通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用鑒定蛋白質(zhì)相互作用方法的建立

胡 家 鄭 帥 胡 科 殷愛(ài)紅*

(1.首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測(cè)試中心，北京100069;2.首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，北京100069;3.首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)系，北京100048)

蛋白質(zhì)是生命功能的執(zhí)行者，但大多數(shù)蛋白質(zhì)并不能單獨(dú)行使其功能，而是通過(guò)與其他蛋白質(zhì)相互作用來(lái)參與細(xì)胞或組織的生理活動(dòng)［1］。蛋白質(zhì)組學(xué)研究的轟轟烈烈興起開(kāi)啟了人們解析各種生命活動(dòng)以及生理功能的新思路，近些年已經(jīng)由比較蛋白質(zhì)組學(xué)研究逐漸過(guò)渡到功能蛋白質(zhì)組學(xué)研究。構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)能展示出兩種以上蛋白質(zhì)之間的相互依賴性以及這些蛋白質(zhì)相互作用所起到的重要生理功能［2］。對(duì)于蛋白質(zhì)相互作用研究的方法不斷涌現(xiàn)，有蛋白芯片技術(shù)，X-射線晶體學(xué)技術(shù)、酵母雙雜交、帶標(biāo)簽-pull down技術(shù)、免疫共沉淀技術(shù)、多肽陣列技術(shù)以及熒光顯微鏡技術(shù)［3］。首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測(cè)試中心蛋白質(zhì)組學(xué)研究測(cè)試室已經(jīng)開(kāi)展將pull-down或免疫共沉淀之后的樣品再經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用來(lái)鑒定相互作用的蛋白，本文介紹一種通過(guò)谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)-pull down技術(shù)尋找大鼠腎組織中與誘餌蛋白相互作用的蛋白，再通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳 (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)對(duì)pull down樣品進(jìn)行分離，最后通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)來(lái)鑒定與誘餌蛋白相互作用的其他蛋白的方法。

1 材料和方法

1.1 材料

1)實(shí)驗(yàn)樣品:帶GST標(biāo)簽的誘餌蛋白，ZS蛋白(由于研究成果權(quán)限的原因，特此命名)，其表達(dá)載體由首都醫(yī)科大學(xué)賀俊崎教授實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建提供;大鼠［購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào):SCXK(京)2012-0001］腎組織也是該實(shí)驗(yàn)室提供。

2)試劑:過(guò)硫酸銨，丙烯酰胺，甲叉雙丙烯酰胺，TEMED，二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)，碘乙酰胺，SDS，甘氨酸，Tris，CHAPS均為美國(guó) GE公司產(chǎn)品;胰蛋白酶(測(cè)序級(jí))為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品;乙腈，甲酸，考馬斯亮藍(lán)G250為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品。

1.2 大鼠腎組織GST-pull down實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)方法參考文章［4-5］，取新鮮大鼠腎組織稱質(zhì)量后剪成碎塊，用預(yù)冷的裂解緩沖液(HEPES 10 mmol/L，pH 7.4，NaCl 50 mmol/L，EDTA 5 mmol/L，1%Triton X-100，Benzamidine 1 mmol/L)以10 mL溶液:1 g組織的比例對(duì)大鼠腎組織進(jìn)行蛋白質(zhì)裂解，期間用勻漿器勻漿10 min(15 W)，再冰浴超聲，條件設(shè)置為超聲5 s，間歇5 s，共12個(gè)循環(huán)，最后4 ℃，13 000 r/min離心15 min，取上清即為大鼠腎組織裂解液。

將等量純化好的GST和ZS蛋白瓊脂糖珠分別加入大鼠腎組織裂解液中，在4℃上下顛倒持續(xù)混合3 h，4℃，3 000 r/min離心1 min收集沉淀，并用1 mL預(yù)冷的洗滌液Ⅰ(HEPES 10 mmol/L，pH 7.4，NaCl 50 mmol/L，EDTA 5 mmol/L，0.1%Tween 20，3%BSA，Benzamidine 1 mmol/L)洗滌沉淀，共洗滌4次，每次振蕩洗滌完用4℃，3 000 r/min離心1 min，收集沉淀，再用1 mL預(yù)冷的洗滌液Ⅱ(HEPES 10 mmol/L，pH 7.4，NaCl 50 mmol/L，EDTA 5 mmol/L，0.1%Tween 20，Benzamidine 1 mmol/L)洗滌沉淀1次，最后4℃，3 000 r/min離心1 min，收集沉淀，將此GST-pull down沉淀復(fù)合物中加入適量的一維電泳蛋白上樣緩沖液，95℃加熱5 min使蛋白變性，離心后取上清進(jìn)行SDS-PAGE，采用7 cm凝膠，濃度為10%，再用考馬斯亮藍(lán)染色電泳后凝膠。

1.3 膠內(nèi)酶切

根據(jù)PAGE凝膠的染色結(jié)果，從 ZS蛋白 pull down大鼠腎組織后的樣品泳道上切下與對(duì)照差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的條帶，將切下的條帶再切碎成小顆粒，經(jīng)脫色，還原，烷基化，之后30℃水浴酶切18 h［6-7］。

