高效液相色譜法測(cè)定葡萄酒中苯甲酸含量的不確定度評(píng)定

湯海青，顧曉俊，殷居易，歐昌榮

(1.寧波出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，浙江寧波315012;2.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211)

苯甲酸及其鈉鹽作為酸性防腐劑，在食品行業(yè)中廣泛使用。根據(jù)我國(guó)相關(guān)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，苯甲酸及其鈉鹽可被限量用于多類食品，包括蜜餞涼果、腌漬蔬菜、調(diào)味料、果蔬汁等，而葡萄酒等產(chǎn)品不在允許添加之列［1］。但由于葡萄酒在自然發(fā)酵生產(chǎn)過(guò)程中可能產(chǎn)生一定量的苯甲酸成分，所以GB 15037－2006《葡萄酒》中對(duì)苯甲酸或苯甲酸納(以苯甲酸計(jì))并未規(guī)定不得檢出，而是給出了允許檢出的最高限量值［2］。在葡萄酒中人工添加苯甲酸及其鈉鹽，可抑制酵母和霉菌的生長(zhǎng)，對(duì)細(xì)菌的生長(zhǎng)也有一定作用。因此，苯甲酸及其鈉鹽可能被非法使用于葡萄酒的防腐和保藏，如總糖較高、酒精度較低的一類保質(zhì)期相對(duì)較短的葡萄酒產(chǎn)品，特別應(yīng)注意苯甲酸在假冒偽劣葡萄酒中的濫用。為了對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確表達(dá)和有效評(píng)價(jià)，如實(shí)反映測(cè)量的置信度和準(zhǔn)確度，本文采用GB/T 5009.29－2003《食品中山梨酸、苯甲酸的測(cè)定》中的第二法高效液相色譜法［3］，對(duì)一例苯甲酸含量在允許檢出的最高限量值50mg/L附近的樣品進(jìn)行測(cè)定。并根據(jù)國(guó)家計(jì)量技術(shù)規(guī)范JJF 1059－1999《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》的要求［4－5］，使用實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部確認(rèn)的數(shù)據(jù)計(jì)算不確定度。對(duì)葡萄酒中苯甲酸測(cè)量結(jié)果的不確定度進(jìn)行分析，為評(píng)定測(cè)量結(jié)果提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品(1.00mg/mL) 中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院;甲醇(色譜純) 美國(guó)天地公司;其余試劑 均為分析純。

LC－30A高效液相色譜儀 日本島津公司;梅特勒XS204電子天平、梅特勒T50M自動(dòng)電位滴定儀 瑞士梅特勒公司;JULABO SW22恒溫水浴 德國(guó)JULABO公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)使用液的配制 將苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)品于室溫(20±4)℃平衡10min，搖動(dòng)均勻，用移液管移取10mL至100mL容量瓶，得到濃度為100μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)中間液。用移液器分別準(zhǔn)確吸取0.2、0.5、1.0、2.0mL至10mL容量瓶中定容，混勻后為2、5、10、20μg/mL標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.2.2 樣品前處理 準(zhǔn)確移取10.0mL葡萄酒樣品，放入燒杯中，水浴加熱除去乙醇，氨水(濃氨水∶水=1∶1)調(diào)pH約7.0，用超純水定容至25.0mL，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾。作為待檢測(cè)樣品，同時(shí)做空白對(duì)照。

1.2.3 試樣測(cè)定 按島津高效液相色譜操作規(guī)程規(guī)定的程序開(kāi)機(jī)平衡系統(tǒng)，待基線穩(wěn)定后，取制備好的待測(cè)樣品液進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，用多點(diǎn)法峰面積校準(zhǔn)定量。色譜條件:色譜柱為Hyersil BDS C18柱，流動(dòng)相為 0.02mol/L乙酸銨溶液/甲醇(85/15，V/V)，柱流速 1mL/min，進(jìn)樣量10μL。

1.3 數(shù)學(xué)模型的建立

樣品中苯甲酸含量計(jì)算公式如下:

