CRABPII和E-FABP在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其意義

劉倩 王世鳳 徐緩 張尚福

肺癌對人類健康的威脅日益嚴(yán)重，目前肺癌患者的5年生存率僅為15.6%[1]，深入研究肺癌的分子生物學(xué)特征對肺癌的早期診斷、治療及改善預(yù)后具有重要意義。最新研究[2]顯示，細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白（cellular retinoic acid-binding protein II, CRABPII）和表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白（epidermal fatty acid-binding protein, E-FABP）作為維甲酸（retinoic acid, RA）的轉(zhuǎn)運蛋白，將RA從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核，分別與兩種不同的核受體－－維甲酸受體（retinoic acid receptor, RAR）和過氧化物酶體增殖物激活受體β/δ（peroxisome proliferator-activated receptor β/δ, PPARβ/δ）相互作用，在RA信號通路上發(fā)揮不同的作用，從正反兩方面影響細(xì)胞的增殖和凋亡。本實驗利用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學(xué)染色檢測CRABPII和E-FABP在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）原發(fā)癌組織及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)情況，探討兩者在NSCLC中表達(dá)的意義及其與NSCLC發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 收集四川大學(xué)華西醫(yī)院1998年1月-2003年12月手術(shù)切除、臨床資料完整和尚有石蠟標(biāo)本的原發(fā)性NSCLC 287例，其中伴有轉(zhuǎn)移143例，實際收集到其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶103例。另取54例正常肺組織作為對照。287例NSCLC標(biāo)本均經(jīng)切片、HE染色，明確病理診斷（2003年WHO肺腫瘤組織學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)）。其中，男性230例，女性57例，男:女為4.04:1。發(fā)病年齡35歲-82歲，中位年齡61歲。鱗狀細(xì)胞癌133例，腺癌126例，腺鱗癌28例；高分化癌13例，中分化癌144例，低分化癌102例，未包括腺鱗癌。根據(jù)TNM分期，I期93例，II期61例，III期108例，IV期25例（2009年肺癌國際分期修訂版）?；颊呓刂剐g(shù)前均未行放療或化療。隨訪時間0.06個月-97+個月，平均隨訪時間37個月，中位隨訪時間35個月。生存期的計算從手術(shù)日期起到隨訪日期或由于復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移而死亡的日期為止。

1.2 方法

1.2.1 組織芯片的制作 選擇所需病例存檔蠟塊，根據(jù)HE染色切片進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，確定具有代表性的病變部位（避開出血、壞死、明顯炎細(xì)胞浸潤及纖維化區(qū)域）后在組織切片和相應(yīng)石蠟組織塊上標(biāo)志。將市售石蠟溶化后，注入模具內(nèi)，制取大小為40 mm×30 mm×10 mm的載體蠟塊。在載體石蠟上用組織芯片制備儀的打孔針打出間距為1.5 mm，直徑為1.0 mm-1.2 mm，深度為4 mm的孔，設(shè)計成9×7陣列。用采樣針從已標(biāo)志好的組織中獲取直徑為1.0 mm-1.2 mm的組織塊并將其壓入已打好孔的載體石蠟中。NSCLC原發(fā)癌、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌與正常肺組織隨機排列，左上角留一空白孔作為定位標(biāo)識。每例腫瘤組織取3個-5個點，每例正常肺組織取3個點。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色試劑及方法羊抗人CRABPII多克隆抗體和大鼠抗人E-FABP單克隆抗體分別購自美國Stata Cruze和R&D公司。免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。CRABPII和E-FABP一抗的工作稀釋濃度分別為1:400和1:200。本實驗采用SP法作免疫組織化學(xué)染色，具體步驟嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。分別用正常乳腺組織和銀屑病皮膚組織作為CRABPII和E-FABP的陽性對照，以0.01 mol/L PBS（pH7.4）代替一抗作為陰性對照。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定 CRABPII和E-FABP均以細(xì)胞質(zhì)或/和細(xì)胞核呈黃色顆粒為陽性。高倍鏡下隨機選取10個視野共記錄1,000個陽性細(xì)胞，綜合染色強度和陽性細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行判定。①按切片中細(xì)胞著色深淺評分：0分為細(xì)胞無顯色；1分為黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。②按陽性細(xì)胞率評分：0分為＜5%；1分為5%-＜25%；2分為25%-＜50%；3分為50%-＜75%；4分為≥75%。?、?、②兩項評分的乘積作為總積分：0分為陰性（-）；1分-4分為弱陽性（+）；5分-8分為中等強度陽性（++）；≥9分為強陽性（+++）。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.00軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。分類資料采用χ2檢驗；采用Spearman等級相關(guān)分析進(jìn)行相關(guān)性分析；應(yīng)用Kaplan-Meier法進(jìn)行單因素生存分析，差異顯著性檢驗采用對數(shù)秩檢驗（Log-rank test）；Cox比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行多因素生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRABPII和E-FABP在正常肺組織、NSCLC原發(fā)癌組織及其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá) 在正常肺組織中，CRABPII均呈陰性表達(dá)（圖1）；E-FABP的陽性表達(dá)見于II型肺泡上皮細(xì)胞和部分支氣管腺體（圖2）。CRABPII和E-FABP在NSCLC原發(fā)癌組織中表達(dá)程度各異（圖1、圖2）。

