集胞藻PCC6803高效基因表達(dá)平臺(tái)的構(gòu)建與評(píng)價(jià)

齊鳳霞，談曉明，呂雪峰,3

1 中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所 中國科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101

2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

3 山東省能源生物遺傳資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101

藍(lán)細(xì)菌是一種光合原核微生物，可以直接利用太陽能、二氧化碳和水進(jìn)行生長，并且具有生長速度快、光合作用效率高等優(yōu)點(diǎn)，因此是一種理想的生物工程宿主，在生物能源、生物制藥及生產(chǎn)精細(xì)化學(xué)品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景[1]。

單細(xì)胞藍(lán)細(xì)菌菌株集胞藻 PCC6803(Synechocystissp. strain PCC 6803) 是研究光合作用機(jī)制和藍(lán)藻基因工程的模式生物，可以通過自然轉(zhuǎn)化吸收外源DNA[2]，其基因組序列[3]已經(jīng)于 1996年被測定，是第一個(gè)基因組全序列被測定的藍(lán)細(xì)菌菌株，遺傳背景相對(duì)其他藍(lán)細(xì)菌較為清晰。近年來，通過基因工程改造集胞藻PCC6803，已經(jīng)成功生物合成多種高價(jià)值分子產(chǎn)品，如天然營養(yǎng)素藻藍(lán)蛋白[4]及食用香料β-石竹烯[5]等，以及化工產(chǎn)品如聚-β-羥丁酸 (PHB)[6]、聚左旋乳酸 (PLA) 前體左旋乳酸[7]、藍(lán)藻胞外多糖 (EPS)[8]、丙酮[9]和異戊二烯[10]等。此外，集胞藻PCC6803也是合成生物燃料的模式基因工程宿主，已經(jīng)成功合成生物乙醇[11-12]、異丁醇[13]、中長鏈脂肪酸[14-15]、脂肪醇及脂肪烴[16]等生物燃料產(chǎn)品。

藍(lán)細(xì)菌雖然具備可持續(xù)生產(chǎn)目的產(chǎn)物的優(yōu)勢，但和傳統(tǒng)的生物工程宿主如大腸桿菌相比，藍(lán)細(xì)菌對(duì)外源基因的表達(dá)效率仍然較低，如何使目的基因在藍(lán)藻中得到高效表達(dá)是一個(gè)關(guān)鍵問題。因此，在藍(lán)細(xì)菌中開發(fā)和構(gòu)建高效的基因表達(dá)平臺(tái)，對(duì)于藍(lán)細(xì)菌代謝工程研究以及提高基因工程藍(lán)細(xì)菌的終產(chǎn)物產(chǎn)量具有重要意義。

集胞藻 PCC6803中的外源基因表達(dá)載體分為基因組整合載體和穿梭載體，可以通過自然轉(zhuǎn)化[17]或者接合轉(zhuǎn)移[18-19]的方法將目的基因?qū)胨{(lán)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)?；蚪M整合載體可以將目的基因乃至整個(gè)操縱子通過同源整合的方式整合到藍(lán)藻基因組中，其優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)穩(wěn)定，可以克服自主復(fù)制質(zhì)粒不穩(wěn)定的缺點(diǎn)。而穿梭質(zhì)粒載體則通過接合轉(zhuǎn)移導(dǎo)入藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞并在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行自主復(fù)制，其拷貝數(shù)常較低，但具有在多個(gè)藻株內(nèi)的穿梭表達(dá)的優(yōu)勢。

目前已經(jīng)有多個(gè)啟動(dòng)子在藍(lán)細(xì)菌中得到應(yīng)用，如Susan S. Golden實(shí)驗(yàn)室在聚球藻PCC7942外源基因表達(dá)平臺(tái)中使用了光合系統(tǒng)II D1蛋白基因psbA2的啟動(dòng)子PpsbA2[20]以及IPTG誘導(dǎo)性啟動(dòng)子 Ptrc[21]。在集胞藻 PCC6803中得到應(yīng)用的啟動(dòng)子有 PpsbA2[12,14]、銅離子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PpetE[22-23]以及鎳離子誘導(dǎo)性啟動(dòng)子[24]等。同時(shí)，Huang等以熒光蛋白基因gfp為報(bào)告基因構(gòu)建并評(píng)估了細(xì)菌來源的啟動(dòng)子 Ptrc和 Ptac在集胞藻PCC6803中的表達(dá)效率[25]。此外，1,5-二磷酸核酮糖縮化酶 (RuBisCO) 是藍(lán)細(xì)菌體內(nèi)主要的可溶性蛋白，因此其啟動(dòng)子 Prbc被認(rèn)為是一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子并已經(jīng)成功在聚球藻PCC6301[26-27]、魚腥藻PCC7120[28]和聚球藻PCC7942[29]中成功應(yīng)用。然而目前在集胞藻PCC6803中使用rbc啟動(dòng)子表達(dá)外源蛋白的報(bào)道僅有一例，2011年，Liu等[14]發(fā)表在 PNAS的文章中克隆了rbcL基因上游206 bp的片段作為啟動(dòng)子表達(dá)硫酯酶Ch FatB2。但是，使用該長度啟動(dòng)子的突變株 (SD232) 并沒有成功表達(dá)基因并獲得目的產(chǎn)物癸酸和辛酸，而使用 PpsbA2啟動(dòng)子表達(dá)相同基因的突變株(SD243) 則可以成功合成目的產(chǎn)物，該結(jié)果說明集胞藻PCC6803rbcL上游206 bp的片段并不能正常發(fā)揮啟動(dòng)子的功能。因此本文嘗試在集胞藻PCC6803中重新克隆不同長度的rbc啟動(dòng)子，系統(tǒng)研究其外源基因表達(dá)效率，并為基因工程改造藍(lán)細(xì)菌篩選有效的啟動(dòng)子元件。