式中，X為樣品中苯甲酸含量(mg/L);C為樣品苯甲酸濃度(μg/mL);V為樣品最終定容體積(mL);Vm為樣品體積(mL);F為稀釋因子。

上述計(jì)算公式是由測(cè)量原理得出的，沒(méi)有考慮各種隨機(jī)因素對(duì)不確定度的影響，在此應(yīng)引入反映隨機(jī)影響的重復(fù)性系數(shù)frep，其數(shù)值等于1。評(píng)定不確定度的數(shù)學(xué)模型應(yīng)寫(xiě)成如下形式:

1.4 測(cè)量不定度來(lái)源

根據(jù)檢測(cè)過(guò)程和數(shù)學(xué)模型，不確定度的主要來(lái)源有:平行實(shí)驗(yàn)重復(fù)性產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(frep);移取樣品體積產(chǎn)生的相對(duì)不確定度u(Vm);試樣前處理定容體積引起的相對(duì)不確定度u(V);標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度引起的相對(duì)不確定度u(C);液相色譜儀定量重復(fù)性產(chǎn)生的相對(duì)不確定度u(LC)。相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式見(jiàn)式(3):

u(X)=［u(frep)2+u(Vm)2+u(V)2+u(C)2+u(LC)2］－1式(3)

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)量重復(fù)性產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

在重復(fù)條件下，對(duì)葡萄酒樣品進(jìn)行7次測(cè)量，測(cè)量數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

表1 平行測(cè)量結(jié)果Table 1 Results of parallel determination

單次測(cè)量的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)偏差為:

在日常分析中，測(cè)定兩份樣品報(bào)告平均值，故平均值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

該測(cè)量重復(fù)性標(biāo)準(zhǔn)偏差是本測(cè)量所有隨機(jī)影響的合成，因此在隨后各分量的評(píng)定中無(wú)需再考慮隨機(jī)影響。

2.2 樣品移取體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(Vm)

用10mL A級(jí)單標(biāo)線移液管移取樣品，按照計(jì)量檢定規(guī)程JJG 196－2006［6］，最大容量允差為0.020mL。按均勻分布(矩形分布)考慮，由此引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為實(shí)驗(yàn)室的溫度在±4℃之間變動(dòng)，考慮溶液溫度與校正時(shí)溫度差引起的體積不確定度。假設(shè)溫度變化時(shí)矩形分布，用水的膨脹系數(shù)(2.1×10－4/℃)計(jì)算，產(chǎn)生的體積變化引起的相對(duì)不確定度為合成得到樣品移取體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

2.3 定容體積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本次實(shí)驗(yàn)樣品定量總體積為25mL，采用25mL A級(jí)容量瓶定容，按照J(rèn)JG 196－2006，最大容量允差為±0.03mL。按三角形分布考慮，由此引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為實(shí)驗(yàn)室的溫度在±4℃之間變動(dòng)，考慮溶液溫度與校正時(shí)溫度差引起的體積不確定度。假設(shè)溫度變化時(shí)矩形分布，產(chǎn)生的體積變化引起的相對(duì)不確定度為合成得到樣品移取體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

2.4 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

2.4.1 液體標(biāo)準(zhǔn)品引入的不確定度 根據(jù)苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)，苯甲酸溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)值為1.00mg/mL，相對(duì)擴(kuò)展不確定度為1%，包含因子k=2，因此其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(C1)=0.005。

2.4.2 由苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋配制標(biāo)準(zhǔn)工作液產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(C2) 將10mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液一次性全部轉(zhuǎn)移至100mL A級(jí)容量瓶，稀釋至濃度100μg/mL。再用微量可調(diào)移液器移取標(biāo)準(zhǔn)稀釋液 200、500μL、1.0、2.0mL 至 10mL A 級(jí)容量瓶中并定容，配制成 2、5、10、20μg/mL 的苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。產(chǎn)生的不確定度

按照J(rèn)JG 196－2006，100mL A級(jí)容量瓶的最大容量允差為±0.10mL。按三角形分布考慮，由此引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為;考慮溶液溫度與校正時(shí)溫度差引起的體積不確定度0.00048。合成得到樣品移取體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

微量可調(diào)移液器允差±0.6%，按矩形分布，由此引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

10mL A級(jí)容量瓶的最大容量允差為±0.02mL。按三角形分布考慮，由此引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為。考慮溶液溫度與校正時(shí)溫度差引起的體積不確定度0.00048。合成得到樣品移取體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度:

