發(fā)酵鹽濃度對(duì)Chlorella vulgaris生物合成蛋白與油脂的影響

李昌靈，楊海麟，李宇佶，張 玲，王 武，*

（1.江南大學(xué)教育部工業(yè)微生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫214122；2.懷化學(xué)院生命科學(xué)系，湖南懷化418008）

普通小球藻屬綠藻門（Chlorophyta），小球藻屬（Chlorolla），是一類普生性單細(xì)胞微藻[1]。小球藻廣泛分布于淡水和海水中，除利用光能和無(wú)機(jī)碳（如，CO2和碳酸鹽等）進(jìn)行光合自養(yǎng)以外，還可利用一種或多種有機(jī)物作為能源和碳源在黑暗中生長(zhǎng)[2]，即進(jìn)行異養(yǎng)發(fā)酵。小球藻富含油脂、蛋白質(zhì)、碳水化合物、維生素、食用纖維、微量元素和其他生物活性物質(zhì)[3]，具有降血壓、降血脂，抗動(dòng)脈粥樣硬化，增強(qiáng)免疫力，抗腫瘤以及抗病毒感染等保健功能[4]。海水的鹽度約在35，但是近海的淡水稀釋或蒸發(fā)等導(dǎo)致海水的鹽度發(fā)生變化（鹽度范圍在10～70）[5]。鹽度變化引起的滲透壓對(duì)海藻產(chǎn)生氧化脅迫[6]。大量研究表明：在生長(zhǎng)和光合作用過(guò)程中，大型藻類會(huì)對(duì)其產(chǎn)生影響的單個(gè)或多環(huán)境因素（如，溫度，光照、pH、營(yíng)養(yǎng)及鹽度）協(xié)同作用產(chǎn)生生理響應(yīng)[7-11]。海洋植物對(duì)不利的過(guò)多活性氧（如，過(guò)氧化氫、單態(tài)氧、超氧自由基和羥基等）能快速做出響應(yīng)，并在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生一些物質(zhì)進(jìn)行中和[12]，并且為了適應(yīng)滲透壓脅迫產(chǎn)生一些生理反應(yīng)，如產(chǎn)生一些抗氧化和生理調(diào)節(jié)物質(zhì)（包括可溶性蛋白、脯氨酸、脂質(zhì)和脂肪酸等），通過(guò)這些生理功能和相應(yīng)的行為來(lái)調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害的滲透壓，離子失衡和氧化作用[12-15]。低滲或高滲均能影響細(xì)胞外部的電勢(shì)和細(xì)胞內(nèi)的膨壓、離子分布和有機(jī)質(zhì)的溶解度，過(guò)高或過(guò)低的滲透壓會(huì)影響細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)[16]。通過(guò)增加細(xì)胞膜上脂肪酸飽和度可產(chǎn)生更致密的脂質(zhì)雙分子層以減少小分子滲透[6]。鹽度同樣能對(duì)單細(xì)胞海藻產(chǎn)生脅迫作用[17-18]，如：破壞光合色素，阻礙氮磷等營(yíng)養(yǎng)的利用，抑制藻細(xì)胞的分裂與生長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞氧化而死亡等，影響小球藻工業(yè)化生產(chǎn)。本研究主要研究發(fā)酵過(guò)程中鹽度對(duì)小球藻細(xì)胞生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)、部分氨基酸以及油脂合成的影響，以探索通過(guò)改變鹽濃度調(diào)控小球藻胞內(nèi)組分的實(shí)現(xiàn)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

小球藻藻株Chlorella vugaris C9-JN2010 本實(shí)驗(yàn)室從海水中分離并經(jīng)過(guò)人工選育獲得，保藏于武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（菌種保藏登記號(hào)為CCTCC M 2010373）；種子培養(yǎng)基 BG11培養(yǎng)基[19]（單位mg/L），NaNO31500，MgSO4·7H2O 75，CaCl2·2H2O 36，檸檬酸6，Na2EDTA 1，檸檬酸鐵銨 6，Na2CO320，K2HPO440；微量元素（A5）：ZnSO4·7H2O 0.222，CuSO4·7H2O 0.079，MnCl2·4H2O 1.81，Na2MoO4·2H2O 39，Co（NO3）2·6H2O 0.049，H3BO32.86；發(fā)酵培養(yǎng)基修改BG11培養(yǎng)基：NaNO3和K2HPO4分別為350.0和25.0mg/L，其余成分不變；Nile red Sigma-Aldrich公司；過(guò)硫酸鉀 愛建德固賽（上海）引發(fā)劑有限公司；其余分析用藥品為分析純 上海國(guó)藥集團(tuán)。