在集胞藻 PCC6803中，RuBisCO的編碼基因rbcL、rbcX和rbcS串聯(lián)在同一個(gè)操縱子上，由同一個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá) (圖1)。Amichay等[30]推斷出rbcL上游250 bp的區(qū)域?yàn)閞bc操縱子的啟動(dòng)子元件，并通過測序和序列分析認(rèn)為在rbcL上游?15～?10區(qū)有類似SD序列，并且在翻譯起始密碼子上游60 bp處發(fā)現(xiàn)兩處類似?10區(qū)和?35區(qū)的序列。

在大腸桿菌的研究表明，SD序列以及間隔序列 (SD-AUG) 對(duì)基因翻譯具有重要影響，改變間隔序列的堿基數(shù)目將使得外源蛋白的表達(dá)效率發(fā)生顯著變化[31-32]。SD-AUG的距離同樣影響外源蛋白在藍(lán)細(xì)菌中的翻譯，如 Takeshima等[26]在聚球藻 PCC6301中發(fā)現(xiàn)表達(dá)產(chǎn)物人類超氧化物歧化酶時(shí)，證明 hSOD的比酶活隨著SD-AUG間隔變大而顯著降低。Deng等[29]在聚球藻PCC7942中表達(dá)丙酮酸脫羧酶基因pdc時(shí)，保持了rbcLS啟動(dòng)子自身的SD-AUG，將pdc基因與啟動(dòng)子自帶的 ATG進(jìn)行融合表達(dá)，結(jié)果證明 PDC蛋白表達(dá)量提高了近 2倍。而在表達(dá)乙醇脫氫酶基因adh時(shí)，采用的是adh基因自身的31 bp的SD序列，其蛋白表達(dá)量則基本不變。由此證明，使用藍(lán)細(xì)菌自身的SD-AUG序列更有利于外源基因在藍(lán)細(xì)菌中的表達(dá)。

轉(zhuǎn)錄終止序列可以終止轉(zhuǎn)錄及提高基因的表達(dá)效率，在藍(lán)藻中被廣泛應(yīng)用，如 Takeshima等[26]在聚球藻 PCC6301中表達(dá)人類超氧化物歧化酶基因hSOD時(shí)使用rbc啟動(dòng)子，同時(shí)在hSOD基因下游加入rbc的終止序列。Deng等[29]在聚球藻 PCC7942中串聯(lián)表達(dá)pdc和adh兩個(gè)基因時(shí)則在表達(dá)元件下游加入了目的基因adh自帶的終止序列。

構(gòu)建有效的遺傳改造工具是基因工程藍(lán)細(xì)菌生物合成生物燃料等產(chǎn)品的基礎(chǔ)。通過選取強(qiáng)啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止序列作為有效的基因表達(dá)元件，并采用融合表達(dá)策略，本文成功構(gòu)建了可以在集胞藻 PCC6803中高效表達(dá)外源基因的一組基因組整合表達(dá)平臺(tái)，并同時(shí)構(gòu)建了可以在多株藍(lán)細(xì)菌中表達(dá)的穿梭表達(dá)平臺(tái)，并且通過lacZ報(bào)告基因測定了表達(dá)平臺(tái)pFQ20的表達(dá)效率，以及將該表達(dá)平臺(tái)應(yīng)用于表達(dá)大腸桿菌硫酯酶基因tesA’。

