低溫貯藏和短波紫外線輻照對芥藍采后葉綠素降解及脫鎂葉綠素酶活性的影響

劉 振，唐 蕾，*，王海鷗，毛忠貴，張 玲，王 武

(1.江南大學工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫，214122;2.江南大學食品學院，江蘇無錫，214122)

綠葉蔬菜采后失綠直接影響產(chǎn)品感官品質(zhì)和貨架壽命。失綠源于葉綠素降解。葉綠素是含鎂的卟啉類光合色素，在高等植物中分為葉綠素a和葉綠素b。目前認為葉綠素降解始于葉綠素a，葉綠素b轉(zhuǎn)化為葉綠素a后，先脫去卟啉環(huán)中鰲合的鎂生成脫鎂葉綠素a，再經(jīng)脫鎂葉綠素酶(PPH)的作用生成脫鎂葉綠酸a，然后由脫鎂葉綠酸a單加氧酶(PaO)催化卟啉環(huán)的開環(huán)［1］。由此可見，在葉綠素降解過程中酶的作用至關重要。所以研究采后處理與貯藏條件對葉綠素降解相關酶活性的影響，進而控制葉菜采后失綠，提高品質(zhì)、延長貨架期具有實用價值。然而目前相關方面的理論研究尚十分有限。芥藍(Brassica alboglabra L.)是我國南方特有的蔬菜品種之一，因其質(zhì)脆、清鮮、營養(yǎng)豐富深受廣大消費者喜愛，并且遠銷東南亞等國家和地區(qū)［2－3］。作為鮮食蔬菜，采后護綠是芥藍保鮮的一個重要方面。對于需要較長時間貯運且保持良好品質(zhì)的芥藍，如出口銷售芥藍，低溫是常用的保鮮方法。短波紫外線(UV－C)輻照作為一種安全、無污染的綠色環(huán)保保鮮方式，近年來受到廣泛關注。通過使用適宜的紫外線輻照果蔬，可以影響其多酚氧化酶、苯丙氨酸解氨酶、抗氧化酶等的表達［4］。上述兩種方法對芥藍貯藏過程中葉綠素及其相關降解酶類的影響尚未見報道。為此本文進行了溫度以及UV－C輻照對貯藏過程中葉綠素含量及PPH活性變化的影響，試圖為控制芥藍采后失綠提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

芥藍葉片 市購芥藍，清水洗凈，吸干表面水分，選取飽滿嫩綠，新鮮度大小基本一致，無病蟲害，無機械損傷的葉片;葉綠素a 購自美國Sigma公司，經(jīng)酸化處理為脫鎂葉綠素a;BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒 購自上海生工生物工程有限公司;其他試劑 購自國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純。

冷凍離心機 美國Sigma公司;Unico UV－2100紫外可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司;恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司;光照培養(yǎng)箱 韶關市泰宏醫(yī)療器械有限公司;紫外燈(15w，254 nm)佛山電器照明股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 葉綠素含量的測定 取0.2g芥藍葉片，加液氮研成粉末，轉(zhuǎn)入15mL帶塞離心管中，加80%的丙酮水溶液，避光浸提，5000r/min離心10min，吸取上清液稀釋一倍后測定645及663nm處的吸光值，按照Aron公式計算葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素的含量［5］。

1.2.2 PPH活力的測定方法 參照Aiamla－or等的方法并予以改進［6］。

丙酮粉制備:取10g葉片，加入冷丙酮(－20℃)勻漿，濾紙抽濾，冷丙酮洗濾，室溫干燥，－20℃貯藏備用。

酶液制備:取上述丙酮粉 0.5g，加入 25mL 50mmol/L的Tris－HCl(pH8.0)，冰浴攪拌1h后用2層紗布過濾，濾液在4℃下10000r/min離心15min。上清液用45%～80%飽和硫酸銨沉淀，沉淀用緩沖液溶解，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>

