長鏈非編碼RNA H 19對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的影響*

章杰 李文芳 王芳 楊紅華 萬蕓 劉偉

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 江西南昌 330006）

長鏈非編碼RNA H 19對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的影響*

章杰 李文芳#王芳 楊紅華 萬蕓 劉偉

（南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院 江西南昌 330006）

目的：探討長鏈非編碼RNA H19在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)情況及對瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制。方法：本次實驗共收集8例瘢痕疙瘩患者組織標(biāo)本，對照組取自8例成熟皮膚、8例成熟瘢痕，通過RT-PCR法檢測長鏈非編碼RNA H19的表達(dá)；對體外培養(yǎng)的人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，首先采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的scramble siRNA、H19 siRNA、陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，驗證H19 siRNA的轉(zhuǎn)染效率；MTT法檢測轉(zhuǎn)染H19 siRNA后成纖維細(xì)胞的增殖，Westing blotting檢測轉(zhuǎn)染后血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelialgrow th factor,VEGF）和雷帕霉素靶蛋白(mammalian targetof rapamycin,mTOR)的表達(dá)。結(jié)果：與對照組相比，H19mRNA的表達(dá)量在瘢痕疙瘩患者中明顯升高（P<0.05）；與scramblesiRNA、陰性對照siRNA相比，轉(zhuǎn)染48 h后H19 siRNA轉(zhuǎn)染的成纖維細(xì)胞H19mRNA表達(dá)量明顯降低（P<0.05）；與空白對照組（轉(zhuǎn)染時不加siRNA和脂質(zhì)體）和陰性對照組siRNA組相比，使用H19的siRNA轉(zhuǎn)染后，成纖維細(xì)胞的增殖明顯受到抑制，mTOR和VEGF的表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）。結(jié)論：下調(diào)非編碼長鏈RNA H19的表達(dá)量可以抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖。

瘢痕疙瘩；長鏈非編碼RNAH 19；增殖

#通訊作者：李文芳，E-mail：wenfanglee@126.com

瘢痕疙瘩（Keloid,KD）是特殊體質(zhì)發(fā)生的一種纖維組織增生，是整形外科常見的疾病，近年大量研究結(jié)果表明瘢痕疙瘩的發(fā)病機(jī)制與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、基因和細(xì)胞因子密切相關(guān)[1]。成纖維細(xì)胞是瘢痕疙瘩組織的主要效應(yīng)細(xì)胞，主要病理特點是過度增生、凋亡障礙及分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)[2]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類長度在200～100 000 nt的RNA分子，本身不編碼蛋白質(zhì)，大量研究表明lncRNA參與了轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾和核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程[3]。長鏈非編碼RNA H19在多種腫瘤中異常表達(dá)，且具有原癌活性，敲除H19后，腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲能力顯著降低[4]，鑒于H19在基因表達(dá)及腫瘤方面的獨(dú)特作用，有理由推測，其與瘢痕疙瘩也有著必然的聯(lián)系。然而，迄今為止對于H19是否在瘢痕疙瘩組織中異常表達(dá)尚不明確，本文首先通過RT-PCR檢測患者瘢痕疙瘩組織中H19的mRNA表達(dá)情況，然后通過體外培養(yǎng)、siRNA轉(zhuǎn)染干擾技術(shù)探索H19與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 病例收集 收集2006年5月～2013年6月在我院就診的8例瘢痕疙瘩患者組織標(biāo)本，患者術(shù)前無藥物治療史，術(shù)前均經(jīng)患者知情和同意，該試驗方案均經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)，術(shù)后病理證實為瘢痕疙瘩。對照組取自8例成熟皮膚、8例成熟瘢痕，所取部位與瘢痕疙瘩基本相近。

1.2 成纖維細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及分組 將切除的新鮮標(biāo)本用生理鹽水漂洗3次，去除上皮，切成2 mm×2mm大小的組織塊，平鋪在無菌培養(yǎng)瓶上，加入0.5m L培養(yǎng)液，放入37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，繼續(xù)加入5m L培養(yǎng)液及少量血清培養(yǎng)。3～4 d換液一次，當(dāng)培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞長滿瓶底后，用PBS漂洗，0.25%胰蛋白酶消化，傳代，加入新鮮的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，取經(jīng)過3次傳代培養(yǎng)的細(xì)胞用于本實驗研究。體外研究H19與增殖關(guān)系的實驗設(shè)計：實驗分為三組，空白組（轉(zhuǎn)染時不加siRNA和脂質(zhì)體）；陰性對照組（加入陰性對照siRNA與脂質(zhì)體復(fù)合物）；H19 siRNA轉(zhuǎn)染組（轉(zhuǎn)染時加入H19 siRNA的質(zhì)粒）。

