2,3-丁二醇代謝途徑關鍵酶基因敲除對克雷伯氏菌發(fā)酵產(chǎn)1,3-丙二醇的影響

郭欣坤，方慧英 ，諸葛斌，宗紅，宋健，諸葛健

1 江南大學 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122

2 江南大學 生物工程學院工業(yè)微生物研究室，江蘇 無錫 214122

3 江南大學 化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122

1,3-丙二醇是一種三碳平臺化合物，是合成對苯二甲酸丙二醇酯、聚亞氨酯、聚醚、聚胺酯和芳香聚酯的重要單體[1-4]。自然界中能夠以甘油為底物生產(chǎn)1,3-丙二醇的菌主要有克雷伯氏菌Klebsialla、弗氏檸檬酸菌Citrobacter、乳桿菌Lactobacilli、梭菌Clostridia[5]等，其中克雷伯氏菌是生產(chǎn)強度和轉化率較高的菌種之一，其甘油代謝途徑分為還原途徑和氧化途徑：還原途徑生產(chǎn)1,3-丙二醇；氧化途徑提供生物生長所需的能量 (ATP)、生物量、還原當量 (NADH)，并形成2,3-丁二醇、乳酸、琥珀酸、乙酸、乙醇等副產(chǎn)物。

2,3-丁二醇與 1,3-丙二醇都含有兩個羥基，具有高沸點和與水互溶的特點，在發(fā)酵液精餾分離過程中，隨著2,3-丁二醇在液相中含量的降低，其在汽相中的摩爾分率越來越小，需要采用更大的回流比才能分離提純1,3-丙二醇，從而造成分離成本增高[6]。此外，2,3-丁二醇的合成需要消耗大量碳源和還原力NADH[7]，致使依賴NADH合成的1,3-丙二醇的轉化率大大降低，所以降低發(fā)酵過程中2,3-丁二醇的產(chǎn)量成為一個需要解決的問題[8-9]。

利用基因敲除技術消除發(fā)酵過程中副產(chǎn)物產(chǎn)生是一種提高目的產(chǎn)物產(chǎn)量的有效策略[10-14]。2,3-丁二醇合成途徑中有 3種酶：α-乙酰乳酸合成酶 (α-acetolactate synthetase，ALS)、α-乙酰乳酸 脫 羧 酶 (α-acetolactate decarboxylase ，α-ALDC) 和 2,3-丁二醇脫氫酶 (2,3-BD dehydrogenase，BDH)[15-16]。這三個酶的基因位于budABC操縱子上，其中budB編碼α-乙酰乳酸合成酶，budA編碼α-乙酰乳酸脫羧酶，budC編碼2,3-丁二醇脫氫酶。在2,3-丁二醇代謝途徑中，α-乙酰乳酸合成酶可以催化丙酮酸形成 α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸在 α-乙酰乳酸脫羧酶作用下形成3-羥基-2-丁酮，2,3-丁二醇脫氫酶催化3-羥基-2-丁酮形成 2,3-丁二醇 (圖 1)。本研究利用 Red同源重組技術[17]分別構建了budC和budA基因缺陷株，并通過發(fā)酵實驗考察這兩個基因的缺失對克雷伯氏菌發(fā)酵產(chǎn) 1,3-丙二醇的影響。

圖1 2,3-丁二醇的代謝途徑及相關酶[15]Fig. 1 Metabolism pathway of 2,3-butanediol and related enzymes[15]. E1: α-acetolactate synthase; E2: α-acetolactate decarboxylase; E3: 2,3-butanediol dehydrogenase.

1 材料與方法

1.1 菌株與質粒

克雷伯氏菌Klebsiella pneumoniaeZG25由本研究中心篩選并保藏。用于基因敲除所需要的工具質粒pKD13、pKD46和pCP20均購自美國耶魯大學大腸桿菌菌株庫。本研究中使用的引物見表1。

