同源過表達fnr、pncB和fdhF對克雷伯菌產(chǎn)氫代謝的影響

王姝玉，王俊，徐莉，皮健，張后今，閆云君

華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 分子生物物理教育部重點實驗室，湖北 武漢 430074

隨著能源問題的日益突出，厭氧發(fā)酵制氫已成為當前能源領(lǐng)域的研究熱點。研究表明，通過分析產(chǎn)氫微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)，調(diào)控其代謝途徑，構(gòu)建高效產(chǎn)氫菌[1-4]，已成為提高產(chǎn)氫微生物產(chǎn)氫能力的有效途徑[5-7]。

克雷伯菌具有較大產(chǎn)氫潛力，易于培養(yǎng)，底物適應(yīng)性強，受到研究者的廣泛關(guān)注[8-10]。其厭氧發(fā)酵存在兩種產(chǎn)氫途徑：一種是甲酸裂解產(chǎn)氫，由甲酸氫裂解酶 (Formate hydrogen lyase，F(xiàn)HL) 系統(tǒng)催化甲酸裂解產(chǎn)生氫氣；另一種是NADH途徑，微生物直接利用細胞內(nèi)過剩的還原力產(chǎn)生氫氣[3,11]。FHL系統(tǒng)是由甲酸脫氫酶(FDH-H)，氫酶 (Hyd-3) 和電子傳遞鏈組成[12]。fdhF基因只有在厭氧發(fā)酵條件下才合成 FDH-H大亞基，過量表達能促進 FDH-H大亞基的合成，從而促進甲酸裂解生成氫氣[12]。同時，fnr基因編碼的產(chǎn)氫厭氧代謝全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子FNR (延胡索酸和硝酸鹽還原反應(yīng)調(diào)控蛋白)是一個介導(dǎo)氧對基因調(diào)控的蛋白因子。FNR蛋白是在厭氧條件下生長有關(guān)的蛋白，它不僅抑制了一些好氧條件下的基因表達，而且激活有利于厭氧生長的基因表達。在厭氧條件下，F(xiàn)NR蛋白能同時正向調(diào)控丙酮酸脫酸途徑和甲酸氫裂解途徑產(chǎn)氫[13-15]。在已有的大腸桿菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫研究中，過表達fnr基因明顯提高氫氣產(chǎn)氫，表明丙酮酸和甲酸的厭氧代謝能正向調(diào)控提高產(chǎn)氫通量[16]。Fan等[16]研究了 FNR等正向轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子在大腸桿菌中的過表達，發(fā)現(xiàn)過表達fnr基因的重組菌產(chǎn)氫量比野生菌提高5.5倍。

NADH/NAD+是重要的輔因子，在微生物細胞內(nèi)參與了300多個氧化還原反應(yīng)[4]。利用輔因子工程調(diào)控微生物細胞內(nèi)NADH/NAD+代謝，不僅可有效調(diào)節(jié)微生物細胞的生長，而且還會影響微生物的代謝流[17]。Berrios-Rivera 將博伊丁假絲酵母Candida boidinii中依賴NAD的甲酸脫氫酶在大腸桿菌Escherichia coli中進行了異源表達，NADH生成效率得到了明顯提高[18]。純厭氧條件下，過量表達pncB基因促進NAD (H) 總量的生成，更多的生成NAD；而NAD的增加，加速了葡萄糖的氧化，從而生成NADH[19]。NADH合成過程如圖1所示。

圖1 NAD(H) 合成過程[3]Fig. 1 Process of NAD(H) synthesis[3].

pncB基因所表達的煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶(NAPRTase) 為合成NAD(H) 過程的關(guān)鍵酶，過表達能改變微生物細胞內(nèi)的氧化還原水平，并能促進依賴 NADH的相關(guān)代謝產(chǎn)物的合成[11]。Heuser等[3]在E. coli中同時過量表達pncB基因和NAD合成酶基因nadE，導(dǎo)致胞內(nèi)NAD(H) 總量增加7倍，NADP(H) 總量增加2倍。