CRABPII在NSCLC原發(fā)癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的陽性表達(dá)率分別為39.0%和33.0%，其差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.171, P=0.279＞0.05）。E-FABP在正常肺組織、NSCLC原發(fā)癌組織和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的陽性表達(dá)率分別為24.1%、58.2%和19.4%，E-FABP在NSCLC原發(fā)癌組織中的陽性表達(dá)率分別高于正常肺組織（χ2=21.223,P＜0.001）和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織（χ2=45.651, P＜0.001）（表1）。

2.2 CRABPII和E-FABP在NSCLC原發(fā)癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系 在NSCLC原發(fā)癌組織中，CRABPII的表達(dá)與患者的性別、腫瘤的有無轉(zhuǎn)移以及TNM分期有關(guān)（P＜0.05）。CRABPII在女性患者中的陽性表達(dá)率高于男性患者；在伴有癌轉(zhuǎn)移的NSCLC中的陽性表達(dá)率低于不伴有轉(zhuǎn)移的NSCLC；TNM分期越晚，CRABPII的陽性表達(dá)率越低。E-FABP的表達(dá)與腫瘤的病理分級和有無轉(zhuǎn)移有關(guān)（P＜0.05）。E-FABP在不同病理分級NSCLC中的陽性表達(dá)率不全相同（χ2=15.014,P=0.001＜0.05)；進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，E-FABP在中分化癌中的陽性表達(dá)率高于高、低分化癌（χ2=14.565,P＜0.001）；在高分化癌與低分化癌之間的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.441, P=0.507＞0.05）。E-FABP在伴有癌轉(zhuǎn)移的NSCLC中的陽性表達(dá)率高于不伴有癌轉(zhuǎn)移的NSCLC（表2）。

2.3 CRABPII和E-FABP在NSCLC原發(fā)癌組織中表達(dá)的關(guān)系

2.3.1 CRABPII和E-FABP在NSCLC原發(fā)癌組織中的表達(dá)比較 在NSCLC原發(fā)癌中，CRABPII和E-FABP的表達(dá)在（-）、（+）、（++）、（+++）中的分布不同，E-FABP的陽性表達(dá)較CRABPII占優(yōu)勢，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=40.090, P＜0.001）（表3）。

圖1 CRABPII在正常支氣管粘膜上皮（A）、肺泡上皮（B）及鱗狀細(xì)胞癌（C）、腺癌（D）中的表達(dá)（A,B: SP, ×400; C,D: SP, ×200）Fig1 Expressions of CRABPII in normal bronchial epithelium (A), alveolar epithelium (B), squamous cell carcinoma (C) and adenocarcinoma (D) (A,B:SP, ×400; C,D: SP, ×200)

圖2 E-FABP在正常支氣管粘膜上皮（A）、肺泡上皮（B）及鱗狀細(xì)胞癌（C）、腺癌（D）中的表達(dá)（A,B: SP, ×400; C,D: SP, ×200）Fig2 Expression of E-FABP in normal bronchial epithelium (A), alveolar epithelium (B), squamous cell carcinoma (C) and adenocarcinoma (D) (A,B:SP, ×400; C,D: SP, ×200)