1 材料與方法

1.1 試劑

鄰硝基苯 β-D-半乳吡喃糖苷 (ONPG) 購自Sigma-Aldrich公司 (美國)。其他化學(xué)試劑購自Merck 公司 (德國) 或 Amresco 公司 (美國)。TaqDNA聚合酶和限制性內(nèi)切酶購自Fermentas公司(加拿大) 或者TaKaRa公司 (日本)。用于分子克隆的試劑盒購自 Omega公司 (美國) 或 TaKaRa公司 (日本)。DNA引物在Sangon公司 (中國上海) 合成。DNA分子標(biāo)記購自TaKaRa (日本)。

1.2 集胞藻PCC6803的培養(yǎng)

菌株在 30 ℃條件下進(jìn)行連續(xù)光照培養(yǎng)(30 μE/(m2·s))，突變株 Syn-FQ20 和對(duì)照菌株Syn-HB1567在含有10 mg/L壯觀素的BG11中培養(yǎng)。用于測定β-半乳糖苷酶活性的藻株在裝樣量為20 mL的50 mL三角瓶中進(jìn)行搖床培養(yǎng)，搖動(dòng)速度為 140 r/min。用于 SDS-PAGE及 Western blotting的藻株，在裝樣量為300 mL的500 mL三角瓶中進(jìn)行通氣培養(yǎng)。

1.3 質(zhì)粒和集胞藻突變株的構(gòu)建

所有引物見表1。以集胞藻PCC6803基因組DNA為模板，以P1/P2和P3/P4為引物對(duì)，PCR得到長度分別為0.3 kb和0.2 kb的片段，將這兩個(gè)片段插入克隆載體pMD18-T (TaKaRa，日本)，分別得到質(zhì)粒pFQ1和pFQ2。

以XbaⅠ和SalⅠ酶切質(zhì)粒質(zhì)粒pFQ1，回收0.3 kb片段；將同樣以XbaⅠ和SalⅠ酶切pQL4，用 T4連接酶將小片段插入到 pQL4壯觀抗性基因?[17,19]下游，經(jīng)過篩選鑒定，得到質(zhì)粒pFQ5。同樣方法，以SmaⅠ-SacⅠ酶切 pFQ2，膠回收0.2 kb的片段插入到酶切pFQ5中，經(jīng)篩選得到了質(zhì)粒pFQ6。

用Hind Ⅲ和SacⅠ酶切pFQ6切膠回收獲得?-Prbc-Trbc(2.5 kb) 片段，利用T4聚合酶補(bǔ)平后插入質(zhì)粒pKW1188SL[17]的EcoRⅠ位點(diǎn)，后者系用EcoRⅠ切開并補(bǔ)平處理；利用特異引物PCR鑒定目的片段插入方向，正向克隆命名為pFQ9F，反向插入的克隆被命名為pFQ9R (圖2)。同理，將補(bǔ)平后的 ?-Prbc-Trbc插入穿梭質(zhì)粒pRL59EH[33-34]的HindⅢ位點(diǎn)，篩選鑒定后得到穿梭表達(dá)平臺(tái) pFQ16 (圖1)。

lacZ基因是以大腸桿菌E. coliBL21 (DE3)基因組 DNA為模板，利用引物對(duì)lacZ-1/lacZ-2擴(kuò)增而來，將所得片段插入到 pUC19質(zhì)粒，得到質(zhì)粒pQL12；以集胞藻PCC6803基因組DNA為模板，利用P5/P6為引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到的1.3 kb的PrbcL片段；用XbaⅠ和SmaⅠ酶切pQL12，膠回收lacZ基因片段，插入到pFQ9F中，得到的質(zhì)粒再用SalⅠ和XbaⅠ酶切，并用同樣酶切PrbcL，利用SalⅠ和XbaⅠ位點(diǎn)，將Prbc替換1.3 kb的PrbcL，得到質(zhì)粒pFQ20 (圖1)。

以大腸桿菌DH5α基因組 DNA為模板，利用QLtesA-1/QLtesA-2為引物，擴(kuò)增得到0.56 kb的tesA’[35-36]，并用NdeⅠ和XhoⅠ酶切后插入到pET21b，得到質(zhì)粒 pQL5；以pQL5為模板，利用 tesA-1/tesA-3為引物，片段克隆帶有 his-tag的片段tesA’-histag并插入到 pMD18-T，得到質(zhì)粒pFQ4。利用XbaⅠ和SmaⅠ酶切pFQ4，回收tesA’-histag并插入到pFQ20的相同位點(diǎn)，得到表達(dá)質(zhì)粒pFQ25。所有載體構(gòu)建均經(jīng)過酶切或者測序驗(yàn)證。將表達(dá)質(zhì)粒按Williams和Zang等[17,37]所述的方法轉(zhuǎn)化集胞藻 PCC6803后，利用含有5 mg/L壯觀霉素的BG11瓊脂平板篩選轉(zhuǎn)化子，分別得到集胞藻突變株Syn-FQ20和Syn-FQ25。突變株中的外源基因表達(dá)元件均通過基因組PCR加以驗(yàn)證。

