BNIP3在細(xì)胞凋亡與自噬中的作用

徐 冉，魏瓏瓏，李志強(qiáng)，李曉鋒，韓麗輝

(1 山東大學(xué)醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250012;2 安丘市立醫(yī)院)

BNIP3屬于Bcl-2家族蛋白中的BH3-only亞家族，其結(jié)構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)定位、對(duì)細(xì)胞生存的調(diào)控與BH3-only亞家族的其他蛋白不盡相同。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，BNIP3不僅參與細(xì)胞的凋亡，同時(shí)調(diào)控細(xì)胞自噬和壞死等過(guò)程。在不同的外界環(huán)境下，其調(diào)控方式和作用效應(yīng)也不盡相同，其調(diào)控方式的復(fù)雜性預(yù)示著其生物學(xué)活性的多樣性。闡明其作用機(jī)制對(duì)于理解和控制多種病理、生理過(guò)程具有重要意義。本文就BNIP3在細(xì)胞凋亡與自噬中的作用作一綜述。

1 BNIP3的結(jié)構(gòu)與定位

1.1 BNIP3的結(jié)構(gòu) BNIP3是一種能與腺病毒E1B19kD蛋白相互作用的蛋白質(zhì)，BNIP3基因定位于10號(hào)染色體10q26.3，包含6個(gè)外顯子，基因序列全長(zhǎng)585 bp，編碼194個(gè)氨基酸，分子量約21 kD［2］。Bcl-2家族蛋白是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的主要蛋白之一，所有成員的蛋白結(jié)構(gòu)中包含至少1個(gè)Bcl-2同源結(jié)構(gòu)域(BH1～BH4);而作為僅含BH3同源結(jié)構(gòu)域的BNIP3，主要包含以下功能結(jié)構(gòu)域［4，5］(圖1):①PEST結(jié)構(gòu)域:位于54～81位氨基酸，可被胞質(zhì)內(nèi)的蛋白酶迅速降解，是BNIP3蛋白降解的靶位點(diǎn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)BNIP3蛋白的含量。②BH3結(jié)構(gòu)域:位于104～119位氨基酸，絕大多數(shù)促凋亡蛋白通過(guò)此結(jié)構(gòu)域與抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcl-XL)形成異二聚體后發(fā)揮促細(xì)胞凋亡功能［1］，而B(niǎo)NIP3的此序列與其他Bcl-2家族也有所不同，BNIP3不通過(guò)此途徑形成異源二聚體，此結(jié)構(gòu)域參與BNIP3介導(dǎo)的Caspase依賴性線粒體凋亡途徑。③氨基端結(jié)構(gòu)域(NH2結(jié)構(gòu)域):位于1～49位氨基酸，與BH3結(jié)構(gòu)域具有相似的功能，BNIP3此結(jié)構(gòu)域與TM結(jié)構(gòu)域在形成二聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡中有著重要作用［1］。④C-末端跨膜區(qū)(TM):位于164～194位氨基酸，是BNIP3行使其促凋亡功能的最重要的結(jié)構(gòu)域。對(duì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡、同源二聚化、介導(dǎo)BNIP3定位到線粒體、活化BNIP3至關(guān)重要［1］。但也有相關(guān)研究提示，C末端TM的同源氨基酸序列可能不是凋亡所必需的，該結(jié)構(gòu)介導(dǎo)細(xì)胞非Caspase依賴性的線粒體凋亡途徑［3］。

圖1 BNIP3的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)圖

1.2 BNIP3的定位 正常生理?xiàng)l件下，人類(lèi)多種正常組織中均有BNIP3的表達(dá)，但表達(dá)量很低，僅能從人腦細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞中檢測(cè)到BNIP3的表達(dá)［2，5～7］，但也有部分細(xì)胞不表達(dá) BNIP3，如神經(jīng)元細(xì)胞［8］;而在缺氧條件下，BNIP3的表達(dá)上調(diào)。研究證實(shí)，正常腦組織細(xì)胞中BNIP3的表達(dá)定位于細(xì)胞核;在外界壓力如缺氧的誘導(dǎo)下，BNIP3的表達(dá)則由核轉(zhuǎn)位至胞質(zhì)［5］。