上述不確定度互不相關(guān)，合成得:

2.4.3 校準(zhǔn)曲線擬合引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度u(C3)制備4個(gè)苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液ci，每個(gè)濃度測(cè)定3次，得到4×3共12個(gè)峰面積—濃度值(cij，Aij)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液校準(zhǔn)曲線Table 2 Calibration curve of standard solution

用最小二乘法擬合，截距a=3.0294×10－5，斜率b=0.02893，得標(biāo)準(zhǔn)曲線 Aij=3.3 ×104cij－954.78。

實(shí)際測(cè)定中，對(duì)待測(cè)樣液測(cè)定2次(p=2)，響應(yīng)值分別為133792和134843，代入公式，求得預(yù)估濃度值 c=4.04μg/mL。

由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線求c時(shí)產(chǎn)生的s(y)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.013。則標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的相對(duì)不確定度 s(Cp)為:

2.4.4 苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度 將上述各不確定度分量合成得到苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.5 由高效液相色譜儀產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

由校準(zhǔn)證書(shū)上可知，島津高效液相色譜儀的定量重復(fù)性誤差為1.0%，按均勻分布計(jì)算，則液相色譜儀的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

2.6 不確定度的合成

上述各項(xiàng)不確定度分量(見(jiàn)表3)互相獨(dú)立，葡萄酒樣品中苯甲酸的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

u(X)=X［u(frep)2+u(Vm)2+u(V)2+u(C)2+u(LC)2］－1=0.49μg/mL

表3 不確定度分量Table 3 List of uncertainty components

2.7 擴(kuò)展不確定度及結(jié)果

取包含因子k=2，置信水平約為95%，以全進(jìn)法修約，計(jì)算擴(kuò)展不確定度U(X)=0.49×2=0.98≈1mg/L。按 GB/T 5009.29－2003《食品中苯甲酸、山梨酸的測(cè)定》中的第二法規(guī)定的條件測(cè)定葡萄酒樣品中的苯甲酸(計(jì)算結(jié)果保留兩位有效數(shù)字)，測(cè)得平均值及其不確定度為(51±1)mg/L，包含因子k=2，置信水平約為95%。

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)測(cè)定苯甲酸過(guò)程中產(chǎn)生的不確定度進(jìn)行量化，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)中高效液相色譜法測(cè)定葡萄酒樣品的苯甲酸含量過(guò)程中，由標(biāo)準(zhǔn)溶液和液相色譜儀引入的不確定度為主要來(lái)源，其次為測(cè)量重復(fù)性和移取樣品體積引入的不確定度。根據(jù)CNAS－GL27聲明檢測(cè)和校準(zhǔn)結(jié)果及與規(guī)范符合性指南［7］，當(dāng)測(cè)試結(jié)果高于上限或低于下限，而延伸擴(kuò)展不確定度與上限或下限迭交時(shí)，則在95%的置信水平上不能聲明符合或是不符合標(biāo)準(zhǔn)。在置信水平低于95%的情況下，可能做出不符合規(guī)范的聲明。本實(shí)驗(yàn)中結(jié)果值51mg/L高于規(guī)定上限值50mg/L，向下延伸不確定度后的結(jié)果值與上限值迭交，因此在95%的置信水平上不能聲明符合或是不符合標(biāo)準(zhǔn)。

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB 2760－2011，食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)［S］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2011.

［2］中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB 15037－2006葡萄酒［S］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2007.

［3］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB/T 5009.29－2003，食品中山梨酸、苯甲酸的測(cè)定［S］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

［4］國(guó)家質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，JJF 1059－1999測(cè)量不確定度評(píng)定與表示［S］.北京:中國(guó)計(jì)量出版社，1999.

［5］中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)，CNAS－GL 06化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南［S］.北京:中國(guó)計(jì)量出版社，2006.

［6］國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，JJG 196－2006常用玻璃量器檢定規(guī)程［S］.北京:中國(guó)計(jì)量出版社，2006.

［7］中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)，CNAS－GL27聲明檢測(cè)和 校準(zhǔn)結(jié)果及與規(guī)范符合性指南［S］.北京:中國(guó)計(jì)量出版 社，2009.