1.4 集胞藻PCC6803中β-半乳糖苷酶活性測定方法

基于 Miller[38]和 Gao等[22]描述的方法略有改動(dòng)。取生長對(duì)數(shù)期 (OD730在1.2～1.5之間) 的培養(yǎng)液進(jìn)行離心后，將細(xì)胞OD730統(tǒng)一調(diào)整為1.5。各取1.5 mL上述細(xì)胞再次離心收集后，用 1 mL 的 Z Buffer (60 mmol/L Na2HPO4，40 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L KCl，1 mmol/L MgSO4，40 mmol/L β-巰基乙醇) 重懸，依次加入 50 μL的 0.1% SDS、50 μL氯仿反應(yīng) 1 min使細(xì)胞裂解，再加入200 μL ONPG (4 g/L) 并轉(zhuǎn)移至 30 ℃反應(yīng) 20 min，加入 500 μL的 1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。反應(yīng)液于 12 000 r/min離心2 min將細(xì)胞碎片及氯仿沉淀到下層，取1.2 mL上清液測定OD420，以不含藻細(xì)胞的反應(yīng)液作為空白對(duì)照。根據(jù)公式 Miller=1 000×OD420/(1.5 mL×20 min×OD730) 計(jì)算β半乳糖苷酶活性。

表1 本研究中所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.5 蛋白印跡法 (Western blotting) 測定外源蛋白的表達(dá)

200 mL的集胞藻培養(yǎng)液離心收集，用10 mL 40 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 重懸藻細(xì)胞，加入終濃度1 mmol/L蛋白酶抑制劑PMSF。在冰水浴中超聲破碎細(xì)胞，每超聲30 s間隔30 s～1 min，有效超聲時(shí)間為5 min。隨后，5 000×g離心30 min去除細(xì)胞殘?jiān)?。得到的蛋白樣品?jīng)過SDS-PAGE和 Western blotting檢測。Western blotting采用PVDF膜 (Roche，美國)。利用 6×His-標(biāo)簽探針標(biāo)記目的蛋白，最終使用堿性磷酸酶顯色試劑盒(Amresco，美國) 進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因表達(dá)元件的克隆與設(shè)計(jì)

本實(shí)驗(yàn)基于不同長度的rbc啟動(dòng)子構(gòu)建了4個(gè)平臺(tái)質(zhì)粒pFQ9F、pFQ9R、pFQ16 (圖 1) 以及pFQ20 (圖2)，并選擇了其中一個(gè)平臺(tái)用lacZ報(bào)告基因比較了與 pHB1567的驅(qū)動(dòng)活性差異。為保證rbc啟動(dòng)子對(duì)外源蛋白的翻譯效率，本研究采用了一種翻譯融合策略，以保持rbc啟動(dòng)子的核糖體結(jié)合位點(diǎn)SD序列以及SD序列和ATG的間隔序列 (SD-AUG)。通過PCR克隆了rbc啟動(dòng)子，包涵了rbcL的ATG，并在ATG下游插入一個(gè)XbaⅠ位點(diǎn)供外源基因插入，使得目的基因與rbcL的 ATG及酶切位點(diǎn)序列一起融合表達(dá)(圖1)。在克隆表達(dá)外源基因時(shí)，需要通過設(shè)計(jì)引物克隆目的基因片段 (不含起始密碼子)，將其插入到啟動(dòng)子和終止序列之間。同時(shí)選取rbcS終止密碼子下游 200 bp的片段作為外源基因表達(dá)元件的終止序列Trbc，并在兩端設(shè)計(jì)了酶切位點(diǎn) (圖 1)。

圖1 rbc啟動(dòng)子及終止序列克隆示意圖Fig. 1 Cloning of rbc promoter and terminator from the Synechocystis rbc operon. Prbc: the 280 bp rbc promoter;PrbcL: the 1 307 bp rbc promoter; Trbc: rbc terminator in Synechocystis; ATG: start codon; XbaⅠ, SalⅠ, SacⅠ, SmaⅠ:the enzyme restriction sites flanked the promoter and terminator fragments. The PCR primers are shown in the figure.Prbc and PrbcL were cloned with the start codon of rbcL and carrying an XbaⅠrestriction site downstream ATG.