在多種細(xì)胞中，BNIP3核內(nèi)表達(dá)之后，絕大多數(shù)存在于胞液或松散地結(jié)合在線粒體外膜上，當(dāng)?shù)蛲鲂盘?hào)被激活時(shí)，BNIP3從胞液轉(zhuǎn)移到線粒體外膜引起線粒體功能障礙，最終引起細(xì)胞死亡［1，7］。而當(dāng)BNIP3與E1B19K共表達(dá)時(shí)，其表達(dá)定位于細(xì)胞核，這在多種腫瘤細(xì)胞中得到證實(shí)［5］。但當(dāng)細(xì)胞核中BNIP3表達(dá)增加時(shí)，細(xì)胞死亡的數(shù)量卻沒(méi)有增加，這可能與BNIP3和凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)的相互作用有關(guān)［10］。AIF是一種線粒體黃素蛋白，在外界刺激下，AIF從線粒體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，介導(dǎo)非Caspase途徑的細(xì)胞死亡;當(dāng)抑制AIF表達(dá)時(shí)，細(xì)胞凋亡的數(shù)量會(huì)有所減少;同時(shí)，在許多腫瘤細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)AIF的表達(dá)水平下降。位于核內(nèi)的BNIP3能夠與AIF啟動(dòng)子結(jié)合，招募多蛋白復(fù)合物HDAC1/PSF抑制AIF的轉(zhuǎn)錄和翻譯，減少AIF介導(dǎo)的DNA裂解;這可以從一定程度上解釋核內(nèi)BNIP3表達(dá)增加卻并未增加細(xì)胞死亡這一現(xiàn)象［10］。

2 BNIP3與細(xì)胞凋亡

Bcl-2家族作為細(xì)胞凋亡的中心調(diào)控環(huán)節(jié)，在整合細(xì)胞內(nèi)外各種生存與死亡信號(hào)后，決定細(xì)胞是否存活，而B(niǎo)NIP3作為Bcl-2家族的一員，也在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中發(fā)揮獨(dú)特作用。免疫印跡研究結(jié)果顯示，BNIP3蛋白存在30 kD單體和60 kD二聚體兩種形式［2］;相應(yīng)的研究證實(shí)，BNIP3形成同源二聚體對(duì)其發(fā)揮促凋亡功能非常重要。

2.1 BNIP3的作用方式 與其他Bcl-2家族蛋白不同，BNIP3及其同系物Nix/BNIP3L第64位氨基酸為半胱氨酸，對(duì)氧化應(yīng)激壓力敏感;生理?xiàng)l件下，因胞液處于高度還原狀態(tài)，半胱氨酸始終保持著硫醇或硫醇鹽的形式，因此，內(nèi)源性BNIP3主要以單體分子的形式存在;而當(dāng)心肌缺血—再灌注(I/R)發(fā)生時(shí)，由于產(chǎn)生大量活性氧，第64位半胱氨酸殘基發(fā)生氧化，BNIP3蛋白之間通過(guò)二硫鍵形成同源二聚體;同時(shí)，BNIP3也通過(guò)COOH末端的172位絲氨酸與173位組氨酸形成氫鍵而形成二聚體［11］。BNIP3同源二聚體激活BNIP3，而過(guò)表達(dá)的BNIP3在線粒體外膜上形成質(zhì)子通道，促進(jìn)離子轉(zhuǎn)導(dǎo)，降低線粒體膜電位和增加細(xì)胞膜通透性，引起細(xì)胞死亡。

BNIP3與其他BH3-only蛋白作用方式有很大的不同。生理情況下，BH3-only蛋白通過(guò)BH3結(jié)構(gòu)域與Bcl-2家族的抗凋亡蛋白結(jié)合而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)NIP3則通過(guò)TM、NH2結(jié)構(gòu)域與Bcl-2、Bcl-XL相互作用，通過(guò)線粒體位點(diǎn)和非線粒體位點(diǎn)發(fā)揮促凋亡功能［1］。Bcl-2、Bcl-XL競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合TM結(jié)構(gòu)域而阻斷BNIP3同源二聚體的形成，也阻斷其誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡的過(guò)程。Bcl-2、Bcl-XL作為抗凋亡蛋白，過(guò)表達(dá)能延緩BNIP3介導(dǎo)的細(xì)胞死亡［1］。

