膠體金免疫層析法快速檢測(cè)食品中慶大霉素殘留

楊 俊，余曉峰，周偉偉，李紅衛(wèi)，王開萍，劉國(guó)慶，*

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥230009;2.安徽出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，安徽合肥230022)

慶大霉素(Gentamicin，GM)屬于氨基糖苷類抗生素，主要作用于革蘭氏陰性細(xì)菌，是一種應(yīng)用廣泛的廣譜抗菌藥物［1］。由于其抗菌譜廣、療效佳，且價(jià)格低廉而被廣泛用于畜禽飼料中。GM的血清有效濃度與毒性濃度很相近，安全范圍較小，在其應(yīng)用過程中易產(chǎn)生毒副作用，食品中的過量殘留會(huì)對(duì)食品安全造成嚴(yán)重威脅［2］。慶大霉素的毒性主要表現(xiàn)為損害人體器官前庭和耳蝸神經(jīng)，導(dǎo)致眩暈和聽力減退［3］。此外，還會(huì)引起耳毒性和腎毒性［4］。慶大霉素殘留理化分析檢測(cè)方法主要有氣相色譜法(GC)［5］、高效毛細(xì)管電泳法(HPLE)［6］、高效液相色譜法(HPLC)［7］、液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用分析法(LC/MS)［8］等，但這些分析檢測(cè)方法對(duì)樣品前處理的要求非常高，而且檢測(cè)設(shè)備非常昂貴。而以抗原與抗體的特異性反應(yīng)結(jié)合為基礎(chǔ)的免疫學(xué)方法具有快速、靈敏、特異性高等特點(diǎn)，是殘留檢測(cè)的有效方法。目前應(yīng)用于抗生素檢測(cè)的免疫分析方法有放射免疫測(cè)定法(RIA)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)、底物標(biāo)記熒光免疫測(cè)定法(SLFIA)、固相免疫傳感器法(SIS)和膠體金免疫層析法(GICA)。目前尚未見到慶大霉素膠體金層析檢測(cè)方法的研究報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)通過制備慶大霉素的單克隆抗體，建立以膠體金免疫層析技術(shù)［9－10］為基礎(chǔ)的食品中慶大霉素殘留快速檢測(cè)方法，該方法的建立為食品中其他藥物殘留的快速檢測(cè)提供有利的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)品、四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品、鏈霉素標(biāo)準(zhǔn)品、卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品 上海生工生物工程有限公司;氯金酸(HAuCl4·4H2O)、檸檬酸三鈉、牛血清白蛋白(BSA)、聚乙二醇(PEG20000)海藻糖、Tween20 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;慶大霉素單克隆抗體、慶大霉素偶聯(lián)抗原、慶大霉素ELISA酶聯(lián)免疫試劑盒北京博奧森生物技術(shù)有限公司;硝酸纖維素膜(NC膜)、玻璃纖維、樣品墊、吸水紙、羊抗兔二抗 上海捷一生物技術(shù)有限公司。

721E型紫外可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;H800型透射電鏡顯微鏡 日本日立公司;PHSCAN10型pH計(jì) METER公司;MA型磁力攪拌器 德國(guó)Electromantle公司;QL－20G－Ⅱ型高速冷凍離心機(jī) Sigma公司;JY－EQ03型連續(xù)式劃膜儀、JY－EQ04型噴金機(jī) 上海杰一生物有限公司;SUNRISE酶標(biāo)定量檢測(cè)儀 奧地利SUNRISE有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 膠體金顆粒的制備 玻璃器皿的洗滌［11］:實(shí)驗(yàn)用所有玻璃器皿先用自來水沖洗干凈，再用重鉻酸鉀洗液(1000g重鉻酸鉀，2500mL濃硫酸，加蒸餾水至10000mL)浸泡48h，取出，大量自來水沖洗，洗潔精洗滌，蒸餾水沖洗3遍，蒸餾水浸泡24h后用去離子水沖洗三次，烘箱烘干后備用。