1.2 工具酶及試劑

質粒小量提取試劑盒、細菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒均購自北京博大泰克生物基因技術有限責任公司；TaqDNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA聚合酶購自寶生物工程 (大連) 有限公司；氨芐青霉素 (Amp)、卡那霉素 (Kan)、氯霉素 (Cm) 購自上海朝瑞生物技術有限公司，2-乙酰氧基-2-甲基-乙酰乙酸乙酯購于Sigma公司；L-阿拉伯糖、monohydrate 2-(N-嗎啉代) 乙烷磺酸一水、Brij-35聚環(huán)氧乙烯月桂酰醚購自生工生物工程 (上海) 有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 培養(yǎng)基與培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)基 (g/L)：酵母提取物 5，胰蛋白胨10，NaCl 10。葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基 (g/L)：胰蛋白胨5，葡萄糖5，K2HPO42。發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：甘油 40，葡萄糖 5，酵母膏 5，KH2PO47.5，MgSO42，(NH4)2SO42，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005，VB120.015，微量元素溶液10 mL/L，KOH調(diào)pH值至8.5。微量元素溶液 (g/L)：ZnCl20.07，MnCl2·4H2O 0.1，H3BO30.06，CoCl2·6H2O 0.2，CuCl20.02，NiCl2·6H2O 0.025，Na2MoO4·2H2O 0.035。需要時加入 Amp (100 μg/mL)、Kan(50 μg/mL)、Cm (34 μg/mL)。

種子培養(yǎng)：1%接種量 (V/V)、37 ℃、180 r/min培養(yǎng)6～7 h。發(fā)酵培養(yǎng)：250 mL三角瓶、50 mL裝液量，4%接種量 (V/V)，37 ℃、100 r/min旋轉式搖床振蕩培養(yǎng)，實驗重復3次，取平均值；5 L發(fā)酵罐 (韓國BIOTRO公司，型號：BIOG-M)，裝液量2.5 L，37 ℃，初始甘油濃度20 g/L，轉速200～250 r/min，通氣量0.5 L/min。從 8 h起流加甘油使其保持在 20 g/L左右，直至 22 h，用10 mol/L的KOH控制pH保持在7.5。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 budC和budA基因的敲除

提取K. pneumoniaeZG25全基因組，根據(jù)Klebsiella pneumoniae342 (GenBank Accession No. NC011283) 分別設計budC和budA基因引物CJ1、CJ2和AJ1、AJ2，擴增budC和budA基因并連接 pMD18-T測序。根據(jù)測序結果設計引物C1、C2和 A1、A2 (表1)，其中下劃線部分為目標基因上下游約50 bp的同源臂序列，以pKD13的 DNA為模板，分別擴增目標基因打靶 DNA片段geneD50-Kan-geneD50。將pKD46質粒電轉入K. pneumoniaeZG25，接種至含有 Amp(1.4 mg/mL)的 LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至8～10 h，然后轉移至含有Amp (2.0 mg/mL) 的LB固體平板上12～15 h，篩選出含有pKD46質粒的菌體。將目標基因打靶 DNA片段電轉導入K. pneumoniaeZG25 (pKD46)，在加入 Kan的 LB固體平板上篩選轉化子，升溫至42 ℃培養(yǎng)12 h以去除pKD46質粒，將pCP20質粒電轉導入菌體細胞，30 ℃培養(yǎng)2 h，利用pCP20消除轉化子中Kan抗性基因，然后升溫至42 ℃培養(yǎng)12～16 h去除pCP20質粒[18-19]。

1.5 轉化子的驗證

將打靶DNA片段電轉后在Kan抗性平板上長出的轉化子用鑒定引物K1、K2；AJ1、AJ2；CJ1、CJ2；KZ1、KZ1’和 KZ2、KZ2’進行 PCR驗證。K1和 K2分別是 Kan抗性基因的上游引物和下游引物，CJ1、CJ2和AJ1、AJ2分別是基因bud C和bud A基因上游和下游片段。KZ1、KZ1’和 KZ2、KZ2’分別是 Kan抗性基因中間某段基因序列及其反向互補序列。

1.6 測定方法

1.6.1 生物量及代謝產(chǎn)物測定

發(fā)酵液中的菌體密度以分光光度計吸光值OD650表示。細胞干重根據(jù)經(jīng)驗公式 1OD=0.25 g/L。發(fā)酵液中甘油、1,3-丙二醇、2,3-丁二醇、乙酸、乙醇、乳酸、琥珀酸的測定參考文獻[10]。

1.6.2 酶活測定

α-乙酰乳酸脫羧酶的測定參考文獻[15]，酶活單位定義為37 ℃下每分鐘由α-乙酰乳酸脫羧酶脫羧 α-乙酰乳酸產(chǎn)生 1 μmol 3-羥基-2-丁酮的酶量。

2,3-丁二醇脫氫酶的測定參考文獻[20]，酶活力定義為37 ℃下每分鐘轉化1 μmol NADH成為NAD+的酶量。

1.6.3 蛋白質含量測定

粗酶液蛋白質含量采用Bradford法[21]測定，以BSA為標準蛋白。

2 結果

2.1 budC和budA單基因缺失菌株的獲得

以質粒pKD13 NDA為模板，擴增出目標基因打靶 DNA 片段budCD50-Kan-budCD50和budAD50-Kan-budAD50，轉化至含 pKD46質粒的K. pneumoniaeZG25感受態(tài)中，同源重組后在Kan平板上初步篩選budC和budA基因缺失突變株。