BNIP3主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和線粒體，其在細(xì)胞內(nèi)的位置決定細(xì)胞死亡的方式［12］。位于ER的BNIP3使ER內(nèi)儲(chǔ)備的Ca2+釋放，Ca2+隨后在線粒體里聚集，開(kāi)放MPT通道并產(chǎn)生大量的ROS，導(dǎo)致膜電位丟失，引起Caspase依賴型的細(xì)胞凋亡;而B(niǎo)cl-2與三磷酸肌醇受體(IP3R)結(jié)合，阻止ER釋放Ca2+及隨后的細(xì)胞死亡。位于線粒體的BNIP3則引起不依賴于Ca2+的凋亡途徑，BNIP3 TM結(jié)構(gòu)域包含1個(gè)右手螺旋結(jié)構(gòu)，并富含組氨酸—絲氨酸氫鍵，該結(jié)構(gòu)在線粒體膜上形成一個(gè)質(zhì)子通道，使胞質(zhì)中的質(zhì)子流入線粒體內(nèi)，引起MPT開(kāi)放。但Bcl-2的過(guò)表達(dá)僅能阻止定位于ER的BNIP3引起的MPT開(kāi)放，而不能阻止定位于線粒體的BNIP3引起的MPT 開(kāi)放［12］，具體作用機(jī)制見(jiàn)圖2。

圖2 BNIP3細(xì)胞內(nèi)定位及與分子Bcl-2/Bcl-XL的作用機(jī)制圖

線粒體的動(dòng)態(tài)變化與凋亡需要線粒體內(nèi)外膜的協(xié)調(diào)作用，而B(niǎo)NIP3作為定位于線粒體的蛋白質(zhì)，在調(diào)控線粒體裂變這一過(guò)程中發(fā)揮重要作用。BNIP3也可以通過(guò)解離Bcl-2、Bcl-XL來(lái)間接活化Bax、Bak，調(diào)節(jié) Ca2+濃度，促進(jìn) MPT開(kāi)放，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)心肌細(xì)胞I/R損傷時(shí)，如果細(xì)胞缺乏Bax/Bak，即使BNIP3過(guò)表達(dá)，細(xì)胞對(duì)缺氧仍然表現(xiàn)為耐受，細(xì)胞死亡數(shù)量并未增加;說(shuō)明BNIP3能夠通過(guò)活化促凋亡蛋白Bax/Bak引起線粒體功能障礙，發(fā)揮促凋亡功能。

2.2 BNIP3的凋亡調(diào)控機(jī)制 正常組織細(xì)胞中，BNIP3的表達(dá)受到嚴(yán)格的控制，過(guò)表達(dá)會(huì)引起細(xì)胞死亡，細(xì)胞內(nèi)存在很多機(jī)制可以調(diào)控BNIP3的作用效應(yīng)，如通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄來(lái)抑制BNIP3的表達(dá)或抑制BNIP3的同源二聚化以抑制其活化等。

2.2.1 p53與BNIP3介導(dǎo)凋亡的關(guān)系 近期研究發(fā)現(xiàn)，p53能夠通過(guò)抑制BNIP3的表達(dá)以抵抗缺氧引起的細(xì)胞死亡，這與以往p53促凋亡作用是不同的［14］。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在正常氧含量和缺氧情況下，p53均能抑制BNIP3的表達(dá)，這個(gè)過(guò)程是通過(guò)p53的DNA結(jié)合區(qū)直接抑制BNIP3的啟動(dòng)子實(shí)現(xiàn)的［6］。BNIP3是低氧應(yīng)答基因，其表達(dá)受缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)調(diào)控。Hela細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HIF-1α過(guò)表達(dá)引起B(yǎng)NIP3表達(dá)升高。而在缺氧或 HIF-1α誘導(dǎo)BNIP3表達(dá)的過(guò)程中，p53并未參與，說(shuō)明BNIP3是由缺氧或HIF-1α直接誘導(dǎo)表達(dá)的。BNIP3的過(guò)表達(dá)會(huì)引起不同尋常的凋亡過(guò)程，沒(méi)有細(xì)胞色素C從線粒體釋放，而Caspases抑制劑的使用也不能阻止細(xì)胞死亡，因此，HIF-1誘導(dǎo)的BNIP3的表達(dá)上調(diào)在低氧引起的細(xì)胞凋亡中起重要作用。