圖2 本研究構(gòu)建的表達(dá)質(zhì)粒圖譜Fig. 2 Maps of the constructed gene expression plasmids. (A) pFQ9F: The direction of the expression cassette is forward to slr0168. The target gene fragment (without ATG) can be inserted to the XbaⅠ-SmaⅠsite between the promoter and the terminator. The SalⅠ-XbaⅠsite can be used for promoter replacement. slr0168N: the N terminal of slr0168; slr0168C: the C terminal of slr0168; Apr: ampicillin resistance gene; ?: Expression cassette for spectinomycin resistance gene; ori: replicon. (B) pFQ9R: the direction of the expression cassette is reverse to that of pFQ9F. (C)pFQ16: the shuttle vector that was designed for conjugative transfer of the expression cassette into other cyanobacteria strains.

2.2 集胞藻PCC6803外源基因表達(dá)平臺(tái)表達(dá)β-半乳糖苷酶酶活測定及表達(dá)效率對(duì)比

本文選擇了以pFQ20質(zhì)粒作為代表，用lacZ報(bào)告基因比較了與 pHB1567的驅(qū)動(dòng)活性差異。lacZ作為一種報(bào)告基因，具有不影響生物細(xì)胞的生長的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)在藍(lán)細(xì)菌得到運(yùn)用[39]。與其他報(bào)告蛋白，如熒光素酶[40]和熒光蛋白[41]相比，β-半乳糖苷酶以O(shè)NPG為底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，因此可以避免來自藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的還原醛以及光合色素等帶來的背景干擾，其測定具有顯色靈敏和區(qū)分度大的優(yōu)勢。因此，本文選用lacZ作為報(bào)告基因并檢測所構(gòu)建平臺(tái) pFQ20的表達(dá)效率(圖 3)。實(shí)驗(yàn)以含整合有壯觀抗性基因的突變株Syn-LY2[42]作為陰性對(duì)照，以整合有 PpetE啟動(dòng)子和lacZ報(bào)告基因的突變株Syn-HB1567[22]作為陽性對(duì)照。在Syn-HB1567中，銅離子誘導(dǎo)型啟動(dòng)子 PpetE在 BG11培養(yǎng)液 (銅離子濃度為316 nmol/L) 驅(qū)動(dòng)表達(dá)的 β-半乳糖苷酶活性為71.5 Miller，與已報(bào)道結(jié)果相近。與之相比，Syn-FQ20菌種中的 β-半乳糖苷酶活性為109 Miller，與對(duì)照啟動(dòng)子 PpetE[22]相比，PrbcL啟動(dòng)子表達(dá)效率高出52.5%。細(xì)胞的生長狀態(tài)對(duì)Miller值有一定的影響，因此本實(shí)驗(yàn)中采用對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞 (OD730在1.2～1.5之間) 進(jìn)行酶活性測定，因此 Miller值比生長中后期 (OD730＞1.5) 細(xì)胞所測得的更高。

2.3 集胞藻PCC6803表達(dá)大腸桿菌硫酯酶

為了檢驗(yàn)該表達(dá)構(gòu)建對(duì)外源蛋白的表達(dá)情況，本文以pFQ20為出發(fā)質(zhì)粒，克隆表達(dá)了來自大腸桿菌硫酯酶基因tesA’[35-36]，并在蛋白的羧基端加入了一個(gè) 6×His-tag標(biāo)簽以追蹤本表達(dá)平臺(tái)對(duì)外源蛋白的表達(dá)情況。

圖3 pFQ20質(zhì)粒結(jié)構(gòu)示意圖 (A) 及集胞藻PCC6803突變株中的β-半乳糖苷酶活性(B)Fig. 3 Structure of pFQ20 (A) and the β-galactosidase activity in Syn-FQ20 (B). (A) the lacZ gene was inserted into the pFQ20 using PrbcL as the promoter. (B) Syn-LY2 was used as a negative control, harboring the ? fragment in slr0168 locus; Syn-HB1567 was used as the positive control applying the copper-induced promoter of PpetE and the lacZ reporter gene. Syn-FQ20 was the mutant strain that transformed by pFQ20.

圖4 pFQ25構(gòu)建 (A)、PCR檢測Syn-FQ25突變株的基因型 (B) 以及Western blotting (C) 檢測大腸桿菌硫酯酶A在集胞藻PCC6803突變株中的表達(dá)Fig. 4 Map of pFQ25 (A) and PCR analysis of the genotype of Syn-FQ25 (B) and Western blotting (C) analysis of E. coli TesA’ expression in Syn-FQ25. (B) M: DNA marker (200 bp DNA Ladder); 1: blank control (PCR without DNA template); 2: negative control (genomic DNA of wild type Synechocystis was used as template for PCR); 3: PCR product using the genomic DNA of Syn-FQ25 as a template, the same primers of slr0168-3 and tesA-1 were used in 1–3; (C) M: protein marker; 2: the negative control of Syn-LY2; 3: positive control using a purified his-tagged enzyme;4–6: triplicate samples of strain Syn-FQ25.