YXQ-LS-50S1型立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；ZHWY200B型搖床上海智城分析儀器制造有限公司；DHP-2000型電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市華北實(shí)驗(yàn)有限公司；水平層流凈化工作臺(tái) 蘇州潔凈技術(shù)研究所；分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；F-4600型熒光分光光度計(jì)、U3900型紫外分光光度計(jì) 日立公司；Digestion Unit K-424、Digestion Unit K-35 瑞士BUCHI公司；Digital BuretteⅢ 德國(guó)普蘭德公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 挑取固體平板上培養(yǎng)的藻株至含有1mL dd H2O的2mL離心管中，混合物用槍頭吹打均勻。分別取適量接種于含有50mL BG11液體培養(yǎng)基的100mL三角瓶中，置于恒溫光照搖床中振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為：光照周期為16h：8h，溫度為25℃，pH 7.0，通氣流量為0.1vvm，光照強(qiáng)度4000lux的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)4d。

1.2.2 鹽度實(shí)驗(yàn) 以標(biāo)準(zhǔn)BG11培養(yǎng)基培養(yǎng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小球藻種子液，分別接種于NaCl濃度為0%、1.5%、2.5%、3.5%、4.5%、5.5%裝有400mL培養(yǎng)基的500mL反應(yīng)瓶中，調(diào)整初始pH為7.0，初始接種濃度為吸光值0.5±0.05（D680nm），折合干重約（0.150 ±0.015）g/L，于溫度為（25±1）℃，光強(qiáng)為4000lux，光暗周期為16h：8h條件下，連續(xù)通氣（氣流量為0.1vvm，由底部通入）培養(yǎng)6d。

1.2.3 生物量和生長(zhǎng)速率測(cè)定 培養(yǎng)至一定濃度后取樣，用滅菌雙蒸水進(jìn)行10倍濃度梯度稀釋，用紫外-可見分光光度儀測(cè)定680nm波長(zhǎng)處各稀釋樣品的吸光值，同時(shí)取各稀釋樣品于8000r/min離心10min后，洗滌并將沉淀藻體在80℃恒溫干燥至恒重后測(cè)定藻體干重，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。培養(yǎng)期間每12h取樣一次，用紫外-可見分光光度儀測(cè)定680nm波長(zhǎng)處的吸光值，并建立回歸方程見式1，根據(jù)式1計(jì)算藻生物量；平均比生長(zhǎng)速率見式2。

其中：X1是第一次取樣時(shí)（t1）的生物量，X2是第二次取樣時(shí)（t2）的生物量。

1.2.4 總氮及總磷檢測(cè) 小球藻培養(yǎng)液于10000r/min離心5min后，收集上清液用于總氮（TN）及總磷（TP）含量測(cè)定?？偟捎脡A性過(guò)硫酸鉀消解紫外分光光度法（GB 11894-89，水質(zhì)總氮的測(cè)定）；總磷采用過(guò)硫酸鉀氧化-鉬酸銨分光光度法測(cè)定（GB 11893-89，水質(zhì)總磷的測(cè)定）。

1.2.5 生理參數(shù)的檢測(cè) 葉綠素含量的檢測(cè)以95%的乙醇提取采用分光光度法檢測(cè)[20]。蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用凱氏定氮法[21]，蛋白質(zhì)含量（mg/L）=氮含量（mg/L）×6.38。游離脯氨酸測(cè)定參照文獻(xiàn)[22]的方法。油脂含量采用修改的Nile red法[23]，油脂含量（μg/mL）=0.496X+0.178（R2=0.991）。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析方法 數(shù)據(jù)采用軟件origin進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)所得值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 鹽度對(duì)小球藻的生長(zhǎng)的影響

