樟樹(shù)葉多酚提取物體外清除自由基及抗油脂氧化活性研究

付湘晉，王 揮，冉曉敏，陳 浪，李忠海，黎繼烈

(中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南長(zhǎng)沙410004)

樟樹(shù)(Cinnamomum camphora(L.)Presl.)系樟樹(shù)屬的常綠喬木植物，是中國(guó)亞熱帶綠闊葉林的主要樹(shù)種之一，在中國(guó)資源非常豐富［1］。從古至今，中國(guó)就有利用樟樹(shù)的木、葉、根等治病的歷史，中醫(yī)認(rèn)為樟樹(shù)有祛風(fēng)除濕、行氣止痛、活血化瘀、通利關(guān)節(jié)之功效［2］。中國(guó)是世界上生產(chǎn)芳樟油最多的國(guó)家，其產(chǎn)量占世界的80%。芳樟油主要以樟樹(shù)枝葉為原料，采用蒸餾法生產(chǎn)，由于樟樹(shù)枝葉中芳樟油含量只有3%左右［3］，所以有大量加工下腳料未被利用。樟樹(shù)葉除含有芳樟油以外，還含多酚、類(lèi)胡蘿卜素、多糖、生物堿等多種生物活性物質(zhì)［4］。所以，提取芳樟油后的下腳料是提取這些活性物質(zhì)易得的低成本原料。酚類(lèi)化合物作為一種天然的抗氧化劑，具有很強(qiáng)的抗氧化作用，其健康功效包括抗衰老、強(qiáng)化血管壁、促進(jìn)消化、降低血脂肪、增加身體抵抗力、防止動(dòng)脈硬化、血栓形成、利尿、降血壓、抑制細(xì)菌與癌細(xì)胞生長(zhǎng)等等，近年來(lái)，頗受研究者重視，被稱(chēng)為“第七類(lèi)營(yíng)養(yǎng)素”。以天然抗氧化劑取代合成抗氧化劑是食品行業(yè)的發(fā)展趨勢(shì)，從天然植物中尋找新的清除體內(nèi)自由基的抗氧化劑也將是現(xiàn)代醫(yī)藥、保健行業(yè)的發(fā)展方向?，F(xiàn)已有較多的植物源天然抗氧化劑被作為添加劑應(yīng)用于食品工業(yè)中，如茶多酚顯著抑制魚(yú)肉的脂肪氧化［5］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)樟樹(shù)葉含有大量酚類(lèi)物質(zhì)，是新的多酚資源［6］。本文進(jìn)一步研究了樟樹(shù)葉多酚體外清除自由基及抗油脂氧化活性，為樟樹(shù)葉多酚資源的利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樟樹(shù)葉 2010年9月于中南林業(yè)科技大學(xué)校園內(nèi)采集樟屬香樟樹(shù)種的樟樹(shù)老葉(Cinnamomum camphora(L.)Presl.)，風(fēng)干(測(cè)得干物質(zhì)含量為47%，w/w)后粉碎，過(guò) 32目篩;鄰二氮菲、過(guò)氧化氫(30%)、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、鹽酸、鄰苯三酚、鐵氰化鉀、三氯乙酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺、BHT、維生素C、硫代硫酸鈉 試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)(上海)。

722型可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;VCX500超聲波細(xì)胞粉碎儀 SONICE＆MATERIALS，INC.USA。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樟樹(shù)葉多酚試樣的制備 試樣a，樟樹(shù)葉經(jīng)過(guò)超聲波耦合雙水相法提取得到的樣品。提取方法:樟樹(shù)葉→雙水相耦合超聲波萃取→樟樹(shù)葉多酚提取物→減壓濃縮→濃縮物→石油醚脫脂→水溶液即為游離多酚粗提取液。其中雙水相體系是40%的乙醇－硫酸銨2g/10mL，超聲波功率是255W，料液比是 1∶38，浸提時(shí)間是95min，浸提溫度是 21℃［6］。

試樣b，上述試樣a提取后，所得濾渣加入5倍(v/w)4mol/L NaOH溶液，于室溫下避光水解4h，冰浴中用6mol/L HCl調(diào)整溶液的pH至2，用濾渣5倍(v/w)的乙酸乙酯－無(wú)水乙醚混合液(1∶1)萃取3次，合并萃取液，于30℃下真空濃縮至干，用去離子水定容得結(jié)合多酚粗提取液［7］。

