國(guó)ABI公司)、微量核酸蛋白檢測(cè)儀(美國(guó)Thermo公司)、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀DYY-III6B(北京六一儀器廠)。

1.3 方法

1.3.1 取大鼠胸腹主動(dòng)脈采用組織塊貼壁法進(jìn)行VSMCs原代培養(yǎng)，所有細(xì)胞均采用高磷(10 mmol/L β-甘油磷酸)培養(yǎng)基培養(yǎng)，VSMCs隨機(jī)分為健康血清組和尿毒癥血清組，依據(jù)血清在培養(yǎng)基中所占比例每組各設(shè)5%、10%、15%(低、中、高)三個(gè)亞組，干預(yù)6 d。

1.3.2 血清制備 尿毒癥血清組:透析前清晨空腹采靜脈血4 mL離心后，分離血清并混合，56℃滅活，0.22 μm的濾膜過濾除菌，－80℃冷凍保存?zhèn)溆?健康血清組:同期選取自愿參與本研究的健康志愿者，清晨空腹采靜脈血4 mL，處理方法同尿毒癥患者血清。依據(jù)血清在培養(yǎng)基中所占比例每組各設(shè)5%、10%、15%(低、中、高)三個(gè)亞組，分別干預(yù) 6 d。

1.3.3 鈣化檢測(cè)

1.3.3.1 鈣鹽沉積測(cè)定 ①茜素紅染色［3］:取4～5代細(xì)胞以5×104/孔密度接種于24孔板內(nèi)，干預(yù)6 d，用pH 8.4、濃度為0.1%的茜素紅染液進(jìn)行鈣化染色，倒置顯微鏡下觀察照相。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):鈣鹽沉積為橘紅色。②von Kossa染色［4］:同法接種細(xì)胞，干預(yù)后固定，行5%硝酸銀避光行鈣化染色，紫外線照射。倒置顯微鏡下觀察照相。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn):鈣鹽沉積為黑色，背景為紅色。

1.3.3.2 細(xì)胞內(nèi)鈣含量測(cè)定［4］取4～5代細(xì)胞以2 ×105/孔密度接種于6 孔板，干預(yù)6 d，0.6 mmol/L鹽酸37℃脫鈣24 h，吸取上清，鈣定量檢測(cè)試劑盒測(cè)定鈣含量，脫鈣后的細(xì)胞用0.1 mol/L NaOH和0.1%的 SDS 溶解細(xì)胞 30 min，BCA 法［3］測(cè)定細(xì)胞蛋白含量，結(jié)果用細(xì)胞鈣含量比蛋白含量表示(g/mg蛋白)。實(shí)驗(yàn)每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.3.4 細(xì)胞核心結(jié)合因子 α1(Cbfα1)mRNA 及 I型膠原(ColⅠ)mRNA測(cè)定 細(xì)胞總RNA提取采用Trizol一步法。引物序列由Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)(Cbfα1:forward primer:5'-CCGCACGACAACCGCACCAT-3'，Reverse primer:5'-CGCTCCGGCCCACAAATCTC-3';CoIⅠ:forward primer:5'-GGTTTGGAGAGAGCATGACC-3'，Reverseprimer:5'-TTTGGGGAAAT-3'GAGTTTGG-3';GAPDH:forward primer:5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3'，Reverse primer:5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3')。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以GAPDH作為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算Cbfα1 mRNA及ColⅠmRNA相對(duì)含量。

1.3.5 細(xì)胞及上清液ColⅠ蛋白的測(cè)定 提取細(xì)胞及上清液中總蛋白［5］，應(yīng)用Western blot法進(jìn)行檢測(cè)。一抗采用兔抗ColⅠ抗體(1∶1000)或兔抗GAPDH抗體(1∶1000)，二抗為熒光標(biāo)記的抗兔的抗體(1∶10000)，結(jié)果采用gel-Image J軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，以GAPDH作為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算ColⅠ蛋白相對(duì)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用()表示，兩組間均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(ANOVA)，用S-N-K檢驗(yàn)作多組間均數(shù)兩兩比較，相關(guān)分析符合雙變量正態(tài)分布作Pearson積差相關(guān)分析，不符合雙變量正態(tài)分布作Spearman秩相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VSMCs鈣化測(cè)定 茜素紅染色及von Kossa染色示:與健康血清組比較，尿毒癥血清組VSMCs鈣化染色均加重，隨尿毒癥血清濃度增高，鈣化結(jié)節(jié)越明顯。VSMCs鈣沉積測(cè)定示:與健康血清組比較，尿毒癥血清組鈣含量均增高，5%濃度開始升高，15%濃度達(dá)最高，呈現(xiàn)濃度依賴性(P＜0.05)。見表1。