1.3 脂質(zhì)體介導(dǎo)的siRNA干擾 采用脂質(zhì)體介導(dǎo)的scramble siRNA、H19 siRNA、陰性對照siRNA轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染效率的鑒定，陰性對照siRNA與目的基因的序列無同源性，GAPDH作為內(nèi)參。H19的siRNA為三種siRNA的混合物包括三種：H19-siRNA1，5’-CCAACAUCA AAGACACCAUd-TdT-3’；H19-siRNA2，5’-GCAG GACAUGACAUGGUCCdTdT-3’；和 H19-siRNA3，5’-UAAGUCAUUUGCACUGGU UdTdT-3’[5]。待細(xì)胞生長到60%～80%融合時，按scramble siRNA、H19 siRNA轉(zhuǎn)染試劑的說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染。每組設(shè)8個復(fù)孔，轉(zhuǎn)染后用轉(zhuǎn)染試劑于37℃在培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 h后。每孔中加入含有20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)至24 h，更換為新鮮含10%血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后收集細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.4 RT-PCR檢測lncRNA的mRNA表達(dá) 瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)染1 d后收集細(xì)胞，按RNA分離試劑盒說明進(jìn)行分析所提取總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作根據(jù)說明書進(jìn)行。利用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測各組lncRNAH19的表達(dá)，GAPDH作為內(nèi)參，定量分析各電泳條帶的光密度，RT-PCR產(chǎn)物以各組細(xì)胞目的基因與GAPDH的光密度比值進(jìn)行比較，每組樣本檢測8次?；颊咝迈r組織標(biāo)本每個樣取100mg進(jìn)行提取mRNA，之后步驟如上。

1.5 Westing blotting檢測轉(zhuǎn)染后成纖維細(xì)胞VEGF和mTOR的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，使用蛋白提取試劑盒（碧云天）提取蛋白，所有操作按照說明書進(jìn)行。Bradford法定量后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，使用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗過夜，血管內(nèi)皮生長因子 (vascular endothelial grow th factor,VEGF）、雷帕霉素靶蛋白 (mammalian target of rapamycin,m TOR)和caspase-3抗體均購自美國santa cruz公司，洗膜，HRP標(biāo)記的二抗（康為世紀(jì)）室溫孵育1 h，洗膜后，ECL顯色。Image J軟件灰度分析結(jié)果，GAPDH（santa cruz）作為內(nèi)參。

1.6 MTT法檢測瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖 用胰蛋白酶將處于對數(shù)生長期的成纖維細(xì)胞消化，制成細(xì)胞濃度為1×104個/m L的細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞懸液100μL。分別用質(zhì)粒感染，每組設(shè)8個副孔，分別培養(yǎng)至12、24及48 h后加入MTT（5mg/m L）20μL繼續(xù)培養(yǎng)，終止培養(yǎng)后，吸棄孔內(nèi)上清，每孔加入150μLDMSO，震蕩使晶體充分溶解，酶標(biāo)儀上檢測波長為490 nm的吸光值。

1.7 統(tǒng)計分析 數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±S)表示，比較采用單因素方差分析和t檢驗，兩兩之間的比較采用LSD-t檢驗，P<0.05定義為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 長鏈非編碼RNAH19在正常組織與瘢痕疙瘩組織中的表達(dá) 長鏈非編碼RNA H19的mRNA水平在正常皮膚與成熟纖維組織中表達(dá)水平較低，而在瘢痕疙瘩組織中表達(dá)明顯升高，與前兩者相比有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。見表1。

表1 三種組織中H19mRNA表達(dá)量 (±S)

表1 三種組織中H19mRNA表達(dá)量 (±S)