試樣c，試樣a、b合并后，用 AB－8大孔樹(shù)脂純化樣品:準(zhǔn)確稱(chēng)取經(jīng)過(guò)預(yù)處理的 AB－8大孔樹(shù)脂1.00g，置于150mL錐形瓶中，加入樟樹(shù)葉多酚提取液50mL(多酚含量1.00g·L－1)，吸附溫度 25℃，多酚溶液 pH5.68，振蕩吸附 4h(100r·min－1)達(dá)到平衡后，過(guò)濾后，樹(shù)脂中加入100mL洗脫溶劑60%的乙醇溶液(v/v)，震蕩解析 2h(100r·min－1)，過(guò)濾后濾液于30℃下真空濃縮至干，用去離子水定容，多酚純度為63.56%［8］。

1.2.2 多酚含量測(cè)定 以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用福林比色法測(cè)定樟樹(shù)葉多酚含量［9］，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程是 y=0.0931x－0.0054，R2=0.9984。

1.2.3 樟樹(shù)葉多酚還原力及清除自由基活性 還原力:還原 Fe3+法［10］。清除羥自由基活性:測(cè)定對(duì)Fenton反應(yīng)(鄰二氮菲－FeSO4－H2O2反應(yīng)體系)產(chǎn)生的羥自由基的清除率［11］。清除 DPPH自由基活性［12］:517nm。清除超氧陰離子自由基活性［13］:鄰苯三酚自氧化法。

1.2.4 樟樹(shù)多酚抗油脂氧化 用電子天平準(zhǔn)確稱(chēng)取50g油脂，加入試樣，加熱攪拌到油樣為均勻透明油狀物;不添加任何試劑的油樣置于室溫下，為空白組;不添加任何試劑的油樣置于(65±1)℃烘箱中，為模型組;添加樟樹(shù)多酚(多酚添加量0.04%，w/w)的油樣置于(65±1)℃烘箱中，為試樣組;所有樣品每12h測(cè)一次POV。

過(guò)氧化值 POV(mmol/kg)的測(cè)定［14］:硫代硫酸鈉滴定法。

2 結(jié)果與分析

2.1 樟樹(shù)多酚抗氧化能力

2.1.1 樟多酚還原力 檢測(cè)不同濃度的各類(lèi)物質(zhì)還原能力結(jié)果如圖1所示。一般來(lái)說(shuō)，物質(zhì)的還原能力與其抗氧化活性成正比。因此，各類(lèi)物質(zhì)反應(yīng)后的生成物在716nm處的吸光度的大小，可以表現(xiàn)出其抗氧化活性的大小，吸光度越大，就表明物質(zhì)的還原能力越大。

由圖1可知，試樣c的還原能力隨著濃度的增加而增大。而試樣a和b隨著濃度的增加，還原能力的增大表現(xiàn)不明顯。還原能力順序?yàn)閂C＞試樣c＞試樣b＞試樣a。

圖1 樟樹(shù)葉多酚還原能力Fig.1 Antioxidative ability of camphotree leaves polyphenol

2.1.2 樟多酚清除羥自由基活性 不同濃度的各類(lèi)物質(zhì)清除羥自由基的能力，如圖2所示。由圖2可以看出:VC的清除率最高，在4mg/mL以前VE清除羥自由基的能力要大于試樣a、b、c，在4mg/mL以后試樣b和試樣c以及VE的清除能力相當(dāng)于試樣a、b、c，在4mg/mL以后試樣b和試樣c以及VE的清除能力相當(dāng)，而試樣a清除羥自由基的能力最弱。

圖2 樟樹(shù)葉多酚清除羥自由基的能力Fig.2 Scavenging activities of camphotree leaves polyphenol on·OH

2.1.3 樟多酚清除DPPH自由基活性 不同濃度的各類(lèi)物質(zhì)清除DPPH自由基的能力實(shí)驗(yàn)如圖3所示。

圖3 樟樹(shù)葉多酚清除DPPH自由基Fig.3 Scavenging activities of camphotree leaves polyphenol on DPPH

VC在0.2mg/mL低濃度的時(shí)候清除率就達(dá)85%以上，試樣b和c清除DPPH自由基的能力相當(dāng)，且清除率高于同濃度的VE。葉輝等［15］報(bào)道樟科木姜子屬毛豹皮樟(老鷹茶)提取物的抗氧化活性強(qiáng)度為:其DPPH自由基清除率在80.56%～88.19%(1mg/mL酚)，本文結(jié)果與這一報(bào)道基本一致。

2.1.4 樟多酚清除超氧陰離子自由基活性 不同濃度的各類(lèi)物質(zhì)清除超氧陰離子自由基活性實(shí)驗(yàn)如圖4所示。

圖4 樟樹(shù)葉多酚清除超氧陰離子活性Fig.4 Scavenging activities of camphotree leaves polyphenol on ·