2.2.2 Rb與BNIP3介導(dǎo)凋亡的關(guān)系 研究表明，缺氧條件下在幼鼠的肝細(xì)胞、胚胎成纖維細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞系中，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤抑制基因(Rb)的缺失能夠?qū)е翨NIP3的表達(dá)恢復(fù)，即Rb通過(guò)抑制BNIP3的表達(dá)抵抗缺氧引起的細(xì)胞死亡［13］。BNIP3啟動(dòng)子附近存在兩個(gè)保守位點(diǎn):HIF反應(yīng)元件(HRE)和E2F結(jié)合位點(diǎn)。E2F轉(zhuǎn)錄因子作為細(xì)胞周期調(diào)控因子，通過(guò)結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子中的特殊DNA序列來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，目前發(fā)現(xiàn)有5個(gè)不同的E2F家族成員，E2F-1到E2F-5。正常氧含量下，大量E2F-4和少量E2F-1結(jié)合在 E2F處，而 E2F-3、pRB、HIF-1α不結(jié)合BNIP3啟動(dòng)子序列，此時(shí)BNIP3的轉(zhuǎn)錄受到抑制;缺氧條件下，E2F-1取代E2F-4結(jié)合在E2F位點(diǎn)，HIF-1α結(jié)合在HRE，pRB/E2F-1復(fù)合物限制了 HIF-1α介導(dǎo)的 BNIP3的表達(dá)，HIF-1α與HRE結(jié)合也限制了E2F-1過(guò)量表達(dá)時(shí)的應(yīng)答反應(yīng)，但HIF-1α與pRB、E2F-1之間的作用機(jī)制尚不清楚;在缺失pRB的細(xì)胞中，缺氧時(shí)BNIP3的表達(dá)未受抑制［13］;BNIP3在常氧和乏氧條件下的表達(dá)調(diào)控見(jiàn)圖3。

圖3 BNIP3在常氧和缺氧條件下的表達(dá)調(diào)控模式圖

2.2.3 其他因子與 BNIP3介導(dǎo)凋亡的關(guān)系 在A549肺泡上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，腫瘤壞死因子(TNF)能夠促進(jìn) BNIP3表達(dá)引起的細(xì)胞死亡，包括依賴Caspase-8/Bid的凋亡途徑或不依賴Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的壞死途徑［15］;當(dāng)TNF與TNF受體結(jié)合后，Bid/Bax/Bik插入到線粒體外膜，信號(hào)通路活化，BNIP3轉(zhuǎn)錄或翻譯上調(diào)，但BNIP3卻不參與Caspase-8/Bid介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，而主要通過(guò)產(chǎn)生ROS、活化溶酶體引發(fā)細(xì)胞死亡。在巨噬細(xì)胞和小腸細(xì)胞中，NO也能夠通過(guò)激活RAS信號(hào)途徑誘導(dǎo)BNIP3的表達(dá);用三氧化二砷、氰化物等毒素處理細(xì)胞，能夠通過(guò)激活HIF-1因子引起B(yǎng)NIP3的表達(dá)［9］。這些研究表明，很多細(xì)胞間的應(yīng)激反應(yīng)都會(huì)引起B(yǎng)NIP3表達(dá)的增加，并通過(guò)BNIP3的效應(yīng)介導(dǎo)細(xì)胞死亡。

3 BNIP3與細(xì)胞自噬

自噬是許多細(xì)胞發(fā)生的基本現(xiàn)象，但當(dāng)細(xì)胞間營(yíng)養(yǎng)減少或氧氣壓力增加時(shí)，這種現(xiàn)象會(huì)增加;但自噬通過(guò)清除蛋白質(zhì)和線粒體來(lái)維持細(xì)胞存活的同時(shí)，對(duì)細(xì)胞也是不利的;線粒體數(shù)量的恒定對(duì)細(xì)胞有重要作用，清除受損的線粒體對(duì)細(xì)胞的生存是必要的，抑制自噬將引起壞死樣的細(xì)胞死亡［18］。

3.1 BNIP3與自噬的關(guān)系 許多研究表明，在多種不同的細(xì)胞中，BNIP3能夠促進(jìn)自噬［17］，具體機(jī)制尚不清楚;在缺氧等外界壓力情況下，細(xì)胞通過(guò)BNIP3介導(dǎo)的自噬來(lái)對(duì)抗外界壓力，維持生存;但部分細(xì)胞能夠發(fā)生自噬性死亡。

近期研究發(fā)現(xiàn)，BNIP3可以激活線粒體自噬，在不改變線粒體通透性和不依賴于凋亡的前提下，BNIP3介導(dǎo)線粒體的氧化磷酸化而破壞線粒體，且BNIP3減少了線粒體氧化呼吸過(guò)程中必需蛋白質(zhì)的含量，因而減少線粒體磷酸化和細(xì)胞ATP水平，促進(jìn)線粒體翻轉(zhuǎn)，可引起自噬［8～16］。