但截至目前，在克雷伯菌中未見有相關(guān)研究的報道。為此，本研究以實驗室篩選到的克雷伯菌Klebsiellasp. HQ-3為對象，利用簡并引物克隆了克雷伯菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫代謝途徑的多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，并首次實現(xiàn)同源過表達，以研究其對克雷伯菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫效率、細胞生長及代謝終產(chǎn)物的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

產(chǎn)氫菌克雷伯氏菌 (Klebsiellasp. HQ-3) 由本實驗室篩選保存，E. coliTop10 (F－，lacX74△ ，△(ara-leu)，rpsL (StrR)) 由本實驗室保藏，克隆載體 pMD18-T購自 TaKaRa公司，質(zhì)粒 pET-28a(+) 購自 Novagen公司，并以卡那霉素 (kanamycin，Kan) 啟動子代替 pET-28a(+)中的 T7啟動子，構(gòu)建適于克雷伯菌中同源表達外源基因的載體pET28a-Pkan。

1.2 主要試劑、培養(yǎng)基及儀器

TaqDNA聚合酶和 dNTP Mixture購自Fermentas公司；限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、SacⅠ、EcoRⅠ，DNA Ligation Kit Ver. 2.0均購自TaKaRa 公司；Plasmid Mini KitⅠ和 Gel Extraction Kit購自 Omega公司；酸洗玻璃珠購自 Sigma公司產(chǎn)品；酵母提取物和蛋白胨為Oxoid公司產(chǎn)品；瓊脂糖為GENE公司產(chǎn)品；DNA Marker DS5000購自廣東東盛生物有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。所用引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)氫培養(yǎng)基 (/L)：葡萄糖15.0 g，酵母提取物2.0 g，胰蛋白胨5.0 g，NaCl 2.0 g，K2HPO41.5 g，MgCl2·6H2O 0.6 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2 g，微量元素液 10 mL，115 ℃高壓蒸汽滅菌25 min。使用前加入過濾除菌的生物素溶液10 mL。

電轉(zhuǎn)儀 617BR1-06510購于 Bio-Rad pulse Xcel；氣相色譜儀GC-9750購買于溫嶺福立分析儀器有限公司；高效液相色譜儀采用 SSI 2300-525，購買于美國SSI公司。

1.3 克雷伯野生菌HQ-3的fnr、pncB、fdhF基因擴增

在 GenBank中檢索肺炎克雷伯菌K. pneumoniae342、大腸桿菌E. colik-12、產(chǎn)氣腸桿菌Enterobacter aerogenesKCTC2190、陰溝腸桿菌E. cloacae、鼠類檸檬酸桿菌Citrobacter rodentium的產(chǎn)氫厭氧代謝的全局轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子 FNR編碼基因fnr，設(shè)計簡并引物fnr1/fnr2。同樣，根據(jù) GenBank中的煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶 (NAPRTase) 編碼基因pncB序列、甲酸脫氫酶 FDH-H編碼基因fdhF序列分別設(shè)計簡并引物pncB1/pncB2和fdhF1/fdhF2。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列見表1。

表1 本實驗所使用的引物Table 1 Primers used in this study

以Klebsiellasp. 總DNA為模板，PCR擴增基因fnr、pncB、fdhF。產(chǎn)物回收后連接pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化E. coliTop10感受態(tài)細胞，以100 μg/mL氨芐青霉素 (Amp) 的LB平板篩選陽性克隆子。酶切驗證，送上海生工測序，重組質(zhì)粒分別命名為 pMD-fnr、pMD-pncB和pMD-fdhF。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

pMD-fnr、pMD-pncB和 pMD-fdhF經(jīng)雙酶切，與同樣酶切的表達載體pET28a-Pkan連接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coliTop10感受態(tài)細胞，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的 LB平板培養(yǎng)過夜，菌落PCR及 DNA序列測序驗證，得到重組質(zhì)粒pET28a-Pkan-fnr、pET28a-Pkan-pncB、pET28a-Pkan-fdhF。表達載體構(gòu)建流程如圖2。將表達質(zhì)粒 pET28a-Pkan-fnr、pET28a-Pkan-pncB、pET28a-Pkan-fdhF及空載質(zhì)粒 pET28a-Pkan分別電轉(zhuǎn)化Klebsiellasp. HQ-3感受態(tài)細胞，以卡那霉素平板篩選陽性重組子，菌落 PCR及雙酶切驗證，獲得相應(yīng)的基因工程菌。