PPH活性測定:反應混合液由0.35mL酶液，75μL 2.0% Triton X－100，0.1mL 脫鎂葉綠素 a(10μmol/L)，0.7ml 50mmol/L Tris－HCl(pH8.0)組成。反應于暗處25℃下進行。90min時加入丙酮至終濃度為25%終止反應。然后，加入3mL的正己烷萃取脫鎂葉綠素a，于667nm測定在丙酮層中的脫鎂葉綠酸a的吸光值。PPH活性以每分鐘生成1μmol脫鎂葉綠酸a為一個酶活單位(U)。

1.2.3 蛋白含量測定 按照“BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒”(上海生工生物工程有限公司)說明書的操作測定酶液中總蛋白的含量。以牛血清白蛋白(BSA)作為標準蛋白。

1.2.4 UV－C處理與貯藏 將芥藍葉片置于紫外燈下分別照射 5、10、15、20min，期間翻轉(zhuǎn)葉片，使葉面輻照均勻。以不照射為對照，處理完畢后，放入保鮮袋中，置于暗處22℃貯藏5d。分別在第0、1、3、5d的同一時間取樣測定葉綠素含量、PPH活性。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 每個指標測定均重復3次，應用SPSS 13.0對數(shù)據(jù)進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏溫度對葉綠素降解的影響

2.1.1 貯藏溫度對葉綠素含量的影響 溫度對植物葉綠素降解有不同的影響，秋季落葉樹木的綠色隨溫度的降低而消退，而對采后蔬菜而言，降低貯藏溫度一般能使綠色穩(wěn)定。然而，某些蔬菜在－18℃時仍有葉綠素降解現(xiàn)象發(fā)生［7］。在本實驗中我們探討了溫度對貯藏過程中葉綠素a、b的影響。選取的溫度為常溫22℃和低溫4℃。結(jié)果表明，低溫貯藏的葉綠素降解速度明顯低于常溫貯藏(圖1)。第5d較第0d，低溫組葉綠素a和b的含量分別下降了9.74%和17.15%，而常溫貯藏的芥藍葉綠素a和b的含量分別下降了85.43%和93.92%。

圖1 溫度對芥藍貯藏過程葉綠素含量的影響Fig.1 Effect of temperature on chlorophyll a and b contents during storage

2.1.2 貯藏溫度對PPH的影響 PPH專一催化脫鎂葉綠素a生成脫鎂葉綠酸a［8］，為PAO的開環(huán)反應提供了唯一的底物。PPH的發(fā)現(xiàn)改變了以往認為:葉綠素酶是葉綠素降解的第一步的觀點［9］。由于PPH較其他參與葉綠素降解的酶發(fā)現(xiàn)遲，對其研究尚十分有限。有研究表明在與芥藍同屬的花椰菜(Brassica oleracea L.)的采后處理中，葉綠素的降解與PPH的表達量相關［10］。為此本文研究了貯藏溫度對PPH活力的影響，以第0d的PPH活力(14.5mU/g蛋白)為100%，探討其在貯藏過程中的變化與葉綠素降解之間的關系。結(jié)果表明22℃貯藏時，PPH活性在前期快速升高，第3d時約為第0d的200%，第5d時酶活性降低，約為第0d的35%，而在4℃貯藏時，PPH活性雖然一直上升，但增速緩慢，第3d時僅為第0d的135%，并且前3d的活性始終低于22℃時的水平。因此低溫貯藏可能因為抑制前期PPH活性的迅速上升，從而延緩了葉綠素的降解(圖2)。

2.2 短波紫外線輻照對葉綠素降解的影響

2.2.1 輻照時間對葉綠素含量的影響 波長在200～400nm的電磁輻射稱為紫外輻射，其中波長范圍為200～280nm為短波紫外光UV－C。UV－C對大多數(shù)微生物具有殺滅作用，因此作為一種操作簡單、無污染的殺菌方法很早即被應用于食品工業(yè)中。近年的研究表明UV－C除了殺菌之外，還可以影響到蛋白質(zhì)、VC等營養(yǎng)物質(zhì)以及抗氧化酶等酶類的表達，在提高葉菜、果蔬的貯藏期品質(zhì)，延緩其后熟、衰老過程發(fā)揮積極作用［11－14］。