2.2 Cbfa1 mRNA表達(dá) 與健康血清組比較，尿毒癥血清組Cbfα1 mRNA表達(dá)均升高(P＜0.05)。尿毒癥血清組低、中、高三個(gè)亞組間兩兩比較，Cbfα1 mRNA表達(dá)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，趨勢(shì)上5%濃度開始升高，15%濃度達(dá)最高，亦呈濃度依賴性(P＜0.05)。見圖1，表2。

表1 不同血清刺激對(duì)血管VSMCs鈣含量的影響(μg/mg 蛋白，)

表1 不同血清刺激對(duì)血管VSMCs鈣含量的影響(μg/mg 蛋白，)

注:與健康血清組比較，﹟P＜0.05;與同組5%濃度比較，△P＜0.05;與同組10%濃度比較，▲P ＜0.05

組別 鈣含量尿毒癥血清組5%濃度 109.39 ±10.14﹟10%濃度 134.22 ± 4.90﹟△15%濃度 165.35 ±14.06﹟△▲健康血清組5%濃度 76.16 ± 2.3210%濃度 78.11 ± 2.3715%濃度76.55 ± 3.52

圖1 不同濃度血清刺激后對(duì)VSMCs Cbfα1 mRNA表達(dá)的影響

表2 不同濃度血清刺激后對(duì)VSMCs Cbfα1 mRNA 表達(dá)的影響()

表2 不同濃度血清刺激后對(duì)VSMCs Cbfα1 mRNA 表達(dá)的影響()

注:與健康血清組比較，﹟P＜0.05;與同組5%濃度比較，△P＜0.05;與同組10%濃度比較，▲P ＜0.05

組別 Cbfα1 mRNA尿毒癥血清組5%濃度 0.288 ±0.010﹟10%濃度 0.387 ±0.020﹟△15%濃度 0.427 ±0.020﹟△▲健康血清組5%濃度 0.223 ±0.02010%濃度 0.235 ±0.02015%濃度0.238 ±0.010

2.3 ColⅠmRNA及蛋白表達(dá) 與健康血清組比較，尿毒癥血清組細(xì)胞ColⅠmRNA、細(xì)胞上清液中ColⅠ蛋白表達(dá)均升高，低、中、高三個(gè)亞組間呈現(xiàn)濃度依賴性，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。尿毒癥血清組低、中、高三個(gè)亞組間比較結(jié)果見表3。同時(shí)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)健康血清組及尿毒癥血清組細(xì)胞中均無(wú)ColⅠ蛋白表達(dá)。見圖2、3。

圖2 不同濃度血清刺激后對(duì)VSMCs ColⅠmRNA表達(dá)的影響

圖3 不同濃度血清刺激后對(duì)VSMCs上清液中ColⅠ蛋白表達(dá)的影響

表3 不同濃度血清刺激對(duì)VSMCs ColⅠmRNA及上清液中ColⅠ蛋白表達(dá)的影響()

表3 不同濃度血清刺激對(duì)VSMCs ColⅠmRNA及上清液中ColⅠ蛋白表達(dá)的影響()

注:與健康血清組比較，﹟P＜0.05;與同組5%濃度比較，△P＜0.05;與同組10%濃度比較，▲P ＜0.05

組別 ColⅠ mRNA ColⅠ 蛋白尿毒癥血清組5%濃度 0.682±0.010﹟ 0.651±0.02﹟10%濃度 0.719±0.030﹟△ 0.752±0.03﹟△15%濃度 0.910 ±0.020﹟△▲ 0.843 ±0.03﹟△▲健康血清組5%濃度 0.564 ±0.020 0.278 ±0.02010%濃度 0.595 ±0.040 0.399 ±0.04015%濃度0.598 ±0.040 0.509 ±0.080

2.4 尿毒癥血清組VSMCs鈣化、ColⅠ表達(dá)、Cbfα1表達(dá)的相關(guān)性 尿毒癥血清組低、中、高三個(gè)亞組VSMCs鈣含量與上清液中ColⅠ蛋白表達(dá)均呈正相關(guān)(r=0.797，P ＜0.01)，細(xì)胞 ColⅠ mRNA 表達(dá)與Cbfα1 mRNA 表達(dá)亦呈正相關(guān) (r=0.784，P ＜0.05)。

