米渣蛋白肽的新型酶解工藝及產(chǎn)品結構表征

董瑞晨，王深旗，熊 華，黎文建，趙士強，張 忠

（南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，江西南昌330047）

大米糖漿制備過程得到的米渣中含有大約50%～70%的蛋白質(zhì)[1]，但由于蛋白發(fā)生熱變性，其水溶性很差，難以在食品加工中被廣泛應用，目前大多用作動物飼料[2]。米渣蛋白擁有較全的氨基酸配比，是非常難得的優(yōu)質(zhì)植物蛋白[3-4]。有研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)并非需在腸道中水解為游離氨基酸后才能被機體所吸收利用，而主要是以短肽形式被吸收，且機體對短肽吸收代謝速度較游離氨基酸快[5-7]。小分子肽在人體消化道可直接被人體吸收利用，溶解性好、黏度低、酸及熱穩(wěn)定性好，還具有抗氧化、降血壓等多種生理功能[8]。目前，酶解法已取代酸解法、堿解法等，成為制備米渣蛋白肽的主要方法[9-10]。單一酶解法制備的米渣蛋白肽分子量大、溶解性和乳化能力等功能性質(zhì)欠佳。胰蛋白酶（TRYP）作為特異性強的蛋白酶，為大米蛋白酶解常用酶之一。TRYP酶選擇性水解蛋白中由賴氨酸或精氨酸的羧基所構成的肽鏈，水解得到的賴氨酸與精氨酸所表現(xiàn)出的感官特性有輕度苦味[11-13]。而蛋白在復合蛋白酶（PROT）的外切肽酶及內(nèi)切肽酶的共同作用下水解成為小分子肽[14]，最大限度避免了苦味肽產(chǎn)生，其水解條件也相對溫和；同時復合蛋白酶比單一蛋白酶有更高效率和經(jīng)濟性[15]。本文將米渣進行預處理得到濃縮蛋白，經(jīng)復合酶解，對酶解液進行脫色[16]，然后采用噴霧干燥得到米蛋白肽粉末，其流動性良好、易溶于水[17]，而后對米渣蛋白肽的分子結構表征[18]，考察相關理化和功能性質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米渣 江西恒天實業(yè)有限公司；脂肪酶（1500U/g）、中溫α-淀粉酶（3000U/g）諾維信（中國）公司；福林酚試劑 北京鼎國昌盛生物技術責任有限公司；胰蛋白酶（TRYP，4000U/g），復合蛋白酶（PROT，3000U/g）諾維信公司；SDS 美國Sigma公司，分析純；硫酸鉀、硫酸銅、氫氧化鈉、鹽酸、無水碳酸鈉、TCA等其他試劑 分析純。

U-1800紫外可見掃描儀 西安森冉生物工程有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華電器有限公司；FA1004電子天平 上海上平儀器公司；飛鴿牌LXJ-IIB離心機、IKA RH basic 1磁力攪拌器 江西鼎技科學儀器有限公司；DGG-9123AD臺式電熱恒溫鼓風干燥箱 上海森信實驗儀器有限公司；JJ-1精密增力電動攪拌器 上海浦東物理光學儀器廠；雷磁PHS-3C pH計 上海精科儀器有限公司；QZP-8移動式高速離心噴霧干燥機 無錫市林洲干燥機廠；KDY-9820凱氏定氮儀 廈門精藝興業(yè)科技有限公司；FSH-Ⅱ高速電動勻漿機 江蘇金壇市環(huán)宇科學儀器廠；FT-IR Nicolet 5700傅立葉紅外光譜儀 美國尼高力公司；PSA NANO 2590型納米粒度儀 英國馬爾文公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 米渣蛋白肽的制備工藝

1.2.1.1 米渣前處理制備米渣蛋白 向購買的米渣中加入脂肪酶和淀粉酶以除去殘余的脂質(zhì)和淀粉，得到蛋白含量高的濃縮米渣蛋白[19]。其工藝流程如下：以固液比1∶6加水（準確稱取200g米渣加入1200mL蒸餾水）→調(diào)節(jié)溫度40℃及pH5.0→加入0.2%脂肪酶反應1.5h→升溫至50℃，調(diào)節(jié)pH6.0→加入0.8%中溫α-淀粉酶反應1.5h→離心，緩慢傾去上清液→以固液比1∶11加水，在溫度65℃下水洗1.0h→離心，傾去上清液→相同條件下重復水洗兩次。