1.5 重組克雷伯菌批次發(fā)酵

將 3種重組菌株和對照菌株分別接種于 LB培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)12 h后，按20% (V/V) 的比例接種于含70 mL產(chǎn)氫培養(yǎng)基的150 mL錐形瓶中，用鹽水塞封口后，持續(xù)通純氮氣10 min，以排盡氧氣。將加有同種型號轉(zhuǎn)子的錐形瓶放入恒溫水浴磁力攪拌器中，37 ℃恒溫培養(yǎng)，采用帶有精確刻度的集氣裝置，利用排水法每隔2 h收集一次氣體，直至產(chǎn)氫完全終止。每組設(shè)置3個平行，每樣重復(fù)3次。

圖2 表達載體構(gòu)建圖譜Fig. 2 Schematic illustration of pET28a-Pkan expression vector construction.

1.6 SDS-PAGE電泳檢測

將發(fā)酵液以8 000 r/min離心2 min，收集菌體，加入5 mL PBS緩沖液，振蕩重懸并置于冰浴中，超聲破碎，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，取上清液與同體積的 2×SDS凝膠上樣緩沖液混勻，沸水水浴5 min，用于SDS-PAGE電泳分析。

1.7 發(fā)酵及代謝產(chǎn)物分析

細胞生長以O(shè)D600吸光值表示。對數(shù)期的種子以1% (V/V) 濃度接種于LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)，每隔2 h取出菌液測定OD600，延續(xù)14 h，繪制生長曲線，比較對照菌株與工程菌株的生長特性。產(chǎn)氫發(fā)酵液中的還原糖含量以3,5-二硝基水楊酸法 (DNS) 測定[20]；發(fā)酵液pH以pH計測定。

利用 GC-9750型氣相色譜儀測定發(fā)酵氣體中氫氣含量。氮氣作載氣，流速為55 mL/min，色譜柱填料為 carboxen-1004，80～100目，擔(dān)子為13 X分子篩，柱長2 m，TCD檢測器，進樣器、柱溫和檢測器分別為70 ℃、50 ℃、80 ℃，六通閥為1 mL定量管。外標法測定氫氣含量。

將發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min，收集上清液，0.45 μm的濾膜過濾，以 SSI2300-525高效液相色譜法 (HPLC) 檢測發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物甲酸、乙酸、乳酸、琥珀酸、2,3-丁二醇等的含量。分析條件為：色譜柱為阿波羅 C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相 20 mmol/L KH2PO4，pH 2.3，流速0.5 mL/min，紫外檢測波長為210 nm，進樣量為5 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的PCR擴增及序列測定

以Klebsiellasp. HQ-3基因組DNA為模板，擴增得到的目的基因片段大小分別約 750 bp、1 700 bp和1 200 bp，與預(yù)期相符。DNA測序分析表明，成功克隆到Klebsiellasp. HQ-3中fnr、fdhF、pncB全長基因，其開放閱讀框 (Open Reading Frame，ORF) 全長分別為 753 bp、1 680 bp和 1 203 bp。3條基因序列在 GenBank上注冊的登錄號分別為Accession No. KC183718，Accession No. KC183719和 Accession No.KC183717。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與驗證

以重組菌中的表達質(zhì)粒為模板，進行 PCR驗證，擴增產(chǎn)物大小與預(yù)期值相符 (圖 3A)。以SacⅠ/Hind Ⅲ雙酶切驗證，pET28a-Pkan-fnr和pET28a-Pkan-pncB構(gòu)建成功。EcoRⅠ/Hind Ⅲ雙酶切表明pET28a-Pkan-fdhF構(gòu)建成功 (圖3B)。重組菌株分別命名為 HQ-3-fnr，HQ-3-pncB，HQ-3-fdhF及對照菌株HQ-3-C。