將含有Kan抗性基因的budC缺失菌株進行菌落 PCR驗證，結果如圖 2所示。分別利用 4對引物 K1、K2；CJ1、CJ2；CJ1、KZ2’和 KZ2、CJ2對budC缺失菌進行菌落 PCR鑒定，budC基因缺失菌株可以得到 1 303 bp、1 394 bp、627 bp和790 bp大小片段，出發(fā)菌株僅CJ1、CJ2引物可擴增得到862 bp片段。含Kan抗性基因的budA缺失菌株的菌落PCR驗證如圖3所示。分別利用 4對引物 K1、K2；AJ1、AJ2；AJ1、KZ1’和AJ2、KZ1進行菌落PCR鑒定，budA基因缺失菌株可以得到1 303 bp、1 600 bp、752 bp和742 bp大小片段，出發(fā)菌株僅AJ1、AJ2可得到1 077 bp片段。DNA凝膠電泳的結果均與理論值相符，表明budC和budA基因敲除成功，將質粒pCP20轉化至budC和budA基因缺失菌中，將Kan抗性基因消除，獲得的budC基因缺失菌命名為K. pneumoniaeZG38 (budC)，獲得的budA基因缺失菌命名為K. pneumoniaeZG38(budA)。

圖2 budC基因缺失菌的菌落PCR鑒定Fig. 2 Identification of the budC knockout by colony PCR. M: DL2 000 DNA marker; 1, 3, 5, 7: mutant(budC) containing Kan resistance gene; 2, 4, 6, 8:parent strain.

圖3 budA基因缺失菌的菌落PCR鑒定Fig. 3 Identification of the budA knockout by colony PCR. M: DL2 000 DNA marker; 1, 3, 5, 7: mutant(budA) containing Kan resistance gene; 2, 4, 6, 8:parent strain.

兩株基因突變株的2,3-丁二醇脫氫酶酶活如圖4A所示，出發(fā)菌株在整個發(fā)酵階段都有酶活性。K. pneumoniaeZG38 (budC)沒有檢測出2,3-丁二醇脫氫酶酶活，說明K. pneumoniaeZG38(budC)的budC基因已經(jīng)被成功敲除，同時發(fā)現(xiàn)發(fā)酵過程中 3-羥基-2-丁酮大量積累 (數(shù)據(jù)未列出)，在發(fā)酵5～15 h時發(fā)酵液中3-羥基-2-丁酮濃度約為出發(fā)菌株的120%，進一步說明因為budC基因的缺失，造成了3-羥基-2-丁酮在發(fā)酵液中大量積累。K. pneumoniaeZG3 (budA) 沒有檢測出 2,3-丁二醇脫氫酶活性，為budA基因的缺失提供了佐證。

兩株基因突變株的 α-乙酰乳酸脫羧酶酶活如圖4B所示，出發(fā)菌株在整個過程中都保持α-乙酰乳酸脫羧酶的活性。K. pneumoniaeZG38(budC) 的budC基因缺失造成3-羥基-2-丁酮積累的同時，α-乙酰乳酸脫羧酶的活性相比出發(fā)菌株提高了約20% (6～24 h)，K. pneumoniaeZG38(budA) 沒有檢測出α-乙酰乳酸脫羧酶活性，說明K. pneumoniaeZG38 (budA) 的budA基因已經(jīng)被敲除。

圖 4 K. pneumoniae ZG25、K. pneumoniae ZG38(budC)、K. pneumoniae ZG38 (budA) 2,3-丁二醇脫氫酶 (A) 與 α-乙酰乳酸脫羧酶 (B) 比酶活曲線的測定Fig. 4 Time course of specific activity of BDH (A) and α-ALDC (B) in K. pneumoniae ZG25, K. pneumoniae ZG38 (budC ) and K. pneumoniae ZG38 (budA).

