響應(yīng)曲面法優(yōu)化大腸菌群初發(fā)酵培養(yǎng)基

呂肖楠，田 然，姜瞻梅，鄭冬梅，韓佳彤，田 波

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)

大腸菌群是指一群在37℃、24h能夠發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、需氧或兼性厭氧的革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌［1］，廣泛存在于人類和動(dòng)物的腸道中，并且隨糞便廣泛分布。作為評(píng)價(jià)食品衛(wèi)生質(zhì)量指標(biāo)的重要標(biāo)準(zhǔn)之一，大腸菌群具有重要的衛(wèi)生學(xué)意義［2］。目前，針對(duì)大腸菌群的檢測(cè)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法［3］和國(guó)外檢測(cè)方法［4］中常使用的初發(fā)酵培養(yǎng)基為 LST培養(yǎng)基。但是，使用初發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵常具有遲緩性、準(zhǔn)確性低等缺點(diǎn)。因此，發(fā)展一種快速、準(zhǔn)確的大腸菌群發(fā)酵培養(yǎng)基是十分必要的。本文在標(biāo)準(zhǔn)LST培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，對(duì)培養(yǎng)基中碳源和氮源不同配比對(duì)大腸菌群生長(zhǎng)速率的影響作用進(jìn)行研究，利用Box－Behnken響應(yīng)曲面法優(yōu)化培養(yǎng)基［5－7］，旨在提高大腸菌群的發(fā)酵速率，為近一步研究快速檢測(cè)大腸菌群的方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大腸桿菌(Escherichia coli)由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室選育、保藏;營(yíng)養(yǎng)肉湯:蛋白胨10g/L，牛肉粉3g/L，氯化鈉5g/L，pH7.2;營(yíng)養(yǎng)瓊脂:蛋白胨10g/L，牛肉粉3g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂15g/L，pH7.2～7.4;LST 培養(yǎng)基:胰蛋白胨 20g/L，氯化鈉5g/L，乳糖5g/L，磷酸氫二鉀2.75g/L，磷酸氫二鉀2.75g/L，月桂基硫酸鈉 0.1g/L，pH6.8～7.0;胰蛋白胨、牛肉粉、酵母粉 生物純，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;瓊脂粉 生物純，日本Solaribio公司;乳糖分析純，天津市東方衛(wèi)生材料廠;氯化鈉、氫氧化鈉 分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司。

AL204/01型電子天平 梅特勒－托利多(上海)有限公司;HVE－50高溫高壓滅菌鍋、BHC－1100ⅡA2生物安全柜 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司;HPS－160生化培養(yǎng)箱 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司;PB－10 pH測(cè)定儀 廣州浩賽電子儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 將大腸桿菌母種在無(wú)菌條件下接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后，放入4℃冰箱待用。

1.2.2 菌懸液制備 挑取斜面保藏的菌種2～3環(huán)接種于9mL營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18～24h后，放入4℃冰箱中待用。

1.2.3 培養(yǎng)基優(yōu)化方法

1.2.3.1 乳糖濃度的確定 以LST培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，保持其它組分不變，向其中添加不同濃度的乳糖，37℃培養(yǎng)24h，以大腸菌群菌落總數(shù)為指標(biāo)，計(jì)數(shù)方法參照 GB 4789.2－2010［8］，確定乳糖最適添加量。

1.2.3.2 胰蛋白胨濃度的確定 以LST培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，保持其它組分不變，分別向培養(yǎng)基中添加不同濃度的胰蛋白胨，37℃培養(yǎng)24h，以大腸菌群菌落總數(shù)為指標(biāo)，計(jì)數(shù)方法參照 GB 4789.2－2010［8］，確定胰蛋白胨最適添加量。

1.2.3.3 酵母粉濃度的確定 以LST培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，保持其它組分不變，分別向培養(yǎng)基中添加不同濃度的胰蛋白胨，37℃培養(yǎng)24h，以大腸菌群菌落總數(shù)為指標(biāo)，計(jì)數(shù)方法參照 GB 4789.2－2010［8］，確定酵母粉最適添加量。

1.2.3.4 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn) 依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以乳糖、胰蛋白胨和酵母粉濃度為自變量A、B、C，以其最佳濃度為自變量中心點(diǎn)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，見表1。