2.3 fnr、pncB和 fdhF基因在克雷伯菌中過表達

重組菌株經(jīng)細胞破碎、離心，取等量上清進行SDS-PAGE電泳分析，以克雷伯菌HQ-3-C作對照 (圖4)。fnr、pncB和fdhF基因所表達的目的蛋白量較對照有增加，大小一致，表明fnr、pncB和fdhF基因均在Klebsiellasp. HQ-3中實現(xiàn)了過表達。

2.4 重組菌批次發(fā)酵性能分析

在14 h批次厭氧產(chǎn)氫發(fā)酵中，培養(yǎng)基pH值隨發(fā)酵時間逐漸降低，如圖5所示。由于在產(chǎn)氫過程中同時伴有代謝產(chǎn)物有機酸的生成，但重組菌培養(yǎng)基pH值降低較對照菌株慢。發(fā)酵終止后，發(fā)酵液的最終pH維持在4.7左右。

圖3 重組質(zhì)粒的驗證Fig. 3 Confirmation of recombinant plasmids. (A) PCR amplification verification. M: DNA marker (DS 5 000); 1:PCR product of pET28-pkan-fnr from HQ-3-fnr; 2: PCR product of pET28-pkan-pncB from HQ-3-pncB; 3: PCR product of pET28-pkan-fdhF from HQ-3-fdhF. (B) Restriction analysis of recombinant plasmids. M: DNA marker (DS 5 000); 1: SacⅠ/HindⅢ digestion verification of pET28-pkan-fnr vector from HQ-3-fnr; 2: SacⅠ/Hind Ⅲ digestion verification of pET28-pkan-pncB vector from HQ-3-pncB; 3: EcoRⅠ/HindⅢ digestion verification of pET28-pkanfdhF vector from HQ-3-fdhF.

圖 4 fnr、pncB、fdhF基因在克雷伯氏菌中表達的SDS-PAGE電泳分析Fig. 4 SDS-PAGE analysis of the expression of fnr,pncB, fdhF gene in Klebsiella sp. HQ-3. M: protein marker; 1: supernatant fluid of cell lysate from HQ-3-C;2: supernatant fluid of cell lysate from HQ-3-fnr; 3:supernatant fluid of cell lysate from HQ-3-pncB; 4:supernatant fluid of cell lysate from HQ-3-fdhF.

各菌株的生長曲線見圖6。重組菌株的生長比對照菌株略有減慢，但整體差別并不顯著?？赡苁怯捎诒M管因代謝因子的過表達導(dǎo)致菌株代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生了一些改變，但該代謝支路在菌體生長代謝中并非起主導(dǎo)作用，因此對重組菌的生長影響有限。

圖5 對照菌株與重組菌株隨時間的pH變化比較Fig. 5 Comparison of time course of pH between HQ-3-C and the recombinants.

在厭氧批次發(fā)酵中，菌株隨發(fā)酵時間的累積產(chǎn)氫量如圖7所示。可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，累積產(chǎn)氫量也在不斷增加。在發(fā)酵初期的6 h內(nèi)，工程菌的產(chǎn)氫量與對照菌株無顯著差別。對照菌株在8 h后累積產(chǎn)氫量趨于穩(wěn)定，而工程菌在后期仍有較高的發(fā)酵產(chǎn)氫能力，12 h后累積氫產(chǎn)量才開始趨于穩(wěn)定。3株工程菌的產(chǎn)氫量較對照菌株HQ-3-C相比均有不同幅度的提高。其中工程菌 HQ-3-fnr的累積產(chǎn)氫量最大，達58.1 mmol/L。

圖 6 對照菌株與重組菌株隨時間的細胞生長過程比較Fig. 6 Comparison of time course of cell growth (in term of OD600) between HQ-3-C and the recombinants.

圖7 對照菌株與重組菌株隨時間的累積產(chǎn)氫量比較Fig. 7 Comparison of time course of cumulative H2 production between HQ-3-C and the recombinants.