1.4 液質(zhì)聯(lián)用鑒定與ZS蛋白相互作用蛋白

將酶切完成的樣品經(jīng)超聲振蕩后，15 000 r/min離心15 min，取5 μL上清進(jìn)行納升級(jí)液相與ESI源離子阱質(zhì)譜聯(lián)用分析(Bruker Daltonics德國(guó))。儀器由HyStarTM3.2和EsquireControlTM5.2軟件(Bruker Daltonics)控制。液相條件:EasyTMC18(2 cm×100 μm，5 μm)為富集柱;EasyTMC18(10 cm ×75 μm，3 μm)為分析柱;流速設(shè)300 nL/min;流動(dòng)相A是含0.1%甲酸的水溶液;流動(dòng)相B為含0.1%甲酸的乙腈。梯度設(shè)置為0 min B液5%，0～45 min B液上升到35%，45～47 min，B液上升到95%，49 min B液95%，共運(yùn)行50 min。質(zhì)譜條件:離子化方式是納升電噴霧正離子模式;每次掃描中5個(gè)強(qiáng)度最高的離子進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析;毛細(xì)管電壓設(shè)4 000 V;Skimmer電壓設(shè)40V;霧化裝置壓力0.069 MPa;干燥氣5 L/min，溫度設(shè)220℃;采集范圍:MS為20～1 500 M/Z，MS/MS為100～2 500 M/Z。數(shù)據(jù)分析軟件:Data Analysis 4.0;數(shù)據(jù)經(jīng)軟件分析之后通過(guò)Mascot檢索軟件檢索本地SwissPort(201005)中的大鼠數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索條件設(shè)為，Trypsin酶切，固定修飾選擇M氧化，可變修飾為碘乙酰胺烷基化，漏切位點(diǎn)為1，MS質(zhì)量數(shù)誤差0.4%，MS/MS的質(zhì)量數(shù)誤差為0.7，所用儀器選ESI-Trap。依據(jù)MASCOT算法，匹配肽段數(shù)在3條以上，并且得分(score值)在可信區(qū)間內(nèi)的蛋白為成功鑒定到的蛋白。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 ZS蛋白pull-down大鼠腎組織結(jié)果

從圖1中可看出ZS蛋白pull-down大鼠腎組織裂解液的樣品泳道(圖中標(biāo)注為3)比GST pull-down樣品泳道(圖中標(biāo)注為2)在相對(duì)分子質(zhì)量55 000與72 000之間明顯多出一個(gè)條帶，標(biāo)注為#，再對(duì)應(yīng)大鼠腎組織裂解液(lysate)泳道(圖中標(biāo)注為1)和右側(cè)的ZS蛋白泳道(圖中標(biāo)注為4)顯示，在ZS蛋白泳道相應(yīng)位置并未出現(xiàn)此條帶，在Lysate泳道此處有條帶，這說(shuō)明該條帶是大鼠腎組織裂解液中由ZS蛋白pulldown下來(lái)的成分。

2.2 液質(zhì)聯(lián)用鑒定結(jié)果

圖1 GST pull-down實(shí)驗(yàn)尋找大鼠腎組織裂解液中與ZS蛋白相互作用的蛋白，所得沉淀經(jīng)SDS-PAGE電泳后結(jié)果Fig.1 Screening of ZS binding partners by GST pull-down assay.The precipitates were run on SDS-PAGE

將此特異性條帶(標(biāo)記為#)切下之后進(jìn)行膠內(nèi)酶切，用酶解原液直接上樣，經(jīng)納升級(jí)液相分離之后由ESI源離子阱質(zhì)譜檢測(cè)。圖2是樣品的基峰離子流圖(base peak chromatogram，BPC)，由每個(gè)時(shí)間點(diǎn)質(zhì)譜圖中最強(qiáng)離子的強(qiáng)度連續(xù)描繪所得。由BPC可看出，從12 min開(kāi)始出峰，到45 min B相即有機(jī)相從5%升至35%樣品基本洗脫完全，液相梯度設(shè)置合適，對(duì)樣品的分離效果很好。液相每時(shí)每刻分離的樣品進(jìn)到質(zhì)譜里進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)時(shí)刻將檢測(cè)到的強(qiáng)度最高的5個(gè)離子作為母離子進(jìn)行碎裂，做二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)，所得一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜峰進(jìn)過(guò)軟件分析再通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索，由MASCOT算法得出Score值超過(guò)39分的為可信鑒定結(jié)果。本研究共鑒定出32種蛋白(表1)。圖3顯示二氫嘧啶酶(dihydropyrimidinase)的質(zhì)譜鑒定情況。該蛋白是鑒定結(jié)果中得分最高的蛋白質(zhì)，有127條序列與數(shù)據(jù)庫(kù)高度匹配，其中一條得分最高的序列K.IPNGVNGVEDR.M，是質(zhì)荷比(M/Z)為585.3的母離子經(jīng)過(guò)離子阱的碰撞誘導(dǎo)裂解(collision-induced dissociation，CID)之后鑒定所得。在17.1 min時(shí)，該多肽從液相中大量洗脫出來(lái)，經(jīng)質(zhì)譜分析得到一級(jí)質(zhì)譜峰如圖3(A)，該母離子為二價(jià)形式即(M+2H)2+，經(jīng)二級(jí)碎裂后所得質(zhì)譜峰如圖3(B)。