試劑的配制要求:所有配制試劑用水為雙蒸水或三蒸水，用0.22μm微孔濾膜過濾后使用。

準(zhǔn)確稱取1g氯金酸溶于100mL雙蒸水中配成1%氯金酸溶液，然后將5mL 1%氯金酸溶液加入495mL超純水配制成0.01%氯金酸溶液，取100mL 0.01%氯金酸在電磁爐上加熱煮沸后立即加入2.4mL 1%檸檬酸三鈉溶液，溶液的顏色由黃色→紫色→深藍(lán)→酒紅色，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥该鞯木萍t色時(shí)，繼續(xù)回流8min后停止加熱，冷卻至室溫，4℃低溫貯存。

1.2.2 膠體金的電鏡觀察和紫外掃描 將制備好的膠體金分別進(jìn)行電鏡觀察和紫外掃描，測(cè)量其顆粒大小和最大吸收波長(zhǎng)［12］。

1.2.3 金標(biāo)抗體的制備［13］取10mL膠體金溶液，用0.2mol/L K2CO3調(diào)pH為9.0，用磁力攪拌器攪拌均勻。于事先確定的最佳標(biāo)記量將抗體逐滴加入與膠體金偶聯(lián)，常溫?cái)嚢?0min，然后逐滴加入10%BSA至終濃度為1%，攪拌反應(yīng)30min，最后逐滴加入10%PEG20000至終濃度為1%，繼續(xù)攪拌30min。在4℃，2000r/min離心20min，取上清液于10000r/min離心50min，吸去上清液。然后用重懸液(含質(zhì)量濃度為 0.5%0.01mol/L pH7.4 PBS，0.5%BSA，1% 海藻糖，體積濃度為0.1%Tween20)將沉淀恢復(fù)到原體積，于4℃，10000r/min離心50min，重復(fù)離心3次，最后重懸至原體積的1/10，加入0.01%的疊氮鈉于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 試紙條的組裝 用連續(xù)式劃膜儀把0.5mol/L的GM－BSA及羊抗兔IgG噴于硝酸纖維素薄膜(NC膜)上，分別作為檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線)，37℃烘干。然后將其浸入NC膜處理液(含質(zhì)量濃度為 6% 的蔗糖，1% 海藻糖，0.1%Tween20，0.5%0.01mol/L pH7.4 PBS)中30min，37℃烘干。用同樣方法把將制備好的0.5mol/L膠體金單克隆抗體噴于金標(biāo)抗體結(jié)合墊上。將NC膜貼于PVP紙板上;將吸水紙壓在NC膜上方約1mm處貼于PVP紙板上;將金標(biāo)結(jié)合墊壓在NC膜下方約1mm處貼在PVP底板上;將樣品墊壓住金標(biāo)結(jié)合墊，留出金標(biāo)結(jié)合墊約2mm貼于PVP底板上。最后用切片機(jī)裁剪為3mm寬的試紙條放入加有干燥劑的鋁箔袋內(nèi)密封保存。

1.2.5 試紙條的檢測(cè)方法 將試紙條的樣品墊浸入待測(cè)樣品中，樣品液在毛細(xì)作用下自下往上泳動(dòng)，金標(biāo)結(jié)合墊上的金標(biāo)抗體溶解于樣品液中，若樣品中不含待測(cè)物，則金標(biāo)抗體會(huì)在檢測(cè)線和NC膜上的包被抗原發(fā)生免疫反應(yīng)，使膠體金顆粒發(fā)生聚集形成紅色的線條，剩余的金標(biāo)抗體會(huì)繼續(xù)向上泳動(dòng)，與控制線上的羊抗兔二抗發(fā)生第二次免疫反應(yīng)，也會(huì)出現(xiàn)紅色線條，這樣NC膜上就出現(xiàn)了兩條紅色線條，表明樣品為陰性。若樣品中含待測(cè)物，則當(dāng)樣品液泳動(dòng)到結(jié)合墊時(shí)，金標(biāo)抗體首先會(huì)與樣品中的待測(cè)物發(fā)生免疫反應(yīng)，若金標(biāo)抗體有剩余，才會(huì)在檢測(cè)線上與包被抗原發(fā)生免疫反應(yīng)，形成紅色線條，線條顏色強(qiáng)度會(huì)明顯弱于陰性的線條強(qiáng)度;若金標(biāo)抗體沒有剩余，則不會(huì)與檢測(cè)線上的包被抗原發(fā)生反應(yīng)，沒有紅色線條出現(xiàn)。控制線是作為檢驗(yàn)金標(biāo)免疫層析方法是否有效的指標(biāo)而設(shè)定的，無論待測(cè)樣品中是否存在待測(cè)物，控制線都會(huì)顯色。如果控制線不顯色，說明試紙條失效［14］。