2.5 代謝產(chǎn)物分析

克雷伯菌葡萄糖厭氧發(fā)酵代謝見圖8。以高效液相色譜分別檢測了對照菌株及重組菌株搖瓶培養(yǎng)的發(fā)酵液組分，以 DNS法測定還原糖消耗量。表2顯示了發(fā)酵14 h后工程菌株和對照菌株培養(yǎng)基中剩余葡萄糖量及各代謝終產(chǎn)物的濃度。從中可以看出，3種工程菌株的葡萄糖消耗能力均高于對照菌株，HQ-3-fnr具有最高的葡萄糖利用效率，較對照菌株高出21.7%。

同樣，細胞外代謝終產(chǎn)物也有較大變化。葡萄糖厭氧發(fā)酵過程中，產(chǎn)生的甲酸量等于乙酸生成量與乙醇生成量之和。通過表2中代謝產(chǎn)物的分析可知，工程菌HQ-3-fnr與HQ-3-fdhF在代謝過程中產(chǎn)生的甲酸量明顯高于對照菌株，這是因為fnr、fdhF基因過表達促進了甲酸裂解產(chǎn)生氫氣，與此同時，也促進了上游丙酮酸向甲酸的轉(zhuǎn)化，從而表觀上甲酸量增加。而工程菌發(fā)酵液中甲酸的最終含量減少，說明工程菌消耗了較多甲酸生成氫氣，這也與實驗中工程菌氫氣產(chǎn)量增多相一致。

同時可以看出，HQ-3-pncB發(fā)酵液中乙醇和琥珀酸含量有增加，而乳酸的含量減少。pncB基因過表達使 NAD(H) 總量明顯增加，而NADH/NAD+比例下降，進而使細胞代謝流重新分配[3,22-23]。在整個發(fā)酵過程中，代謝流向著消耗 NADH較多的途徑，乙醇和琥珀酸的合成均需要消耗2 mol NADH，而乳酸合成僅消耗1 mol NADH。因此，本研究所使用的策略，在促進了產(chǎn)氫的同時，使代謝更偏于合成乙醇和琥珀酸方向。

圖8 克雷伯菌葡萄糖厭氧發(fā)酵代謝過程[21]Fig. 8 Anaerobic fermentation metabolic process of glucose in Klebsiella sp. HQ-3[21].

2.6 重組克雷伯氏菌產(chǎn)氫特性的測定

厭氧代謝產(chǎn)氫過程中，總產(chǎn)氫量由所消耗的葡萄糖轉(zhuǎn)化而來。表 2表明同源表達fnr、fdhF與pncB基因的工程菌葡萄糖消耗量比對照菌株均有明顯增加。研究認為，總產(chǎn)氫量是由甲酸裂解途徑產(chǎn)氫與 NADH途徑產(chǎn)氫的總和[24]。圖 9顯示出對照菌株與重組工程菌株厭氧發(fā)酵總產(chǎn)氫量，甲酸裂解途徑產(chǎn)氫量及NADH途徑產(chǎn)氫量之間的關(guān)系。從中可以看出，工程菌株HQ-3-fnr、HQ-3-pncB和 HQ-3-fdhF總產(chǎn)氫量較對照菌株均有所提高，每 mol葡萄糖中累積產(chǎn)氫量由0.991 mol 分別提高到 1.113 mol、1.106 mol、1.063 mol，分別提高了 12.26%、11.62%和7.28%。

同樣，工程菌株中由甲酸裂解途徑產(chǎn)生的氫氣量較對照菌株也有明顯增加，因為fnr基因正向調(diào)控甲酸裂解產(chǎn)氫，而fdhF基因編碼的甲酸脫氫酶則是作為甲酸氫裂解酶系統(tǒng) FHL的重要組分影響著甲酸裂解產(chǎn)氫代謝過程。pncB基因編碼煙酸轉(zhuǎn)磷酸核糖激酶能促進 NADH途徑中NAD+與NADH合成，當細胞內(nèi)還原力過剩時，細菌一般會利用多余的還原力生成氫氣，以維持細胞內(nèi)平衡的氧化還原態(tài)[16,25]。但本研究發(fā)現(xiàn)，pncB基因的過量表達并未提高NADH途徑中氫氣的產(chǎn)量，而是使甲酸裂解途徑的產(chǎn)氫量升高，可能的原因是 NADH的增加促進了乙醇含量的升高，而使細胞中產(chǎn)生的甲酸量增加，從而促進了甲酸裂解產(chǎn)氫[26]。

表2 對照菌株與工程菌株葡萄糖消耗及代謝產(chǎn)物分析Table 2 Analysis of consumed substrate and anaerobic metabolic after 14 h cultivation of HQ-3-C and various mutants

圖9 表達菌株和對照菌株的產(chǎn)氫特性比較Fig. 9 Comparison of hydrogen production in wild type and recombinant strains.