3 討論

Pull-down技術(shù)是由Smith及其研究團(tuán)隊(duì)于1988年利用GST融合標(biāo)簽純化出GST融合蛋白，由此該技術(shù)開(kāi)始成為一種熱門研究方法［1，8］。該技術(shù)特異性較強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便，是一種很好的篩選蛋白質(zhì)相互作用的方法，但是并不能避免假陽(yáng)性，還需要做進(jìn)一步的研究來(lái)確證蛋白相互作用。

表1 #蛋白條帶經(jīng)液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用鑒定結(jié)果Tab.1 The protein band#identified by liquid chromatography-electrospary ionization mass spectrometry tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)

圖2 #條帶膠內(nèi)酶切之后經(jīng)液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用分析所得基峰離子流圖Fig.2 Base peak chromatogram of the protein band#after digested in gel by liquid chromatography-electrospary ionization mass spectrometry tandem mass spectrometry(LC-MS/MS)

圖3 #條帶膠內(nèi)酶切后經(jīng)液質(zhì)聯(lián)用分析所得質(zhì)譜圖Fig.3 MS spectra of band#after digested in gel by liquid chromatography-clectrospary inoization mass spectrometry dandem mass spectrometry(LC-MS/MS)

在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中通常使用與納升級(jí)液相聯(lián)用的電噴霧電離源離子阱質(zhì)譜來(lái)分析樣品［9］，其液相部分能自動(dòng)進(jìn)樣，并用C18反向柱對(duì)樣品進(jìn)行濃縮分離，由此可實(shí)現(xiàn)高通量和高靈敏度。電噴霧源串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定多肽氨基酸序列的關(guān)鍵步驟是通過(guò)CID過(guò)程得到適當(dāng)碎片離子。采用的方法是在多肽一級(jí)質(zhì)譜的基礎(chǔ)上選擇母離子，通常是(M+H)+或(M+nH)n+離子，在適當(dāng)?shù)呐鲎材芰肯屡c惰性氣體發(fā)生碰撞，導(dǎo)致多肽碎裂產(chǎn)生碎片離子。CID過(guò)程產(chǎn)生的碎片離子一般分為兩大組6個(gè)系列，從N端開(kāi)始的碎片離子以an、bn、cn表示，從C端開(kāi)始的碎片離子以xn、yn、zn表示，母離子的某一系列碎片離子(比如yn系列)內(nèi)相鄰兩個(gè)離子的質(zhì)量數(shù)之差即是斷裂處氨基酸殘基的質(zhì)量，由此可推斷出多肽的氨基酸序列，不同系列離子所推斷的氨基酸序列可互補(bǔ)［10-11］。本實(shí)驗(yàn)中離子阱檢測(cè)到的二級(jí)碎裂峰中大多是y離子，這與母離子碎裂方式及離子阱的檢測(cè)特點(diǎn)有關(guān)。

通過(guò)已知蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)顯示了蛋白質(zhì)的相互依存關(guān)系，有很多蛋白質(zhì)不僅僅是兩兩結(jié)合的，大多數(shù)情況是多個(gè)蛋白質(zhì)形成大的復(fù)合體并相互作用來(lái)行使某種生理功能，而我們可能只已知某幾個(gè)蛋白的功能，但是通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)相互作用的研究可發(fā)現(xiàn)其他蛋白質(zhì)并了解其功能，由此更豐富并完善蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)［12］。傳統(tǒng)研究蛋白相互作用的方法在未知蛋白質(zhì)的鑒定上有困難［13-14］，而引用質(zhì)譜技術(shù)正好可彌補(bǔ)這一缺憾，并能實(shí)現(xiàn)高通量。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)pull-down技術(shù)結(jié)合液質(zhì)聯(lián)用鑒定了大鼠腎組織中可能與ZS蛋白相互作用的32種蛋白，此方法的建立為進(jìn)一步研究ZS蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。從表1所示的質(zhì)譜鑒定結(jié)果來(lái)看，大多數(shù)屬代謝相關(guān)酶類以及細(xì)胞骨架蛋白。其中Ezrin、moesin與ZS蛋白所在家族中其他蛋白有相互作用，而ZS蛋白會(huì)與其家族成員形成大的復(fù)合體并與細(xì)胞骨架蛋白有相互作用［15-16］。由此可說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是可靠的。由于pull-down實(shí)驗(yàn)并不能保證所拉下來(lái)的蛋白一定與誘餌蛋白是特異結(jié)合的，所以鑒定到的蛋白是否與ZS蛋白確有特異結(jié)合并相互作用仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。

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