1.2.1.2 最佳酶解條件的確定 采用TRYP酶和PROT酶協(xié)同酶解米渣蛋白，可以獲得分子粒徑分布較小的短肽。其工藝流程為：米渣蛋白→加酶→加水→調(diào)節(jié)pH→調(diào)溫→酶解→滅酶→離心→酶解液→脫色→噴霧干燥→米渣蛋白肽粉。以米渣蛋白肽中的溶解蛋白的含量以及短肽的含量為評價指標，對酶解工藝進行優(yōu)化。確定最佳的酶配比、酶解固液比、酶解溫度、酶解pH和反應時間等條件。

1.2.1.3 測定方法 采用凱氏定氮法測定米渣等樣品中蛋白的含量，采用福林酚法測定酶解液上清液的溶解性蛋白含量，具體步驟參照GB/T 5009.5-2003食品中蛋白質(zhì)的測定。采用TCA沉淀法測定短肽含量（MW＜1ku）。具體操作為：稱取一定量的米渣蛋白肽置于干凈燒杯中，加入25mL 15%的TCA溶液，攪拌均勻后以10000r/min離心5min，取上清液，過濾，取定量濾液至消化管中，用半微量凱氏定氮法測定短肽含量。

1.2.2 米渣蛋白肽酶解條件的正交優(yōu)化實驗設計 米渣經(jīng)過前處理除去脂肪、糖類后，最終得到蛋白含量為85.58%的米渣濃縮蛋白。綜合考慮實驗過程中的酶解效率和經(jīng)濟性，確定選擇TRYP酶與PROT酶的比例為3∶2。在此條件下進一步探究酶解固液比、酶解時間、酶解溫度及pH對酶解效果的影響，確定最佳酶解條件。根據(jù)單因素實驗結果，分別選擇酶解固液比1∶8、1∶9、1∶10、酶解溫度45、50、55℃、酶解pH7.5、8.0、8.5、酶解時間2.5、3.0、3.5h，以酶解后酶解液中溶解性蛋白含量為指標，進行L9（34）正交實驗。具體正交設計見表1。

表1 正交實驗影響因素及水平Table 1 Design of orthogonal test table

1.2.3 紅外吸收光譜測定米渣蛋白肽 蛋白樣品受到頻率連續(xù)變化的FT-IR光照射時，分子會吸收某些頻率的輻射，并由其振動或轉動運動引起偶極矩的凈變化，產(chǎn)生分子振動和轉動能級從基態(tài)到激發(fā)態(tài)的躍遷而產(chǎn)生吸收光譜。采用KBr壓片法，樣品及KBr經(jīng)干燥處理后，分別稱取約5mg樣品及200mg純KBr，充分混合后于球磨機中研磨，邊研磨邊使樣品與KBr充分混勻（約2min），直至粒度小于2μm，然后將研磨混勻的混合物放入模具中，于7.0×107Pa下壓成透明薄片，以KBr空白壓片作參比，掃描范圍4000～400cm-1，儀器分辨率4cm-1，掃描32次。分別測定米渣蛋白經(jīng)TRYP酶和PROT酶協(xié)同處理前后的紅外吸收光譜。

1.2.4 米渣蛋白肽分子粒徑分布的測定 不同粒徑范圍內(nèi)所含粒子的個數(shù)或質(zhì)量，稱為粒徑分布，也稱粒子的分散度。本實驗方法所制得的米渣蛋白肽為均勻、穩(wěn)定、粒徑小的近球形顆粒，適用于粒度儀分析。在優(yōu)化的工藝條件下酶解米渣蛋白，離心后取其上清液，通過PSA NANO 2590型納米粒度儀対酶解液進行測定，可以準確地反映所制備米渣蛋白肽的粒徑大小及分布情況。

1.2.5 米渣蛋白肽分子的掃描電鏡觀察 掃描電鏡（SEM）能直接觀察大試樣的原始表面，觀察試樣各個區(qū)域的細節(jié)及生物試樣。將酶解液脫色后經(jīng)噴霧干燥得到米渣蛋白肽粉，取少量蛋白肽產(chǎn)品通過高分辨率掃描電鏡觀察其分子的外形輪廓和表面結構。