圖1 試紙條示意圖Fig.1 Sketch map of an IC strip

1.2.6 試紙條的靈敏度和檢測(cè)范圍 配制標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度 0、0.5、0.7、0.9、1.0、5.0、10、20、100μg/mL 的待測(cè)液，將試紙條分別插在10mL待測(cè)溶液中，10min取出試紙條觀察陰性和陽(yáng)性結(jié)果，每個(gè)濃度重復(fù)5次。如果C線和T線亮度基本一致則說明是陰性結(jié)果;如果C線明顯比T線亮則說明是陽(yáng)性結(jié)果;如果兩條線都沒出現(xiàn)則說明試紙條失效。

1.2.7 試紙條的穩(wěn)定性和重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 將試紙條密封分別存放在4、25、37℃環(huán)境中，觀察不同溫度對(duì)試紙條的影響。每隔3d取出不同溫度下的試紙條4支分別檢測(cè) 0、5、10、100μg/mL 的 GM 待測(cè)液，持續(xù)30d，查看其穩(wěn)定性。對(duì)同一批次的試紙條以及不同批次的試紙條在不同GM濃度下測(cè)試，每個(gè)濃度設(shè)置10個(gè)重復(fù)，檢查其一致性。

1.2.8 試紙條的特異性實(shí)驗(yàn) 分別配制0、0.5、1.0、2.0、5.0μg/mL的四環(huán)素、鏈霉素、卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用試紙條檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)實(shí)驗(yàn)5次，判斷試紙條的特異性。

表1 慶大霉素試紙條的靈敏度檢測(cè)Table 1 Sensitivity of GM test strip

1.2.9 檢測(cè)樣品 稱取1.0g豬肉4份，均質(zhì)后轉(zhuǎn)入4個(gè) 50mL 的離心管中(編號(hào)為1、2、3、4 號(hào))，每一管分別加入5mL的去離子水，然后在1號(hào)管中加入50μg GM－PBS(500μg/mL，100μL)，2 號(hào)管中加入 5μg GM－PBS(500μg/mL，100μL)，3 號(hào)管中加入5μg GM－PBS(500μg/mL，100μL)，4 號(hào)管中加入 100μL 去離子水，渦旋30s。加入3%三氯乙酸6mL，2500r/min振蕩1min?；靹蚝?，5000r/min離心10min。避開上層脂肪層，取150μL清液于2min離心管中，加入PBS緩沖液，用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH到7.4，即為樣品檢測(cè)液。分別加入50μL于試紙條檢測(cè)孔中，每個(gè)重復(fù)3次，10min判定結(jié)果。同時(shí)用ELISA方法進(jìn)行對(duì)比［15－16］。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金的質(zhì)量分析結(jié)果

將制備好的膠體金經(jīng)紫外可見光分光光度計(jì)在425～675nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，以超純水做參比，在518nm處有最大吸收峰，OD值為2.353，見圖2。膠體金溶液經(jīng)20000倍透射電鏡放大觀察結(jié)果顯示，制備的膠體金呈球形顆粒，而且分散均勻，隨機(jī)測(cè)量60個(gè)顆粒，直徑均在20nm左右，表明制備的膠體金顆粒良好，見圖3。

圖2 膠體金紫外可見光分光光度計(jì)掃描圖Fig.2 Determination of colloidal gold by spectrophotometry

2.2 試紙條的測(cè)試結(jié)果

2.2.1 試紙條的靈敏度結(jié)果 用試紙條分別測(cè)試濃度為0、0.5、0.7、0.9、1.0、5.0、10、20、100μg/mL 的慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)液，從圖4可以看出，慶大霉素濃度為0.5μg/mL時(shí)，T線和C線均顯色為陰性;當(dāng)慶大霉素濃度為0.7μg/mL時(shí)，T線顏色變淡為弱陽(yáng)性;當(dāng)慶大霉素濃度為0.9μg/mL時(shí)，T線顏色基本消失為陽(yáng)性;當(dāng)慶大霉素濃度大于0.9μg/mL時(shí)，T線徹底消失為強(qiáng)陽(yáng)性;測(cè)試結(jié)果列表1如下。由此說明，該試紙條的靈敏度為0.7μg/mL。