圖2 溫度對貯藏過程PPH活性變化的影響Fig.2 Effect of temperature on PPH activity during storage

在葉菜的保鮮中防止黃化，抑制葉綠素降解，是關鍵因素之一。為此本研究考察了UV－C處理與葉綠素含量的關系。結(jié)果表明UV－C照射能夠有效延緩葉綠素含量的下降，并隨著輻照時間的延長，葉綠素的降解越緩慢(圖3)。該效果在貯藏前期更為顯著，當輻照20min，22℃貯藏3d時，葉綠素a的含量為0.49mg/g FW，是對照的1.75倍;葉綠素b的含量為0.16mg/g FW是對照的2.14倍(圖4)。

圖3 UV－C輻照時間對貯藏過程葉綠素含量的影響Fig.3 Effect of UV－C irradiation time on chlorophyll content during storage

圖4 UV－C輻照20min對貯藏過程葉綠素a及葉綠素b含量的影響Fig.4 Effect of 20min UV－C irradiation on chlorophyll a and b contents during storage

2.2.2 UV－C輻照對PPH活性的影響 為了進一步研究UV－C輻照減緩葉綠素降解的原因，本文對經(jīng)輻照處理的芥藍在貯藏過程中PPH活性的變化進行了研究。輻照時間為20min，貯藏溫度為22℃，避光。UV－C輻照后PPH活力下降，僅為未輻照的67%。以第0d的PPH酶活為100%。結(jié)果表明與對照相比，UV－C輻照抑制了貯藏前期PPH酶活性的迅速上升，與第0d相比，未經(jīng)輻照的芥藍在第1d的PPH酶活上升了50%，而UV－C輻照處理的僅上升了14%(圖5)。之后，PPH活性上升加快，第3d較第1d上升了112%，相應葉綠素降解明顯，總?cè)~綠素含量由第1d時0.97mg/g FW降至第3d的0.66mg/g FW，下降了32%(圖3)。

圖5 UV－C輻照20min對貯藏過程PPH酶活性變化的影響Fig.5 Effect of 20min UV－C irradiation on PPH activity during storage

葉綠素降解是一個多酶參與的生化過程，酶的表達調(diào)節(jié)在不同植品種和不同生理條件下有所不同。PPH作為一種新發(fā)現(xiàn)的酶，對其的研究報道還十分有限，而且結(jié)果也不盡相同。Büchert等對花椰菜采后熱空氣、UV－C、光照和氣體成分對葉綠素降解相關酶基因表達的影響表明:熱、UV－C和光照處理延緩了葉綠素降解，同時調(diào)節(jié)了PPH的表達，而氣體成分雖然阻礙了葉綠素降解卻未能抑制PPH的表達［15］。Aiamla－or等發(fā)現(xiàn)葉綠素含量的下降與 PPH的活性增加相一致，較長波長的紫外輻照(UV－B)處理有效地抑制了葉綠素的降解，PPH活性的增強在處理后的前兩天略有降低，隨后與對照同樣上升［6］。本文的研究結(jié)果與Aiamla－or等的更為相似，具體表現(xiàn)在芥藍葉綠素降解與PPH活性相關聯(lián)，在常溫及未經(jīng)UV－C處理的芥藍中，葉綠素在第0d到第3d內(nèi)快速降解，PPH活性增加;在此之后即從第3d到第5d時，葉綠素降解減緩，PPH活性明顯下降。而低溫和UV－C處理抑制了PPH酶的上升速度，因而減緩了葉綠素的降解。但是，并未發(fā)現(xiàn)葉綠素含量與PPH酶活性之間存在定量關系，分析可能與參與葉綠素降解的其他酶有關。

3 結(jié)論

低溫和UV－C輻照作為一種安全、無污染的綠色環(huán)保保鮮方式可延長蔬菜的貨架壽命。本研究的結(jié)果表明上述處理方法可抑制葉綠素降解途徑中PPH活性的迅速上升，從而延緩了貯藏過程中葉綠素的降解，對芥蘭采后持綠方法的開發(fā)提供了一定的理論依據(jù)。

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