2 結果與討論

2.1 米渣蛋白肽酶解條件的正交優(yōu)化結果分析

表2為正交實驗的極差分析結果，可以看出四因素對溶解性蛋白含量的影響程度依次為：C＞A＞D＞B，理論酶解最佳工藝組合為：A2B2C2D2，即酶解固液比1∶9、酶解溫度50℃、酶解pH8.0、酶解時間3.0h。驗證實驗表明，米渣蛋白經(jīng)此最佳工藝處理后，所得酶解液中的溶解性蛋白含量為23.49%，高于正交表中的9組實驗結果，也遠高于酶解前的4.35%。同時測得經(jīng)此工藝處理后，酶解液中的短肽含量為16.35%，而酶解前短肽含量僅為0.97%。得到的米渣蛋白肽酶解液為澄清透明的淡紅色液體，粘度小，低苦澀味。說明工藝組合A2B2C2D2為最佳酶解工藝組合，酶解效果較好。

表2 實驗設計及結果Table 2 Experimental design and results

2.2 米渣蛋白肽的紅外光譜圖

圖1 米渣蛋白肽FT-IR圖譜Fig.1 The FT-IR spectra of rice residue protein

由圖1可明顯看出米渣蛋白的特征吸收峰，經(jīng)TRYP酶和PROT酶協(xié)同酶解處理前后米渣蛋白的FT-IR圖有所差異。以酶解處理前的米渣蛋白（見圖1（a））為例，波數(shù)3288.37cm-1為胺基-NH2、羧基-COOH伸縮振動峰；2963.08cm-1為飽和C-H伸縮振動吸收峰；1399.43cm-1為C-H彎曲振動特征峰；1078.07cm-1為C-O、C-N伸縮振動峰；621.50cm-1為烯烴C-H面外彎曲振動峰。由圖1（b）可以看出酶解后米渣蛋白肽的特征吸收峰均出現(xiàn)小幅的偏移，還有部分波數(shù)在1500～1000cm-1范圍內(nèi)的吸收峰消失，說明可能有部分雜質(zhì)基團在酶解過程中被除去。另外，特征吸收峰尖銳且穩(wěn)定，可推斷所制備米渣蛋白肽為較純凈的蛋白肽粉末，所含基團主要為胺基-NH2、羧基-COOH及烷基C-H等。

2.3 米渣蛋白肽的粒徑分布圖

圖2 米渣蛋白肽粒徑分布狀況Fig.2 The particle size distribution of rice residue peptide

圖2結果顯示，米渣蛋白肽分子粒徑分布在110.1～356.2nm范圍之間，其中在198.0nm的含量最高，為

36.4 %，平均粒徑為233.5nm，而且其粒徑分布比較均勻，顆粒較小，分布范圍較窄，表明米渣蛋白酶解充分，經(jīng)過酶解裂解為相對分子質(zhì)量較小的肽段，最終形成均勻、穩(wěn)定的小顆粒。

2.4 米渣蛋白肽的掃描電鏡圖

圖3 米渣蛋白肽SEM圖Fig.3 The SEM photograph of rice residue peptide

圖3顯示了米渣蛋白肽的SEM圖，可見米渣蛋白肽分子彼此團聚交聯(lián)在一起，成為直徑較大的不規(guī)則球體顆粒，表面凹凸不平，部分球體還存在破孔現(xiàn)象。球體的直徑約為150μm，應為大量小分子肽團聚交聯(lián)所致。

3 結論

采用新型的酶解工藝后，米渣蛋白中溶解性蛋白含量及短肽含量明顯升高，有助于人體吸收。最佳酶解工藝條件為：胰蛋白酶與復合蛋白酶配比為3∶2、酶解固液比1∶9、溫度50℃、pH8.0、時間3.0h。由此得到的蛋白肽產(chǎn)品的溶解性蛋白含量從4.35%升高至23.49%，小分子短肽含量從0.97%提高到16.35%。對產(chǎn)品結構表征發(fā)現(xiàn)，其特征吸收峰尖銳且穩(wěn)定，雜峰較少，表明采用此工藝制得的蛋白肽較純；溶解液粒徑分布均勻，粒徑平均為233.5nm；SEM顯示小分子蛋白肽容易團聚包裹在一起形成不規(guī)則球狀顆粒。

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