表1 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box－Behnken design

2 結(jié)果與討論

2.1 乳糖濃度優(yōu)化

選取乳糖作為培養(yǎng)基的碳源，考察了不同濃度的乳糖對(duì)大腸菌群發(fā)酵速率的影響。以37℃，培養(yǎng)24h后的菌落總數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果見圖1。

圖1 不同乳糖濃度對(duì)大腸菌群菌落總數(shù)的影響Fig.1 Influence of different concentration of lactose on the TVCs of coliform group

由圖1可知，乳糖濃度較小時(shí)菌落數(shù)較少，濃度較高時(shí)會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)。當(dāng)乳糖濃度為0.5g/100mL時(shí)，菌落總數(shù)達(dá)到最優(yōu)值4.7×106cfu/mL。在發(fā)酵的過(guò)程中，乳糖具有雙效的作用，既作為碳源為菌體的生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)又作為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)大腸菌群產(chǎn)生β－半乳糖苷酶分解乳糖。乳糖濃度較低時(shí)，無(wú)法滿足菌體生長(zhǎng)的需要，使其生長(zhǎng)發(fā)育受到影響，同時(shí)，無(wú)法誘導(dǎo)大腸菌群產(chǎn)生β－半乳糖苷酶。隨著乳糖濃度的增加，培養(yǎng)基的滲透壓不斷增加反而會(huì)抑制菌體的生長(zhǎng)和β－半乳糖苷酶的表達(dá)。因此，選取乳糖濃度為0.5g/100mL較為合適。在此濃度時(shí)，既能保證菌體的正常生長(zhǎng)，又能起到高效的誘導(dǎo)作用。

2.2 胰蛋白胨濃度優(yōu)化

保持LST培養(yǎng)基中的其它成分不變，向其中添加不同濃度的胰蛋白胨，37℃培養(yǎng)24h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，得到較優(yōu)的胰蛋白胨濃度，結(jié)果如圖2所示。

圖2 不同胰蛋白胨濃度對(duì)大腸菌群菌落總數(shù)的影響Fig.2 Influence of different concentration of tryptone on the TVCs of coliform group

由圖2可以看出，胰蛋白胨的濃度對(duì)大腸菌群菌體生長(zhǎng)有重要作用。隨著胰蛋白胨添加量的增加，大腸菌群菌落總數(shù)有明顯的提高，但添加量達(dá)到1.5g/100mL后繼續(xù)增加其濃度，菌落數(shù)呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。在大腸菌群生長(zhǎng)的過(guò)程中，胰蛋白胨作為氮源的同時(shí)也可提供碳源，為大腸菌群提供必需的生長(zhǎng)元素和生長(zhǎng)因子，但添加濃度過(guò)高會(huì)抑制大腸菌群的生長(zhǎng)，因此選取較優(yōu)的胰蛋白胨濃度為1.5g/100mL。

2.3 酵母粉濃度優(yōu)化

保持LST培養(yǎng)基中的其它成分不變，向其中添加不同濃度的酵母粉，37℃培養(yǎng)24h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，得到較優(yōu)的酵母粉濃度，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同酵母粉濃度對(duì)大腸菌群菌落總數(shù)的影響Fig.3 Influence of different concentration of yeast powder on the TVCs of coliform group

由圖3可知，隨著酵母粉濃度的提高，菌落總數(shù)呈現(xiàn)出逐漸上升趨勢(shì)，而當(dāng)酵母粉濃度超過(guò)0.3g/100mL時(shí)，菌落總數(shù)隨著酵母粉濃度的增加而呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)。酵母粉富含蛋白質(zhì)、氨基酸、B族維生素和生長(zhǎng)因子等物質(zhì)，能夠?yàn)槲⑸锏纳L(zhǎng)補(bǔ)充氮源和各種維生素及生長(zhǎng)因子［9］。較低濃度的酵母粉對(duì)大腸菌群的生長(zhǎng)并沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用，隨著濃度的增加，酵母粉對(duì)大腸菌群的生長(zhǎng)促進(jìn)作用逐漸加強(qiáng)。繼續(xù)增加酵母粉的添加量，由于培養(yǎng)基中滲透壓增加以及溶氧能力減弱，大腸菌群的生長(zhǎng)受到抑制。因此，選取酵母粉的最佳濃度為0.3g/100mL。