細(xì)胞質(zhì)Ca2+濃度的升高、氧化壓力的增加、mPTP的開(kāi)放均被認(rèn)為是細(xì)胞誘導(dǎo)自噬的原因，促凋亡蛋白Bcl-2也曾被報(bào)道通過(guò)擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來(lái)增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度。對(duì)成人心肌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)匱乏引起的自噬不能被透膜的Ca2+螯合劑BAPTA-AM、mPTP的抑制劑環(huán)孢霉素 A(CsA)、抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)所抑制，BNIP3引起的自噬并未被這些阻斷劑所阻斷，說(shuō)明BNIP3引起的線粒體自噬和細(xì)胞死亡是不依賴于mPTP途徑的。

3.2 輕鏈蛋白3(LC3)與BNIP3介導(dǎo)的自噬之間的關(guān)系 BNIP3與其他BH3-only的Bcl-2家族成員不同，盡管BNIP3介導(dǎo)的細(xì)胞死亡依賴于Bax/Bak途徑，但BNIP3介導(dǎo)的自噬不依賴于Bax/Bak途徑［18］;同時(shí)，免疫沉淀反應(yīng)顯示，BNIP3與自噬蛋白LC3蛋白相互作用。近期研究表明，BNIP3的同系物Nix(也稱(chēng)作 BNIP3L)直接與自噬蛋白 LC3、GABARAP相互作用，并招募GABARAP而使線粒體去極化，同時(shí)Nix結(jié)合在自噬小體上的LC3能將線粒體綁定在自噬小體上;對(duì)于BNIP3是如何將線粒體定位到自噬小體、BNIP3是否也是自噬的受體目前尚不清楚［19］。在 BNIP3過(guò)表達(dá)的細(xì)胞中，Western blot結(jié)果顯示，內(nèi)源性LC3-Ⅱ含量增多;同時(shí)在心肌細(xì)胞中的研究顯示，BNIP3誘導(dǎo)的自噬呈劑量依賴性，表明BNIP3在自噬小體—溶酶體途徑中是一種有效活化劑。在電鏡下可觀察到自噬小體、LC3的定位過(guò)程;當(dāng)阻斷BNIP3的表達(dá)而阻斷缺氧引起的自噬和細(xì)胞死亡時(shí)，LC3在自噬小體的定位并未受影響，這表明BNIP3參與自噬小體—溶酶體的融合。相反，阻斷BNIP3的表達(dá)能夠阻斷LC3的轉(zhuǎn)化和減少自噬性的細(xì)胞死亡［21］。

3.3 mTOR通路與BNIP3介導(dǎo)的自噬之間的關(guān)系 研究顯示，BNIP3介導(dǎo)的自噬能夠通過(guò)mTOR通路介導(dǎo)。mTOR調(diào)節(jié)許多生物過(guò)程，包括蛋白質(zhì)的翻譯、核糖體的合成、自噬和代謝，并可協(xié)調(diào)細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)。在mTOR途徑中，BNIP3直接結(jié)合Rheb，引起Rheb GTP減少，進(jìn)而抑制mTORC2的功能，其中BNIP3的TM結(jié)構(gòu)域與Rheb的Cys181相互作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧微環(huán)境下，BNIP3的BH3結(jié)構(gòu)域作為HIF-1的作用靶位，能與Beclin-1-Bcl-2或Beclin1-Bcl-XL復(fù)合物相互作用，通過(guò)破壞復(fù)合物釋放Beclin-1引發(fā)自噬，而不引起細(xì)胞死亡，由BNIP3/BNIP3L介導(dǎo)的缺氧下的自噬是一種保護(hù)機(jī)制，可以促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［20］。常氧狀態(tài)下，BNIP3和BNIP3L的BH3結(jié)構(gòu)域足以啟動(dòng)自噬;缺氧環(huán)境下，BNIP3和BNIP3L(作為HIF的兩個(gè)作用靶位)表達(dá)同時(shí)受抑制時(shí)，缺氧引起的自噬才會(huì)受到抑制。

綜上所述，BNIP3作為促凋亡蛋白，在正常生理?xiàng)l件下不同細(xì)胞內(nèi)其表達(dá)水平有所差異，并適度調(diào)控細(xì)胞的生存與死亡;在各種外界壓力下，尤其是在缺氧條件下，細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的BNIP3通過(guò)不同的途徑來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)，不僅促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時(shí)也可通過(guò)增加細(xì)胞自噬使細(xì)胞存活，表明BNIP3很可能在腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。BNIP3在細(xì)胞內(nèi)的作用效應(yīng)和作用機(jī)制還需進(jìn)一步探討，相關(guān)研究的深入將為腫瘤的靶向治療提供新途徑。

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