注：與正常皮膚、成熟瘢痕組織相比，*P<0.05。

正常皮膚組織 成熟瘢痕組織 瘢痕疙瘩組織0.21 0.11 0.09 0.14 0.23 0.22 0.15 0.23 0.1725±0.05676 0.22 0.12 0.23 0.09 0.12 0.21 0.32 0.27 0.1975±0.08067 0.86*0.75*0.65*0.14*0.96*0.75*0.34*0.79*0.6550±0.27670*

2.2 鑒定轉(zhuǎn)染后干擾效率 鑒定轉(zhuǎn)染后干擾效率，與 scramble siRNA、陰性對照siRNA相比，H19 siRNA轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞H19mRNA表達(dá)量明顯降低，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。見表2。

表2 三種組織中成纖維細(xì)胞H19mRNA表達(dá)量 (±S)

表2 三種組織中成纖維細(xì)胞H19mRNA表達(dá)量 (±S)

注：與scramble siRNA、陰性對照siRNA相比，*P<0.05。

陰性對照組siRNA scramble siRNA H19 siRNA 0.42 0.60 0.70 0.63 0.64 0.32 0.85 0.86 0.6280±0.1880 0.53 0.40 0.60 0.91 0.43 0.65 0.22 0.92 0.5825±0.2440 0.01*0.05*0.09*0.06*0.01*0.02*0.03*0.01*0.0350±0.0293*

2.3 轉(zhuǎn)染后成纖維細(xì)胞增殖的變化 與空白對照組相比，H19 siRNA轉(zhuǎn)染后的成纖維細(xì)胞增殖在12、24和48 h內(nèi)明顯受抑制，統(tǒng)計學(xué)差異顯著（P<0.05）。見表 3。

表3 轉(zhuǎn)染后成纖維細(xì)胞增殖的變化 (±S)

表3 轉(zhuǎn)染后成纖維細(xì)胞增殖的變化 (±S)

空白組（OD值） 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（OD值） t P值12 h 24h 48 h 0.1982±0.0279 0.2563±0.05127 0.3143±0.0984 0.1421±0.0153 0.2015±0.0281 0.2312±0.0315 20.03 3.25 2.79＜0.01＜0.01＜0.05

2.4 轉(zhuǎn)染后成纖維細(xì)胞的Stat3和mTOR的變化與空白組和陰性對照組相比，H19 siRNA轉(zhuǎn)染組的VEGF和mTOR表達(dá)水平明顯降低，有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。見表 4、表 5。

表4 三種組織中VEGF表達(dá)水平 (±S)

表4 三種組織中VEGF表達(dá)水平 (±S)

注：與空白組和陰性對照組相比，*P<0.05。

空白組 陰性對照組 H19 siRNA轉(zhuǎn)染組0.96 0.91 1.12 0.89 0.87 0.950±0.1007 0.87 1.13 0.86 0.92 0.89 0.934±0.1119 0.36*0.49*0.34*0.28*0.31*0.356±0.0808*

表5 三種組織中mTOR表達(dá)水平 (±S)

表5 三種組織中mTOR表達(dá)水平 (±S)

注：與空白組和陰性對照組相比，*P<0.05。

空白組 陰性對照組 H19 siRNA轉(zhuǎn)染組0.72 0.61 0.49 0.69 0.54 0.610±0.09721 0.65 0.79 0.56 0.60 0.57 0.634±0.09397 0.12*0.19*0.27*0.11*0.23*0.184±0.06914*

3 討論

本研究結(jié)果首次證實長鏈非編碼RNA H19在瘢痕疙瘩組織中的表達(dá)異常升高，以往研究表明病理性瘢痕疙瘩的發(fā)生與多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常有關(guān)，其中原癌基因c-Myc和轉(zhuǎn)錄因子E2F1在瘢痕疙瘩組織中發(fā)揮重要作用，原癌基因c-M yc與細(xì)胞增殖、分化關(guān)系密切，主要作用機(jī)制是通過編碼生長因子、受體和細(xì)胞內(nèi)信息傳遞物質(zhì)調(diào)控細(xì)胞的生長增殖與分化，c-M yc蛋白的表達(dá)在疙瘩成纖維組織中明顯升高[6]。最近一項研究表明c-Myc可以誘導(dǎo)ln RNA H19的表達(dá)[7]。E2F1蛋白在瘢痕疙瘩組織中表達(dá)水平較正常皮膚組織明顯升高[8～9]，它在成纖維細(xì)胞的分化、增殖或表型轉(zhuǎn)化及膠原合成中發(fā)揮重要的作用。此外，研究同時證實E2F1可以誘導(dǎo)H19的表達(dá)[10]。因此，我們推測瘢痕疙瘩組織中成纖維細(xì)胞可能通過c-Myc及E2F1調(diào)控H19的表達(dá)，從而在瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖中發(fā)揮重要作用。