小球藻培養(yǎng)在不同NaCl濃度培養(yǎng)基中，NaCl濃度對(duì)其生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，結(jié)果見圖1、圖2。小球藻C9-JN2010在淡水中生長(zhǎng)最佳，其生物量、平均比生長(zhǎng)速率及生產(chǎn)效率均最高，分別為0.750g·L-1、0.225d-1和0.125g·L-1·d-1。根據(jù)圖1可知，小球藻在0～96h生長(zhǎng)速度較慢；在96～144h進(jìn)入對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)較快。由圖2可知，隨著鹽濃度升高，鹽對(duì)生長(zhǎng)的抑制越顯著。當(dāng)鹽濃度在0%～2.5%，小球藻可較好地生長(zhǎng)，而鹽濃度達(dá)到5.5%或以上，藻細(xì)胞生長(zhǎng)幾乎停止而死亡。鹽度導(dǎo)致植物細(xì)胞生長(zhǎng)受抑或死亡的主要原因有細(xì)胞外部環(huán)境的滲透壓過(guò)大，導(dǎo)致細(xì)胞大量失水及干擾細(xì)胞膜上的電荷及pH等[6，16]。另外，由于滲透壓的脅迫，引起細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過(guò)多的活性氧化物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，也可導(dǎo)致細(xì)胞死亡[17-18]。

圖1 不同NaCl濃度下小球藻的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curves of Chlorella vulgaris C9-JN2010 cultivated in different concentration of NaCl

圖2 不同NaCl濃度下小球藻生物量和平均比生長(zhǎng)速率Fig.2 Productivity and mean specific growth rate of Chlorella vulgaris C9-JN2010 cultivated in different concentration of NaCl

2.2 藻細(xì)胞中光合色素的變化

培養(yǎng)在不同NaCl濃度的小球藻C9-JN2010，藻細(xì)胞內(nèi)光合色素發(fā)生變化（圖3）。在0%～1.5%鹽濃度范圍內(nèi)，光合色素的含量隨著藻細(xì)胞生長(zhǎng)增加，至96h達(dá)到最高值，分別為39.50、32.80mg·g-1。隨后，色素含量開始下降。當(dāng)鹽度為2.5%，培養(yǎng)至48h光合色素含量與24h相比稍微降低，96h又上升至19.30mg·g-1，與剛開始接種細(xì)胞相當(dāng)，隨后又開始降低。這可能是因?yàn)樵寮?xì)胞在前對(duì)鹽度有一定的適應(yīng)期，并對(duì)產(chǎn)生的脅迫進(jìn)行響應(yīng)。而在3.5%～5.5%NaCl濃度，隨著藻細(xì)胞的生長(zhǎng)，光合色素含量在不斷的降低，至96h已達(dá)到最低分別為4.10、2.30、1.10mg·g-1?？傊S著鹽濃度的升高，小球藻細(xì)胞內(nèi)光合色素含量不斷降低，這與Singh等[24]報(bào)道的結(jié)果一致。Lu等[25]認(rèn)為由于光合系統(tǒng)PⅡ?qū)aCl敏感，導(dǎo)致氧的釋放及二氧化碳固定受抑制，且光合色素對(duì)鹽度的敏感比對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)更強(qiáng)。另外，光合色素的合成需要大量的氮，若氮經(jīng)過(guò)葉綠體光呼吸電子傳遞鏈進(jìn)行利用受阻，導(dǎo)致藻細(xì)胞對(duì)氮的利用受抑制影響細(xì)胞的分裂與生長(zhǎng)[17]。

圖3 NaCl濃度對(duì)小球藻胞內(nèi)光合色素含量的影響Fig.3 Content of chlorophyll in the algal cell cultivated in different concentration of NaCl

2.3 鹽度影響小球藻對(duì)N、P的利用效率

圖4 不同NaCl濃度下小球藻對(duì)氮磷的利用效果Fig.4 Results of consumption of nitrogen and phosphorus by Chlorella vulgaris C9-JN2010 cultivated in different concentration of NaCl

培養(yǎng)在不同NaCl濃度的小球藻C9-JN2010，在停留時(shí)間為144h內(nèi)，隨著生長(zhǎng)的進(jìn)行，對(duì)氮磷的消耗在不斷增加，見圖4a、4c。小球藻在前96h，由于生長(zhǎng)速度較慢，對(duì)氮磷的利用速度也較慢。而在96～144h藻細(xì)胞增長(zhǎng)速度加快，其氮磷的消耗也加快。由圖4b和圖4d可知，在無(wú)NaCl條件下，小球藻對(duì)氮磷的消耗效果最好，培養(yǎng)至144h，培養(yǎng)基中的氮磷濃度分別為3.00、0.23mg·L-1，其氮磷利用率分別為96.4%、93.5%，消耗強(qiáng)度分別達(dá)到9.10、0.71mg·L-1·d-1。隨著NaCl濃度的增加，小球藻的生長(zhǎng)受到不同程度的抑制，導(dǎo)致氮磷的利用效率降低。尤其在5.5%NaCl濃度時(shí)，藻細(xì)胞對(duì)氮磷的利用效率很低，培養(yǎng)基中殘留的氮磷濃度很高，分別為53.80、4.30mg·L-1，其氮磷利用率僅為3.9%、4.4%；其消耗強(qiáng)度分別0.50、0.04mg·L-1·d-1。這是因?yàn)楣夂仙厥艿狡茐?，?xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，導(dǎo)致其對(duì)氮磷等營(yíng)養(yǎng)的攝取受阻。