表達(dá)質(zhì)粒 pFQ25 (圖 4) 轉(zhuǎn)化集胞藻PCC6803，得到突變株 Syn-FQ25。突變株經(jīng)粗提蛋白質(zhì)后經(jīng)過 SDS-PAGE (濃度為 12%) 和Western blotting檢測，結(jié)果顯示在20 kDa處有顯著條帶 (圖 4)。tesA’-histag長度為 576 bp，其編碼蛋白攜帶 6個(gè)組氨酸標(biāo)簽 (6×His-tag) 并在N端加入了兩個(gè)氨基酸 (XbaⅠ位點(diǎn)編碼)，總計(jì)191個(gè)氨基酸，預(yù)測分子量為21.7 kDa，所以，最終純化得到的蛋白與預(yù)測的蛋白大小基本相符，說明該表達(dá)平臺(tái)對(duì)外源蛋白具有很高的表達(dá)效率，可用于在集胞藻 PCC6803中表達(dá)外源蛋白。

3 討論

本文基于不同長度的rbc啟動(dòng)子構(gòu)建了4個(gè)可以用于集胞藻 PCC6803基因表達(dá)平臺(tái)質(zhì)粒，其中pFQ20表達(dá)質(zhì)粒采用lacZ報(bào)告基因比較了與 pHB1567的驅(qū)動(dòng)活性差異，同時(shí)利用該質(zhì)粒表達(dá)了外源的tesA’。結(jié)果顯示，pFQ20對(duì)報(bào)告基因的表達(dá)效率是 109 Miller，同時(shí) Western blotting檢測到了 TesA’明顯的條帶。文獻(xiàn)報(bào)道rbcL啟動(dòng)子是上游250 bp區(qū)域[30]，本文構(gòu)建的rbc啟動(dòng)子 (0.3 kb和1.3 kb) 包含了基因表達(dá)必需的元件，可以在藍(lán)細(xì)菌中高效穩(wěn)定表達(dá)外源基因的并合成目的產(chǎn)物。例如，Tan等[42]在Metabolic Engineering雜志上發(fā)表的藍(lán)細(xì)菌合成脂肪醇及脂肪烴的研究采用的就是本文構(gòu)建的表達(dá)平臺(tái)。其中，pFQ9R被用來表達(dá)脂酰還原酶基因far_jojoba，脂肪醇產(chǎn)量為(9.7±2.7) g/(L·OD730)，pFQ20被用于串聯(lián)表達(dá)乙酰輔酶 A羧化酶基因accBCDA基因，其脂肪烴產(chǎn)量提高到(161.6±10.3)g/(L·OD730)。以 PpetE為啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)相同基因合成脂肪醇產(chǎn)量為(5.3±1.2) g/(L·OD730)，脂肪烴產(chǎn)量提高到(114.9±13.7) g/(L·OD730)[42]。基于本表達(dá)平臺(tái)的突變株中脂肪醇和脂肪烴的產(chǎn)量更高。例如，Gao等[11]利用基于pFQ20表達(dá)平臺(tái)表達(dá)了丙酮酸脫羧酶 PDC以及乙醇脫氫酶ADH在集胞藻PCC6803中高效合成乙醇。例如，Gao等利用pFQ20平臺(tái)成功表達(dá)脂酰CoA合成酶 Slr1609[15,43]進(jìn)行酶學(xué)研究并成功測定了其對(duì)脂肪族產(chǎn)物的影響。同樣，廣宿主穿梭質(zhì)粒pFQ16具有相同的表達(dá)元件，又因藍(lán)細(xì)菌株系之間利用共用保守的核糖體，因此可以被應(yīng)用到其他的藍(lán)細(xì)菌菌株。本文沒有在其他藍(lán)細(xì)菌菌株中做進(jìn)一步效率測定。但已經(jīng)有報(bào)道證明藍(lán)細(xì)菌可以利用細(xì)菌來源的 Ptrc及 Ptac啟動(dòng)子[35]，因此集胞藻 PCC6803來源的啟動(dòng)子在其他藍(lán)細(xì)菌中應(yīng)更有優(yōu)勢。

4 結(jié)論

本文通過采用強(qiáng)啟動(dòng)子及強(qiáng)終止序列以及使用翻譯融合策略，保護(hù)啟動(dòng)子的SD序列及SD與起始密碼子之間的間隔序列 (SD-AUG)，構(gòu)建了高效的藍(lán)細(xì)菌基因表達(dá)平臺(tái)。本研究構(gòu)建的表達(dá)平臺(tái)在基因工程改造集胞藻合成生物燃料領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用價(jià)值，文中所采用的基因表達(dá)策略也為在藍(lán)細(xì)菌中高效穩(wěn)定表達(dá)外源基因提供了借鑒。

致謝：感謝中國科學(xué)院水生生物研究所徐旭東研究員及高宏副研究員為本研究提供 pHB1567質(zhì)粒，特致謝意!