3 結(jié)論

本文首次通過同源過表達雷伯菌代謝正調(diào)控因子fnr、pncB和fdhF基因，構(gòu)建高效產(chǎn)氫基因工程菌。厭氧發(fā)酵結(jié)果表明，相較含空質(zhì)粒的對照菌株，工程菌產(chǎn)氫量均有提高，底物產(chǎn)氫效率分別由原來每mol葡萄糖產(chǎn)的0.991 mol提高到 1.113 mol、1.106 mol和 1.063 mol。進一步對發(fā)酵后葡萄糖的消耗量、菌株生物量，以及厭氧發(fā)酵代謝產(chǎn)物的分析顯示，基因過表達工程菌中代謝產(chǎn)物的變化幾乎一致，菌株 HQ-3-fnr與HQ-3-fdhF發(fā)酵液中乙酸和乙醇的總和 (即甲酸量) 較對照菌株 HQ-3-C有明顯增加，而在發(fā)酵過程中工程菌的甲酸利用率更高，導(dǎo)致最終發(fā)酵液中甲酸含量較HQ-3-C減少，甲酸裂解途徑中的產(chǎn)氫量增加。工程菌HQ-3-pncB中，產(chǎn)生較多的 NADH使代謝向著消耗還原力的方向，因此乳酸含量降低，乙醇與琥珀酸含量增高。本研究提示，在厭氧發(fā)酵過程中，過表達代謝調(diào)控因子可促進產(chǎn)氫途徑中相關(guān)酶的活性，進而提高細菌的產(chǎn)氫能力，是一種提高厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫的潛在技術(shù)手段。

[1]Show KY, Lee DJ, Tay JH, et al. Biohydrogen production: Current perspectives and the way forward. Int J Hydrogen Energy, 2012,37(20):15616?15631.

[2]Fan Z, Yuan L, Chatterjee R. Increased hydrogen production by genetic engineering ofEscherichia coli. PLoS ONE, 2009, 4(2): e4432.

[3]Heuser F, Schroer K, Lütz S, et al. Enhancement of the NAD(P)(H) pool inEscherichia colifor biotransformation. Eng Life Sci, 2007, 7(4):343?353.

[4]Ying W. NAD+and NADH in cellular functions and cell death. Front Biosci, 2006, 11(9):3129?3148.

[5]Zhang C, Lv FX, Xing XH. Bioengineering of theEnterobacter aerogenesstrain for biohydrogen production. Bioresour Technol, 2011, 102(18):8344?8349.

[6]Kumar N, Das D. Enhancement of hydrogen production byEnterobacter cloacaeIIT-BT 08.Process Biochem, 2000, 35(6): 589?593.

[7]Tanisho S, Ishiwata Y. Continuous hydrogen production from molasses by the bacteriumEnterobacter aerogenes. Int J Hydrogen Energy,1994, 19(10): 807?812.

[8]Bai LP, Wua XB, Jiang LJ, et al. Hydrogen production by over-expression of hydrogenase subunit in oxygen-tolerantKlebsiella oxytocaHP1.Int J Hydrogen Energy, 2012, 37(17):13227?13233.

[9]Xu FC, Hong HS. Effects ofadhEGene knock-out on hydrogen evolution ofKlebsiella oxytocaHP1.Acta Sci Nat Uni Sunyatseni, 2007, 46(1): 327?328(in Chinese).

徐方成, 洪華生.Klebsiella oxytocaHP1乙醇脫氫酶基因敲除對產(chǎn)氫的影響. 中山大學(xué)學(xué)報, 2007,46(1): 327-328.