2.2 突變株的分批發(fā)酵性能

為了初步考察基因敲除對菌體生長和代謝產(chǎn)物的影響，本研究對出發(fā)菌株K. pneumoniaeZG25及構建的基因缺失菌K. pneumoniaeZG38(budC) 和K. pneumoniaeZG38 (budA)進行了搖瓶發(fā)酵實驗，結果表明，K. pneumoniaeZG38(budC) 和K. pneumoniaeZG38 (budA)的平均比生長速率 (2.07/h，0.583/h)和生長量 (圖 5) 均低于出發(fā)菌株 (2.22/h)，說明budC和budA基因的缺失抑制了菌體的生長，相比之下，budA基因的缺失對菌體的影響更加嚴重，在整個發(fā)酵過程中，K. pneumoniaeZG38 (budA) 的菌體量只有出發(fā)菌株的25%～35%。K. pneumoniaeZG38(budA) 的發(fā)酵結果顯示，菌體不產(chǎn)生 1,3-丙二醇和2,3-丁二醇，而其他副產(chǎn)物的產(chǎn)量明顯增加，乳酸、琥珀酸、乙醇和乙酸的產(chǎn)量分別為出發(fā)菌株的6.6、2.7、2.1和1.8倍。

甘油測定結果表明 (圖 6)，K. pneumoniaeZG38 (budC) 利用甘油的能力稍弱于出發(fā)菌株，出發(fā)菌株 12 h時已經(jīng)消耗大部分甘油，而K. pneumoniaeZG38 (budC) 到24 h才消耗大部分甘油，至發(fā)酵結束時殘留甘油含量與出發(fā)菌株殘留甘油含量都保持在相同的水平 (0.5～1 g/L)，而K. pneumoniaeZG38 (budA) 菌株利用甘油的能力降低，直至發(fā)酵結束時，發(fā)酵液中仍然殘留約30 g/L的甘油。

圖 5 K. pneumoniae ZG25、K. pneumoniae ZG38(budC) 和 K. pneumoniae ZG38 (budA) 的生長曲線Fig. 5 Time course of cell growth of K. pneumoniae ZG25, K. pneumoniae ZG38 (budC) and K. pneumoniae ZG38 (budA).

圖 6 K. pneumoniae ZG25 (A)、K. pneumoniae ZG38(budC) (B )和 K. pneumoniae ZG38 (budA) (C) 的搖瓶發(fā)酵Fig. 6 Shake-flask fermentations of K. pneumoniae ZG25 (A), K. pneumoniae ZG38 (budC) (B) and K.pneumoniae ZG38 (budA) (C). 1,3-PDO:1,3-propanediol; 2,3-BD: 2,3-butanediol.

發(fā)酵液代謝產(chǎn)物的分析結果如圖 6所示，K. pneumoniaeZG38 (budC) 的 1,3-丙二醇和2,3-丁二醇產(chǎn)量分別達到21.7 g/L和3.4 g/L，為出發(fā)菌株的111%和65.3%。與出發(fā)菌株相比，2,3-丁二醇產(chǎn)量明顯下降，此外，K. pneumoniaeZG38 (budC) 單位菌體的 1,3-丙二醇產(chǎn)率、摩爾轉化率達到 0.603 g/(L·h)和 0.682 mol/mol，分別為出發(fā)菌株的109%和112%。由此可知，budC基因敲除造成的 2,3-丁二醇脫氫酶缺失降低了2,3-丁二醇產(chǎn)量，并提高了1,3-丙二醇產(chǎn)量。

2.3 突變株的分批補料發(fā)酵

在搖瓶發(fā)酵實驗的基礎上進一步考察K. pneumoniaeZG38 (budC) 發(fā)酵生產(chǎn) 1,3-丙二醇的能力，在 5 L發(fā)酵罐中對出發(fā)菌株及K.pneumoniaeZG38 (budC) 進行了分批補料發(fā)酵實驗，發(fā)酵結果如表2所示。

表2 K. pneumoniae ZG25和K. pneumoniae ZG38 (budC) 的分批補料發(fā)酵結果Table 2 Fermentation results of fed-batch fermentation of K. pneumoniae ZG25 and K. pneumoniae ZG38(budC)

由表 2可以看出，K. pneumoniaeZG38(budC) 的 1,3-丙二醇濃度為 66.9 g/L，相比于出發(fā)菌株提高了10%，1,3-丙二醇產(chǎn)率、對甘油的摩爾轉化率也明顯增加。正如所預測的，2,3-丁二醇脫氫酶失活導致了2,3-丁二醇和乙醇產(chǎn)量的降低，分別降低了30.0%和75.9%。然而budC基因缺失菌卻產(chǎn)生了更多的乙酸、琥珀酸，表明budC基因的缺失可以導致流向 2,3-丁二醇途徑的碳流轉向乙酸和琥珀酸途徑。