[1]Ducat DC, Way JC, Silver PA. Engineering cyanobacteria to generate high-value products.Trends Biotechnol, 2011, 29(2): 95?103.

[2]Grigorieva G, Shestakov S. Transformation in the cyanobacteriumSynechocystissp. 6803. FEMS Microbiol Lett, 1982, 13(4): 367?370.

[3]Nakamura Y, Kaneko T, Hirosawa M, et al.CyanoBase, a WWW database containing the complete nucleotide sequence of the genome ofSynechocystissp. strain PCC 6803. Nucleic Acids Res, 1998, 26(1): 63?67.

[4]Deshmukh DV, Puranik PR. Statistical evaluation of nutritional components impacting phycocyanin production inSynechocystissp. Brazilian J Microbiol, 2012, 43(1): 348?355.

[5]Reinsvold RE, Jinkerson RE, Radakovits R, et al.The production of the sesquiterpene beta-caryophyllene in a transgenic strain of the cyanobacteriumSynechocystis. J Plant Physiol,2011, 168(8): 848?852.

[6]Wu GF, Shen ZY, Wu QY. Modification of carbon partitioning to enhance PHB production inSynechocystissp. PCC6803. Enzyme Microb Technol, 2002, 30(6): 710?715.

[7]Angermayr SA, Paszota M, Hellingwerf KJ.Engineering a cyanobacterial cell factory for the production of lactic acid. Appl Environ Microb,2012, 78(9): 7098?7106.

[8]Ozturk S, Aslim B, Suludere Z. Evaluation of chromium(VI) removal behaviour by two isolates ofSynechocystissp. in terms of exopolysaccha ride(EPS) production and monomer composition.Bioresour Technol, 2009, 100(23): 5588?5593.

[9]Zhou J, Zhang HF, Zhang YP, et al. Designing and creating a modularized synthetic pathway in cyanobacteriumSynechocystisenables production of acetone from carbon dioxide. Metab Eng, 2012,14(4): 394?400.

[10]Lindberg P, Park S, Melis A. Engineering a platform for photosynthetic isoprene production in cyanobacteria, usingSynechocystisas the model organism. Metab Eng, 2010, 12(1): 70?79.

[11]Gao ZX, Zhao H, Li ZM, et al. Photosynthetic production of ethanol from carbon dioxide in genetically engineered cyanobacteria. Energ Environ Sci, 2012, 5(12): 9857?9865.

[12]Dexter J, Fu PC. Metabolic engineering of cyanobacteria for ethanol production. Energ Environ Sci, 2009, 2(8): 857?864.

[13]Varman AM, Xiao Y, Pakrasi HB, et al. Metabolic Engineering ofSynechocystissp. strain PCC 6803 for isobutanol production. Appl Environ Microb,2013, 79(3): 908?914.

[14]Liu, XY, Sheng J, Curtiss III R. Fatty acid production in genetically modified cyanobacteria.Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(17):6899?6904.

[15]Gao QQ, Wang WH, Zhao H, et al. Effects of fatty acid activation on photosynthetic production of fatty acid-based biofuels inSynechocystissp.PCC6803. Biotechnol Biofuels, 2012, 5(1): 17.

[16]Hu P, Borglin S, Kamennaya NA, et al. Metabolic phenotyping of the cyanobacteriumSynechocystis6803 engineered for production of alkanes and free fatty acids. Appl Energy, 2013, 102: 850?859.

[17]Williams JGK. Construction of specific mutations in photosystem II photosynthetic reaction center by genetic engineering methods inSynechocystis6803.Method Enzymol, 1988, 167: 766?778.

[18]Kreps S, Ferino F, Mosrin C, et al. Conjugative transfer and autonomous replication of a pomiscuous IncQ plasmid in the cyanobacteriumSynechocystisPCC 6803. Mol Gen Genet, 1990,221(1): 129?133.

[19]Fürste JP, Pansegrau W, Frank R, et al. Molecular cloning of the plasmid RP4 primase region in a multi-host-range tacP expression vector. Gene,1986, 48(1): 119?131.

[20]Bustos SA, Golden SS. Expression of thepsbDIIgene inSynechococcussp. strain PCC 7942 requires sequences downstream of the transcription start site. J Bacteriol, 1991, 173(23): 7525?7533.

[21]Mackey SR, Choi JS, Kitayama Y, et al. Proteins found in a CikA interaction assay link the circadian clock, metabolism, and cell division inSynechococcuselongatus. J Bacteriol, 2008,190(10): 3738?3746.