[10]Zhu JB. Construction ofKlebsiella oxytocaHP1 mutants by homologous recombination to enhance hydrogen evolution [D]. Xiamen: Xiamen University, 2007 (in Chinese).

朱俊波. 產(chǎn)酸克雷伯氏菌 (Klebsiella oxytoca)HP1高效產(chǎn)氫工程菌的構(gòu)建[D]. 廈門: 廈門大學(xué), 2007.

[11]Berríos-Rivera SJ, San KY, Bennett GN. The effect of NAPRTase overexpression on the total levels of NAD, the NADH/NAD+ratio, and the distribution of metabolites inEscherichiacoli. Metab Eng,2002, 4(3): 238?247.

[12]Self WT, Hasona A, Shanmugam KT. Expression and regulation of a silent operon, hyf, coding for hydrogenase 4 isoenzyme inEscherichia coli. J Bacteriol, 2004, 186(2): 580–587.

[13]Salmon K, Hung SP, Mekjian K, et al. Global gene expression profiling inEscherichia coliK12.The effects of oxygen availability and FNR. J Biol Chem 2003, 278(32): 29837?29855.

[14]Perrenoud A, Sauer U. Impact of global transcriptional regulation by ArcA, ArcB, Cra, Crp,Cya, Fnr, and Mlc on glucose catabolism inEscherichia coli. J Bacteriol, 2005, 187(9):3171?3179.

[15]Constantinidou C, Hobman JL, Griffiths L, et al. A reassessment of the FNR regulon and transcriptomic analysis of the effects of nitrate,nitrite, NarXL, and NarQP asEscherichia coliK12 adapts from aerobic to anaerobic growth. J Biol Chem, 2006, 281(8): 4802?4815.

[16]Fan Z, Yuan L, Chatterjee R. Increased hydrogen production by genetic engineering ofEscherichia coli. PLoS ONE, 2009, 4(2): e4432.

[17]San K, Bennett GN, Berr?os-Rivera SJ, et al.Metabolic engineering through cofactor manipulation and its effects on metabolic flux redistribution inEscherichia coli. Metab Eng,2002, 4(2): 182?192.

[18]Berrios-Rivera SJ, Bennett GN, San KY. Metabolic engineering ofEscherichia coli: Increase of NADH availability by overexpressing an NAD+-dependent formate dehydrogenase. Metab Eng, 2002, 4(3):217?229.

[19]Liang LY, Liu RM, Wang GM, et al. Regulation of NAD(H) pool and NADH/NAD+ratio by overexpression of nicotinic acid phosphoribosyltransferase for succinic acid production inEscherichia coliNZN111. Enzyme Microb Technol, 2012, 51(5): 286?293.

[20]Miller GL. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal Chem, 1959,31(3): 426?428.

[21]Converti A, Perego P. Use of carbon and energy balances in the study of the anaerobic metabolism ofEnterobacter aerogenesat variable starting glucose concentrations. Appl Microbiol Biotechnol,2002, 59(2–3): 303?309.

[22]Vemuri GN, Eiteman MA, Altman E. Effects of growth mode and pyruvate carboxylase on succinic acid production by metabolically engineered strains ofEscherichia coli. Appl Environ Microb, 2002,68(4): 1715?1727.

[23]Berríos-Rivera SJ, San KY, Bennett GN. The effect of NAPRTase overexpression on the total levels of NAD, the NADH/NAD+ratio, and the distribution of metabolites inEscherichia coli. Metab Eng,2002, 4(3): 238?247.

[24]Lu Y, Zhao HX, Zhang C. Expression of NAD+-dependent formate dehydrogenase inEnterobacter aerogenesand its involvement in anaerobic metabolism and H2production.Biotechnol Lett, 2009, 31(10): 1525?1530.

[25]Niu K, Zhang X, Tan W, et al. Effect of culture conditions on producing and uptake hydrogen flux of biohydrogen fermentation by metabolic flux analysis method. Bioresour Technol, 2011,102(15): 7294?7300.

[26]Zhang C, Ma K, Xing XH. Regulation of hydrogen production ofEnterobacter aerogenesby external NADH and NAD+. Int J Hydrogen Energy, 2009,34(1/3): 1226?1232.