圖3 膠體金透射電鏡圖Fig.3 Determination of colloidal gold by transmission electron microscope

圖4 標(biāo)準(zhǔn)品GM在不同濃度下C/T的顏色變化Fig.4 GM standards in different concentrations showing the color intensity of test and control lines

2.2.2 試紙條的穩(wěn)定性結(jié)果 在4、25、37℃環(huán)境中放置30d的試紙條分別測(cè)試濃度為0μg/mL的慶大霉素標(biāo)準(zhǔn)液，發(fā)現(xiàn)C線和T線顯色效果明顯，試紙條的檢測(cè)效果變化不大，這說明溫度對(duì)試紙條的影響不大，而且試紙條至少可以在不高于37℃的條件下保存一個(gè)月而不失效。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同一批次的3個(gè)平行試紙條在不同GM標(biāo)準(zhǔn)液濃度下的測(cè)試結(jié)果大體一致，隨機(jī)抽取相同GM濃度不同批次5組試紙條測(cè)試結(jié)果對(duì)比也無明顯的差異，說明試紙條重復(fù)性較好。以上是基于重復(fù)10次后得出的結(jié)果，證明該試紙重復(fù)性良好。

2.2.3 試紙條的特異性結(jié)果 試紙條分別測(cè)試濃度為1.0μg/mL的慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素、卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)試結(jié)果如圖6。測(cè)試濃度為1.0μg/mL的慶大霉素時(shí)，C線顯色，T線不顯示，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性;測(cè)試其他三種標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，C線和T線均顯色，檢測(cè)結(jié)果為陰性。進(jìn)一步測(cè)試濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、5.0μg/mL的四環(huán)素、鏈霉素、卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到結(jié)果如表2所示?？梢钥闯觯瑧c大霉素試紙條與四環(huán)素、鏈霉素、卡那霉素?zé)o交叉反應(yīng)，說明試紙條特異性良好，只對(duì)GM有特異性結(jié)合。

圖5 試紙條的穩(wěn)定性測(cè)試Fig.5 Stability of the GM strip

圖6 試紙條的特異性測(cè)試Fig.6 Specificity of GM test strip

表2 慶大霉素試紙條特異性檢測(cè)Table 2 Specificity of GM test strip

2.3 樣品檢測(cè)

將處理好的豬肉樣品進(jìn)行ELISA和GICA檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表3所示。從表3中可以看到，4管中GM 含量的理論值分別為 76.72、7.67、0.77、0μg/mL，ELISA測(cè)得的 GM 濃度分別為 75.82、7.53、0.75、0μg/mL，而GICA檢測(cè)結(jié)果分別為陽(yáng)性、陽(yáng)性、弱陽(yáng)性、陰性，由此可見，GICA檢測(cè)結(jié)果與ELISA法測(cè)得的結(jié)果呈現(xiàn)很好的一致性。

表3 豬肉樣品中GM的ELISA和GICA檢測(cè)結(jié)果的比較(n=3)Table 3 Comparison of ELISA and GICA for GM determination in pork samples(n=3)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用膠體金免疫層析法研制出的慶大霉素試紙條，并對(duì)試紙條的靈敏度、特異性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)結(jié)果為慶大霉素檢測(cè)限為0.7μg/mL，檢測(cè)時(shí)間為10min，試紙條穩(wěn)定性良好，30d內(nèi)檢測(cè)效果無明顯差異，特異性強(qiáng)，與其他同類物質(zhì)無交叉反應(yīng)，將該方法與ELISA酶聯(lián)免疫法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，呈現(xiàn)良好的一致性。該方法檢測(cè)準(zhǔn)確度高、靈敏度高、特異性強(qiáng)、而且安全快捷，便于操作，這為廣大的肉類加工廠和一些檢測(cè)設(shè)備相對(duì)落后的檢測(cè)部門提供了一種有效的檢測(cè)方法。

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