3 討論

菌體代謝旁路途徑基因敲除往往會在一定程度上影響菌體的生長，這在許多關于克雷伯氏菌基因敲除研究中已經(jīng)得到證實[10-11]。本研究中對budC基因和budA基因的敲除也得到了相同的結果。就發(fā)酵目的產(chǎn)物來說，budC基因缺失菌株2,3-丁二醇的產(chǎn)量只是比出發(fā)菌株降低了 30%，并沒有完全按照預測消除2,3-丁二醇的產(chǎn)生，表明克雷伯氏菌可能存在另一條2,3-丁二醇途徑，即2,3-丁二醇循環(huán)，這條途徑已經(jīng)在枯草芽胞桿菌、蠟狀芽胞桿菌和尿素微球菌[22-23]中被發(fā)現(xiàn)，并且2,3-丁二醇循環(huán)的生理機制還沒有闡明，至今尚無關于K. pneumoniae2,3-丁二醇回補途徑的研究。

本研究利用基因敲除技術對K. pneumoniae2,3-丁二醇回補途徑進行了探索，如圖 7所示，當2,3-丁二醇途徑因budC基因缺失而被阻斷時，通向 2,3-丁二醇途徑的碳流通過節(jié)點 3-羥基-2-丁酮轉向 2,3-丁二醇的回補途徑生成 2,3-丁二醇，在這個過程中，乙酸作為回補途徑的中間代謝產(chǎn)物被大量形成，理論上1 mol 2,3-丁二醇形成的同時也會形成2 mol乙酸，在分批補料發(fā)酵過程中，乙酸的產(chǎn)量約是2,3-丁二醇產(chǎn)量的1.88倍 (表2)，與理論預測值基本吻合，從而有力的證實了克雷伯氏菌中可能存在2,3-丁二醇回補途徑，并且當主要合成途徑被阻斷后會通過此回補途徑合成2,3-丁二醇。

budA基因的缺失對菌體的生長和生理產(chǎn)生了明顯影響，2,3-丁二醇代謝途徑在微生物胞內(nèi)有著重要的生理功能，它維持著細胞內(nèi)NAD+/NADH平衡，3-羥基-2-丁酮和2,3-丁二醇的轉化是一個可逆的生化反應，故2,3-丁二醇代謝途徑是細胞的一個還原力庫，它的存在可以自動調(diào)節(jié)胞內(nèi)的氧化還原平衡，而budA基因的缺失則使其喪失了這一功能，使變異菌株在生長上受到抑制，代謝紊亂，甘油的還原途徑被抑制，氧化途徑中產(chǎn)生的 NADH消耗在糖酵解到三羧酸循環(huán)途徑的產(chǎn)物形成過程中，從而導致發(fā)酵過程中乳酸、琥珀酸、乙醇和乙酸的產(chǎn)量成倍增加。這與Zhang等[24]報道的產(chǎn)酸克雷伯氏菌budA基因缺失菌株發(fā)酵結果相似，Zhang等將budA基因敲除后雖然菌體生長受到抑制，但卻提高了1,3-丙二醇的產(chǎn)量，說明 2,3-丁二醇合成途徑對1,3-丙二醇產(chǎn)量的影響在不同克雷伯氏菌中的表現(xiàn)是不同的。

圖7 2,3-丁二醇代謝途徑和2,3-丁二醇循環(huán)[22]Fig. 7 Metabolic pathway of 2,3-BD and the 2,3-BD cycle[22].

根據(jù)枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis、蠟狀芽胞桿菌Bacillus cereus和尿素微球菌Micrococcus urea公布的2,3-丁二醇循環(huán)途徑[22]推測，若budA基因被敲除則使得α-乙酰乳酸脫羧酶缺失，從而使3-羥基-2-丁酮完全無法合成，導致2,3-丁二醇兩條代謝途徑都被阻斷，最終無2,3-丁二醇產(chǎn)生，這與本研究結果完全一致?；诒狙芯縝udC和budA基因敲除和代謝產(chǎn)物分析的結果，可以推斷克雷伯氏菌中可能存在2,3-丁二醇回補途徑，且2,3-丁二醇循環(huán)是以3-羥基-2-丁酮為起點。有關2,3-丁二醇循環(huán)的研究結果為以后更加深入的研究提供了基礎。在以后的研究中，應該重點研究克雷伯氏菌的2,3-丁二醇循環(huán)途徑，找出該途徑的關鍵酶基因并嘗試敲除關鍵酶基因，以進一步降低2,3-丁二醇和增加1,3-丙二醇的產(chǎn)量。

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