mTOR是哺乳動物雷帕霉素的靶蛋白，P70S6k是核糖體40s小亞基S6K蛋白激酶，通過磷酸化S6蛋白激酶5’TOPmRNA的翻譯起始，5’TOPmRNA翻譯的產(chǎn)物控制包括大部分的翻譯元件成分，而翻譯元件在有絲分裂原刺激引起的細(xì)胞生長、增殖過程中發(fā)揮關(guān)鍵的作用[11]。抑制m TOR活性可以使下游的P70S6K和4E-BP1磷酸化受阻，阻止真核起始因子eIF-4E的釋放和轉(zhuǎn)錄，抑制細(xì)胞生長增殖。研究證實mTOR/P70S6k信號途徑是瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制中的重要參與者，抑制m TOR的活性可以抑制疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖[12]。本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)H19基因可以明顯降低m TOR的表達(dá)量，提示H19可能通過m TOR信號通路控制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是新生血管形成中重要的血管內(nèi)皮細(xì)胞刺激因子[13]，在正常人體內(nèi)分布廣泛，生理情況下表達(dá)水平較低，在一些病理情況下如腫瘤組織中過量表達(dá)，主要作用是促進(jìn)血管生成增加血供以及促進(jìn)損傷組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)。VEGF過表達(dá)是瘢痕疙瘩形成及發(fā)展的重要因素[14～15]，抑制瘢痕疙瘩中VEGF的產(chǎn)生可以減少新生血管的數(shù)量，從而顯著抑制瘢痕疙瘩的生長[16]。以往研究證實VEGF在疙瘩組織中的全層均有表達(dá)，但主要由角朊細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生。本研究發(fā)現(xiàn)降低H19的表達(dá)量可以顯著抑制VEGF的生成，從而抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖，表明H19是成纖維細(xì)胞生成VEGF的重要調(diào)節(jié)因子。

綜上所述，H19的過量表達(dá)與瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖密切相關(guān)，下調(diào)H19的表達(dá)可以抑制m TOR和VEGF的產(chǎn)生，從而抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖，提示H19可以作為瘢痕疙瘩治療的一個新靶點。

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Objective:To investigate the effectof long non-coding RNA H19 on proliferation of human keloid fibroblasts and the possible role of themechanisms underlying keratinocyte proliferation.Methods:The sampleswere collected from 24 patients,in which were 8 w ith keliods,8 with normal scars and 8 w ith normal skin control.The H19 expression level in human keloid fibroblasts,normal scars and normal skin were determ ined by RT-PCR.H19-siRNA,scramble siRNA and control siRNA mediated by lipfectam in were introduced into human keloid fibroblasts,respectively.The silencing effect of H19 was verified by RT-PCR.An effect of H19 on cell proliferation was investigated by MTT colorimetric assay.To evaluate which signaling mediators were regulated by H19 in keloid fibroblast,the expression ofmammalian target of rapamycin(m TOR)and vascular endothelial grow th factor(VEGF)were tested by western blot.Results:The data showed that H19 levels were markedly increased in human keloids?broblasts compared with normal controls（P<0.05）.Forty-eighthoursafter transfection,mRNA expression of H19 in H19 siRNA treated cellswas remarkedly reduced as compared with those in the scramble siRNA and control siRNA treated cells(P<0.05).H19 siRNA treatment obviously inhibit the proliferation of Keloid Fibroblasts(P<0.05).The study further veri?ed that H19 was associated w ith m TOR and VEGF,and that this association resulted in the proliferation of human keloids?broblasts.Conclusion:These data suggest that down-regulating the expression ofH19 strongly suppressed cellproliferation ofkeloid fibroblasts.

Keloid;IncRNA H19;Proliferation

江西省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目資助（編號GJJ13153）

R 622

B

10.3969/j.issn.1671-4040.2013.09.001

2013-10-08）