2.4 鹽度對(duì)蛋白質(zhì)及游離脯氨酸含量的影響

小球藻C9-JN2010培養(yǎng)在不同NaCl濃度，停留時(shí)間為144h，考察NaCl濃度對(duì)蛋白和游離脯氨酸合成的影響（圖5、圖6）。由圖5可知，培養(yǎng)至144h，高鹽度影響藻細(xì)胞的蛋白合成，低NaCl濃度藻細(xì)胞的蛋白含量高，而隨著鹽濃度增加藻細(xì)胞的蛋白含量相應(yīng)降低。在無(wú)鹽培養(yǎng)基中藻蛋白含量最高為55.0%（W），細(xì)胞蛋白質(zhì)生產(chǎn)效率為68.40mg·L-1·d-1，而在5.5%NaCl中蛋白含量最低僅為37.4%，蛋白質(zhì)生產(chǎn)效率為13.80mg·L-1·d-1。本研究發(fā)現(xiàn)藻在低鹽度培養(yǎng)蛋白含量高，與Richmond等[26-27]報(bào)道的結(jié)果一致。

鹽度同樣影響細(xì)胞內(nèi)氨基酸的合成，尤其對(duì)游離脯氨酸的影響非常顯著，見圖6。在無(wú)鹽（0%）和高鹽濃度（3.5%～5.5%）下，脯氨酸隨著藻細(xì)胞生長(zhǎng)而增長(zhǎng)較慢，在48h脯氨酸含量達(dá)到最高值，且均較低，約為0.10%～0.17%。在無(wú)NaCl時(shí)，脯氨酸含量最低僅為0.1%左右。而在1.5%和2.5%NaCl濃度時(shí)，脯氨酸隨著藻細(xì)胞生長(zhǎng)而增長(zhǎng)較快，分別在48、96h達(dá)到最高，為1.55%（W）、2.25%（W），隨后開始下降。主要原因可能是藻細(xì)胞適應(yīng)了低鹽度環(huán)境后，以脯氨酸作為氮源和能源物質(zhì)加以利用而繼續(xù)生長(zhǎng)，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)其含量在后期開始下降。脯氨酸含量最高與最低之比超過(guò)20.0倍。有關(guān)鹽度對(duì)小球藻中脯氨酸含量的影響報(bào)道較少，為目前報(bào)道的最高比值。該藻在2.5%NaCl濃度時(shí)脯氨酸積累最多，鹽度過(guò)高或過(guò)低都影響脯氨酸的積累。Gzik[28]利用不同濃度NaCl處理甜菜發(fā)現(xiàn)葉子中脯氨酸含量在4.0mol/L NaCl濃度最高，且是對(duì)照的12.0倍左右。鹽脅迫小球藻通過(guò)Glu途徑積累脯氨酸的含量除取決于活性上升外，Kalinina等證實(shí)鹽脅迫下海水小球藻胞內(nèi)脯氨酸迅速積累還與光呼吸乙醇酸途徑的激活和Glu脫氫酶的活化有關(guān)。曾有報(bào)道，許多植物在鹽脅迫下，細(xì)胞內(nèi)脯氨酸大量積累。其除作為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)外，在穩(wěn)定生物大分子結(jié)構(gòu)、降低細(xì)胞酸性、解除氨毒和能量庫(kù)調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原勢(shì)等起重要作用[29]。Kiyosue等[30]研究了鹽脅迫下的擬南芥葉和根中脯氨酸合成關(guān)鍵酶基因，發(fā)現(xiàn)P5CR基因的轉(zhuǎn)錄的mRNA提高了5.0倍和2.0倍，P5CS基因mRNA水平提高十倍以上。關(guān)于微生物的鹽脅迫下胞內(nèi)脯氨酸積累的報(bào)道較少。另有報(bào)道，高鹽處理某些耐鹽藻類并沒(méi)有明顯提高胞內(nèi)脯氨酸含量[31]?？赡苓@些耐鹽藻以其他的生理物質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)滲透壓。也有研究發(fā)現(xiàn)，在低鹽和高鹽條件下Ulva pertusa和G.tenuistipitata均能大量積累脯氨酸[32-33]?？赡懿煌宸N具有不同生理特性，對(duì)抗鹽脅迫所需的生理物質(zhì)不同而導(dǎo)致了此種差異。