2.4 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 模型的建立與分析 依據(jù)方法1.2.3.2進(jìn)行Box－Behnken實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 Box－Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Results of response surface experiments

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis results of regression and variance

利用Design Export軟件［10］對(duì)表1中的大腸菌群菌落總數(shù)進(jìn)行回歸分析與回歸擬合，得到響應(yīng)值Y與變量A、B、C之間的回歸方程為Y=10.2－0.062A+0.21B－0.13C－0.1AB－0.075AC－0.075BC－0.53A2－0.43B2－0.3C2?；貧w方程方差分析結(jié)果見表3。

據(jù)表3可知，模型方程中的常量p＜0.0001，表明此模型顯著［11］。模型的失擬項(xiàng)p=0.9136，說(shuō)明失擬不顯著，回歸模型適合［12］。模型的相關(guān)系數(shù) R2=0.9929，表明模型與實(shí)際情況的擬合度較好。A、B、C三個(gè)因素的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)以及AB、AC、BC的交互作用對(duì)菌落總數(shù)都有顯著影響，其中因素B、C以及AB、AC、BC的交互作用對(duì)菌落總數(shù)有極顯著影響。

2.4.2 響應(yīng)面的優(yōu)化與分析 根據(jù)回歸方程所作的響應(yīng)曲面圖如圖4～圖6所示。

圖4 乳糖濃度和胰蛋白胨濃度對(duì)大腸菌群細(xì)菌總數(shù)的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface of concentration of lactose and tryptone on the TVCs of coliform group

由圖4可知，乳糖、胰蛋白胨和酵母粉的濃度對(duì)大腸菌落菌落數(shù)都有較大的影響。乳糖、胰蛋白胨和酵母粉任意兩者之間的交互作用都顯著。在培養(yǎng)基中其它成分不變的條件下，隨著三者濃度的不斷升高，大腸菌群菌落總數(shù)皆呈現(xiàn)出先增大后逐漸減小的趨勢(shì)。由此說(shuō)明大腸菌群生長(zhǎng)需要適宜的碳氮比，過(guò)高或過(guò)低濃度的碳源或氮源都會(huì)影響大腸菌群的生長(zhǎng)。在適宜的濃度條件下，大腸菌群能夠達(dá)到最佳的生長(zhǎng)狀態(tài)。使用Design－expert 7.0軟件分析對(duì)回歸方程求解得到A=0.5，B=1.64，C=0.29，此時(shí)Y值預(yù)測(cè)為1.025×107cfu/mL。由此，可以初步確定較適宜的培養(yǎng)基組成為乳糖0.5g/100mL，胰蛋白胨1.64g/100mL，酵母粉0.29g/100mL。在此條件下，大腸菌群菌落總數(shù)達(dá)到最佳值為1.025×107cfu/mL。

圖5 乳糖濃度和酵母粉濃度對(duì)大腸菌群細(xì)菌總數(shù)的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface of concentration of lactose and yeast powder on the TVCs of coliform group

圖6 胰蛋白胨濃度和酵母粉濃度對(duì)大腸菌群細(xì)菌總數(shù)的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface of concentration of tryptone and yeast powder on the TVCs of coliform group

2.4.3 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，得到的大腸菌群實(shí)際菌落總數(shù)結(jié)果見表4，可知平均值為1.033×107cfu/mL，該值與理論預(yù)測(cè)值相差0.84%，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到的參數(shù)準(zhǔn)確可靠，具有可行性。

表4 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of model validation test

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)大腸菌群初發(fā)酵培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu)化，通過(guò)Box－Behnken響應(yīng)曲面法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化，得到影響大腸菌群菌落總數(shù)的二次多項(xiàng)式回歸模型。最終得到的優(yōu)化培養(yǎng)基組成為:乳糖0.5g/100mL，胰蛋白胨1.64g/100mL，酵母粉0.29g/100mL，在此條件下可以得到大腸菌群菌落總數(shù)的最佳值1.025×107cfu/mL，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，得到的實(shí)際值為1.033×107cfu/mL，與理論預(yù)測(cè)值基本一致。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究大腸菌群快速檢測(cè)方法奠定了基礎(chǔ)。

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