3 討論

CKD患者的血管鈣化主要表現(xiàn)為中膜鈣化，位于血管中膜的血管平滑肌細(xì)胞在CKD患者血管鈣化中起著關(guān)鍵作用［6］。以前人們普遍認(rèn)為CKD患者血管鈣化是一種鈣磷被動(dòng)沉積于細(xì)胞和組織間的過程，而近年來(lái)證實(shí)，血管鈣化是一個(gè)細(xì)胞介導(dǎo)的、主動(dòng)的、高度可調(diào)的生物學(xué)過程，類似于骨和軟骨的骨化過程，其鈣化發(fā)生的中心環(huán)節(jié)是血管平滑肌細(xì)胞向成骨/成軟骨樣表型轉(zhuǎn)化，然后啟動(dòng)的一系列異位成骨的過程［7］，最終導(dǎo)致包括血管在內(nèi)的全身軟組織發(fā)生礦化、鈣化。本研究采用尿毒癥血清模擬體內(nèi)環(huán)境，對(duì)VSMCs進(jìn)行刺激，分別用茜素紅及von Kossa兩種鈣化染色方法證實(shí)尿毒癥血清刺激可加重VSMCs鈣化，使鈣結(jié)節(jié)數(shù)目增加，具有典型細(xì)胞鈣化的特征，與文獻(xiàn)［8］報(bào)道一致，且尿毒癥血清刺激可使鈣含量升高。本研究發(fā)現(xiàn)，尿毒癥血清可促進(jìn)鈣化發(fā)生、發(fā)展，且尿毒癥血清濃度越高，鈣化越嚴(yán)重，提示臨床上CKD患者隨時(shí)間延長(zhǎng)CVD發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增高，可能與體內(nèi)毒素水平升高誘導(dǎo)血管鈣化有關(guān)。

成骨樣細(xì)胞表型特征的鈣化是血管鈣化的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，核心結(jié)合因子(Cbfα1/Runx2)作為成骨樣細(xì)胞表型的標(biāo)記物，是骨形成過程中的主要調(diào)節(jié)因子［9］，其是三個(gè)核心結(jié)合因子家族中的成員之一，另外兩個(gè)成員為 Cbfα2、Cbfα3［10］。但 Cbfα1 不是成骨細(xì)胞所特有，其在發(fā)生鈣化的血管平滑肌細(xì)胞中也表達(dá)［11］。本研究發(fā)現(xiàn)，尿毒癥血清刺激VSMCs后細(xì)胞內(nèi)Cbfα1 mRNA表達(dá)升高，呈現(xiàn)濃度依賴性，提示尿毒癥患者血清干預(yù)VSMCs后誘導(dǎo)其發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，VSMCs成骨/成軟骨樣表型轉(zhuǎn)化在血管鈣化中可能發(fā)揮重要作用。

骨分子生物研究顯示，骨基質(zhì)形成的過程在某種程度上伴隨ColⅠ累積的礦化發(fā)生過程［12］，ColⅠ作為細(xì)胞外基質(zhì)的最主要組成成分，約占血管壁膠原成分的60%，屬于“間隙膠原”，其成分改變對(duì)血管鈣化的發(fā)生發(fā)展起重要作用。ColⅠ在骨礦化中的作用主要表現(xiàn)為:一是穩(wěn)定細(xì)胞基質(zhì)的作用;二是隨細(xì)胞的ColⅠ量的積累，形成大量的類骨質(zhì)，為礦化作準(zhǔn)備，而ColⅠ在VSMCs中亦可能發(fā)生相似過程誘導(dǎo)鈣化發(fā)生。研究證實(shí)VSMC由收縮型轉(zhuǎn)化為合成型時(shí)，其對(duì)ColⅠ的合成能力大大加強(qiáng)，提示尿毒癥血清可以誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化進(jìn)而分泌ColⅠ，從而使細(xì)胞保持一個(gè)穩(wěn)定的狀態(tài)，利于細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)的形成，進(jìn)一步發(fā)生礦化［13］。本研究采用尿毒癥血清模擬體內(nèi)環(huán)境，對(duì)VSMCs進(jìn)行刺激，對(duì)細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞上清液 ColⅠ分別進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)VSMCs內(nèi)無(wú)ColⅠ蛋白表達(dá)，上清液可檢測(cè)到ColⅠ蛋白表達(dá)，提示尿毒癥血清刺激后VSMCs內(nèi)ColⅠ蛋白含量升高，呈濃度依賴性，進(jìn)一步證實(shí)ColⅠ屬于分泌性蛋白。細(xì)胞鈣含量變化與ColⅠ蛋白表達(dá)相關(guān)分析顯示二者呈正相關(guān)，提示ColⅠ在誘導(dǎo)VSMCs鈣化中發(fā)揮作用，與目前研究相一致［14］。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)尿毒癥患者血清刺激VSMCs后細(xì)胞內(nèi)Cbfα1 mRNA及ColⅠ mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，與目前關(guān)于Cbfα1可以正向調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞特定ColⅠ蛋白基因的表達(dá)［15］的研究相一致。已知Cbfα1屬于runt結(jié)構(gòu)域基因家族，通過runt與DNA結(jié)合，可以調(diào)節(jié)成骨分化標(biāo)志基因和成骨表型相關(guān)基因的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)骨分化和骨形成。

綜上所述，不同濃度尿毒癥患者血清刺激可使VSMCs發(fā)生鈣化，其作用機(jī)制可能是通過VSMCs表型轉(zhuǎn)化，促使ColⅠ蛋白表達(dá)升高。

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