圖5 不同NaCl濃度處理小球藻C9-JN2010細(xì)胞的蛋白含量及生產(chǎn)效率Fig.5 Content and productivity of protein from the algae biomass cultivated in different concentration of NaCl

圖6 不同NaCl濃度處理的小球藻C9-JN2010細(xì)胞脯氨酸含量Fig.6 Content of proline from the algae biomass cultivated in different concentration of NaCl

2.5 鹽度對(duì)油脂含量的影響

圖7 小球藻C9-JN2010在不同NaCl濃度處理的細(xì)胞油脂含量Fig.7 Content of lipid from the algae biomass cultivated in different concentration of NaCl

小球藻C9-JN2010培養(yǎng)在不同NaCl濃度，停留時(shí)間為144h，發(fā)現(xiàn)NaCl濃度對(duì)油脂合成有顯著影響（圖7）。在0.0%～2.5%NaCl濃度，隨著鹽濃度的升高，藻細(xì)胞內(nèi)油脂含量明顯上升（4.2%～15.5%），且在2.5%NaCl濃度時(shí)，油脂含量最高達(dá)到15.5%（W），其生產(chǎn)效率為16.10mg·L-1·d-1。而當(dāng)NaCl濃度超過(guò)2.5%時(shí)，藻細(xì)胞內(nèi)油脂含量則隨著鹽濃度的升高不斷降低。在未添加NaCl的培養(yǎng)基中，藻細(xì)胞內(nèi)油脂含量最低僅為4.2%（W），其生產(chǎn)效率也最低為3.33mg·L-1·d-1（圖7）。藻細(xì)胞油脂最高與最低值之比約3.6。適當(dāng)增加鹽度有利于藻油脂的積累[34-35]，本研究也支持其觀點(diǎn)。Harwatia等[36]報(bào)道0.0%～2.0%鹽度處理熱帶淡水藻Chlorococcum sp.，在2.0%鹽濃度處理下油脂含量最高，其油脂含量的最高與最低值之比約為3.0。鹽處理植物能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)總油脂的顯著增加[37]。

3 結(jié)論

在未加NaCl的培養(yǎng)基中小球藻C9-JN2010生長(zhǎng)最佳，生物量、光合色素含量、比生長(zhǎng)速率和生產(chǎn)效率均達(dá)最大為0.75g·L-1、39.50mg·g-1、0.225d-1和0.125g·L-1·d-1。藻蛋白含量最高為55.0%（W），其生產(chǎn)效率為68.40mg·L-1·d-1，且小球藻對(duì)氮磷的利用效率也高至96.4%及93.5%，其利用強(qiáng)度分別為9.10mg·L-1·d-1和0.71mg·L-1·d-1。

當(dāng)藻細(xì)胞培養(yǎng)在2.5%NaCl濃度下，在96h脯氨酸含量達(dá)最高為2.25%（W），其最高（在2.5%NaCl）與最低值（在0.0%NaCl）之比約20.0倍。脯氨酸是該小球藻對(duì)鹽脅迫的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)。有關(guān)Chlorella vulgaris細(xì)胞中游離脯氨酸對(duì)鹽濃度的響應(yīng)機(jī)理有待進(jìn)一步研究。藻細(xì)胞內(nèi)油脂含量在144h達(dá)最高為15.5%（W），其生產(chǎn)效率為16.10mg·L-1·d-1，油脂含量的最高與最低值之比約為3.6。

在耐鹽植物中，細(xì)胞內(nèi)積累甘油酯往往與鹽度脅迫耐受力有關(guān)[38]。本研究表明，以獲取微藻蛋白質(zhì)為目的，可通過(guò)低鹽度培養(yǎng)；以獲取脯氨酸為目的，則可提高鹽濃度至適中，大幅度提高胞內(nèi)游離脯氨酸含量；5.0%鹽濃度下，則能提高微藻油脂含量甚至脂肪酸組成比例。發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程中可通過(guò)改變鹽濃度調(diào)控微藻生理代謝支流，以達(dá)到增強(qiáng)胞內(nèi)主要營(yíng)養(yǎng)組分合成的目的。

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