[22]Gao H, Tang Q, Xu XD. Construction of copper-induced gene expression platform inSynechocystissp. PCC 6803. Acta Hydrobiol Sin,2007, 31(2): 240?244 (in Chinese).

高宏, 唐蜻, 徐旭東. 集胞藻 PCC6803銅離子誘導(dǎo)表達(dá)平臺(tái)的構(gòu)建. 水生生物學(xué)報(bào), 2007, 31(2):240–244.

[23]Briggs LM, Pecoraro VL, McIntosh L, et al.Copper-induced expression, cloning, and regulatory studies of the plastocyanin gene from the cyanobacteriumSynechocystissp. PCC 6803. Plant Mol Biol, 1990, 15(4): 633?642.

[24]Liu XY, Curtiss III R. Nickel-inducible lysis system inSynechocystissp. PCC 6803. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(51): 21550?21554.

[25]Huang HH, Camsund D, Lindblad P, et al. Design and characterization of molecular tools for a synthetic biology approach towards developing cyanobacterial biotechnology. Nucleic Acids Res,2010, 38(8): 2577?2593.

[26]Takeshima Y, Takatsugu N, Sugiura M, et al.High-level expression of human superoxide dismutase in the cyanobacterium Anacystis nidulans 6301. Proc Natl Acad Sci USA, 1994,91(21): 9685?9689.

[27]Takeshima Y, Sugiura M, Hagiwara H, et al. A novel expression vector for the cyanobacterium,SynechococcusPCC 6301. DNA Res, 1994, 1(4):181?189.

[28]Wang Y, Xu XD. Regulation byhetCof genes required for heterocyst differentiation and cell division inAnabaenasp. strain PCC 7120. J Bacteriol, 2005, 187(24): 8489?8493.

[29]Deng MD, Coleman JR. Ethanol synthesis by genetic engineering in cyanobacteria. Appl Environ Microb, 1999, 65(2): 523?528.

[30]Amichay D, Levitz R, Gurevitz M. Construction of aSynechocystisPCC6803 mutant suitable for the study of variant hexadecameric ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase enzymes.Plant Mol Biol, 1993, 23(3): 465?476.

[31]Gold L, Pribnow D, Schneider T, et al.Translational initiation in prokaryotes. Annu Rev Microbiol, 1981, 35(1): 365?403.

[32]Matteucci M, Heyneker H. Targeted random mutagenesis: the use of ambiguously synthesized oligonucleotides to mutagenize sequences immediately 5' of an ATG initiation codon. Nucleic Acids Res, 1983, 11(10): 3113?3121.

[33]Black TA, Wolk CP. Analysis of a Het-mutation inAnabaenasp. strain PCC 7120 implicates a secondary metabolite in the regulation of heterocyst spacing. J Bacteriol, 1994, 176(8): 2282?2292.

[34]Scholz P, Haring V, Wittmann-Liebold B, et al.Complete nucleotide sequence and gene organization of the broad-host-range plasmid RSF1010. Gene, 1989, 75(2): 271?288.

[35]Davis MS, Solbiati J, Cronan Jr JE. Overproduction of acetyl-CoA carboxylase activity increases the rate of fatty acid biosynthesis inEscherichia coli. J Biol Chem, 2000, 275(37): 28593?28598.

[36]Cho H, Cronan Jr JE. Defective export of a periplasmic enzyme disrupts regulation of fatty acid synthesis. J Biol Chem, 1995. 270(9): 4216?9.

[37]Zang X, Liu B, Liu SM, et al. Optimum conditions for transformation ofSynechocystissp. PCC 6803.J Microbiol, 2007, 45(3): 241.

[38]Miller JH. Experiments in Molecular Genetics.Miller JH, Editor. New York: Cold Spring Harbor Laboratory, 1972.

[39]Schaefer MR, Golden SS. Differential expression of members of a cyanobacterialpsbAgene family in response to light. J Bacteriol, 1989, 171(7):3973?3981.

[40]Kondo T, Strayer CA, Kulkarni RD, et al.Circadian rhythms in prokaryotes: luciferase as a reporter of circadian gene expression in cyanobacteria. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90(12): 5672?5676.

[41]Argueta C, Yuksek K. Summers M. Construction and use of GFP reporter vectors for analysis of cell-type-specific gene expression in Nostoc punctiforme. J Microbiol Methods, 2004, 59(2):181?188.

[42]Tan XM, Yao L, Gao QQ, et al. Photosynthesis driven conversion of carbon dioxide to fatty alcohols and hydrocarbons in cyanobacteria. Metab Eng, 2011, 13(2): 169?176.

[43]Gao QQ, Tan XM, Lu XF, Enzymatic and physiological characterization of fatty acid activation inSynechocystissp. PCC6803. J Basic Microbiol, 2013, doi: 10.1002/jobm.201200228.