由圖4可以看出，VC的清除效果最好，試樣a的清除效果最差。但試樣b、c的清除效果與VE相當(dāng)。

2.2 樟樹(shù)多酚抗油脂氧化活性

油脂被氧化的程度可以用它的過(guò)氧化值(POV)表示，所以POV也是評(píng)價(jià)物質(zhì)抗氧化性能的重要指標(biāo)。測(cè)得油脂的POV越大，說(shuō)明所含有的過(guò)氧化物越多。如果在油脂中添加了抗氧化劑，其POV應(yīng)比未添加的空白樣品有所下降，POV越小，表明物質(zhì)的抗氧化性能越強(qiáng)不同濃度的試樣抗油脂氧化能力的實(shí)驗(yàn)如圖5所示。由圖5可以看出，隨著時(shí)間的增加，油脂的POV一直增加，空白組與模型組POV變化相似，但是樟樹(shù)多酚試樣組的POV增長(zhǎng)速度比較慢。

圖5 樟樹(shù)葉多酚抗油脂氧化能力Fig.5 Effect of camphotree leaves polyphenol on lipid oxidation

當(dāng)實(shí)驗(yàn)時(shí)間達(dá)到48h的時(shí)候，空白組和模型組的POV分別是15.91、16.17mmol/kg，而樟樹(shù)多酚試樣c組在實(shí)驗(yàn)時(shí)間72h時(shí)，POV為14.94mmol/kg，說(shuō)明添加了樟樹(shù)多酚的油脂被氧化的速度比未添加的慢。試樣c把脂肪氧化的誘導(dǎo)期從48h推遲到84h左右。

3 討論

樟樹(shù)多酚的抗氧化特性因?yàn)檎翗?shù)多酚的分子中含酚羥基，可以提供活潑的氫質(zhì)子，能夠有效地清除氧自由基，可以預(yù)防脂質(zhì)過(guò)氧化的啟動(dòng)，其次，和過(guò)氧化自由基結(jié)合生成穩(wěn)定的化合物，進(jìn)一步阻止了氧化過(guò)程中鏈鎖反應(yīng)的傳播。除此之外，樟樹(shù)多酚和金屬離子生成的絡(luò)合物，清除羥基自由基和脂質(zhì)自由基的能力，以及與自由基形成的半醌自由基的穩(wěn)定性對(duì)樟樹(shù)多酚的抗氧化活性的影響也很大。

試樣a、b分別是游離態(tài)粗多酚、結(jié)合態(tài)粗多酚，試樣c為大孔樹(shù)脂純化多酚，純度高，它們抗氧化及清除自由基活性的差異可能是因?yàn)樗鼈兊姆宇?lèi)物質(zhì)組成不同。酚類(lèi)是一大類(lèi)物質(zhì)。有研究鑒定了樟科木姜子屬毛豹皮樟的抗氧化成分，包括香豆酚、山奈酚、槲皮素等，但從其提取方法看，鑒定的主要是游離態(tài)酚［16］。同一材料中，結(jié)合態(tài)和游離態(tài)的酚種類(lèi)往往有很大差異，如稻殼中游離態(tài)酚類(lèi)物質(zhì)以丁香酸和香豆酸為主，結(jié)合態(tài)酚類(lèi)物質(zhì)以香豆酸為主［17］。但樟樹(shù)葉中兩種酚的組成尚需進(jìn)一步研究。

此外，還應(yīng)該考慮到多酚單體物質(zhì)之間的相互作用。Kanner等［18］對(duì)葡萄酒中的酚進(jìn)行研究的時(shí)候發(fā)現(xiàn)酚類(lèi)在作為抗氧化劑時(shí)，相互協(xié)同的機(jī)制起了很大的作用，活性較低的酚能夠使易于被氧化的酚再生。樟樹(shù)多酚提取物也有可能存在類(lèi)似的作用機(jī)制。但對(duì)樟樹(shù)多酚中不同的酚類(lèi)物質(zhì)之間協(xié)同作用或拮抗作用的機(jī)理還需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

4.1 三種不同提取純化的樟樹(shù)多酚試樣均有一定的抗氧化能力，其對(duì)羥自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基等都有一定的清除作用，特別是對(duì)DPPH自由基清除活性最強(qiáng)。多酚的純度對(duì)其抗氧化活性有一定影響，經(jīng)過(guò)大孔樹(shù)脂純化的試樣c的清除效果最好。

4.2 在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，各試樣的抗氧化活性及清除自由基活性隨著濃度的增加而增大，即存在量效關(guān)系。

4.3 抗油脂氧化能力的實(shí)驗(yàn)表明，樟樹(shù)多酚可有效延長(zhǎng)油脂氧化誘導(dǎo)期，從而阻止油脂氧化。開(kāi)發(fā)樟多酚食品抗氧化劑具有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值。

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