表 1 CRABPII和E-FABP在正常肺組織、非小細(xì)胞肺癌原發(fā)癌組織及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)Tab 1 Expression of CRABPII and E-FABP in normal lung tissues, non-small cell lung cancer (NSCLC) primary lesions and metastasis lymph node

表 2 CRABPII和E-FABP在NSCLC原發(fā)癌中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab 2 Relationship between expression of CRABPII and E-FABP and clinicopathological characteristics of NSCLC

表 3 CRABPII和E-FABP在NSCLC原發(fā)癌組織中的表達(dá)關(guān)系Tab 3 Relationship between expression of CRABPII and E-FABP in primary NSCLC lesions

2.3.2 CRABPII和E-FABP在NSCLC原發(fā)癌組織中的差異性表達(dá)與各臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 在NSCLC原發(fā)癌組織中，219例E-FABP的表達(dá)強于或相當(dāng)于CRABPII（E-FABP≥CRABPII），即E-FABP和CRABPII的表達(dá)強度呈-/-、+/-、+/+、++/-、++/+、++/++、+++/-、+++/+、+++/++、+++/+++；68例E-FABP的表達(dá)弱于CRABPII（E-FABP＜CRABPII），即E-FABP和CRABPII的表達(dá)強度呈-/+、+/++、-/++、++/+++、+/+++、-/+++。CRABPII和E-FABP在NSCLC原發(fā)癌組織中的差異性表達(dá)與腫瘤的大小、有無轉(zhuǎn)移、TNM分期和病理分級有關(guān)（P＜0.05）。NSCLC腫瘤愈大、伴有轉(zhuǎn)移、TNM分期愈晚，E-FABP的表達(dá)愈占優(yōu)勢。E-FABP表達(dá)強于或相當(dāng)于CRABPII的在不同病理分級NSCLC中的構(gòu)成比不全相同（χ2=6.655，P=0.036＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，高分化癌中E-FABP的表達(dá)強于或相當(dāng)于CRABPII的構(gòu)成比低于中、低分化癌（χ2=4.251, P=0.039＜0.05），中分化癌和低分化癌中其構(gòu)成比的差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.501,P=0.114＞0.05）（表4）。

2.4 CRABPII與E-FABP在NSCLC原發(fā)癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 Spearman非參數(shù)等級相關(guān)分析顯示，CRABPII和E-FABP在NSCLC原發(fā)癌組織中的表達(dá)無相關(guān)性（r=-0.051, P=0.386＞0.05）。

2.5 CRABPII與E-FABP的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

2.5.1 Kaplan-Meier單因素生存分析 將CRABPII和E-FABP的表達(dá)分為陰性和陽性兩組；CRABPII與E-FABP的表達(dá)差異分為E-FABP的表達(dá)強于或相當(dāng)于CRABPII組（E-FABP≥CRABPII）和E-FABP的表達(dá)弱于CRABPII組（E-FABP＜CRABPII）。采用Kaplan-Meier法繪制NSCLC患者生存曲線，Log-rank檢驗不同樣本的生存曲線，結(jié)果顯示：CRABPII陽性表達(dá)組NSCLC患者的生存率高于陰性表達(dá)組（χ2=6.443, P=0.011＜0.05）（圖3）；E-FABP不同表達(dá)水平NSCLC患者的生存率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=1.664, P=0.197＞0.05）（圖4）；E-FABP表達(dá)強于或相當(dāng)于CRABPII組的生存率低于E-FABP表達(dá)弱于CRABPII組的患者（χ2=8.632, P=0.003＜0.05）（圖5）。

2.5.2 Cox比例風(fēng)險回歸模型分析 通過Cox比例風(fēng)險回歸模型進(jìn)行多因素預(yù)后分析，包括NSCLC患者的年齡、性別、腫瘤的大小、組織學(xué)類型、病理分級、TNM分期、有無癌轉(zhuǎn)移、CRABPII和E-FABP的表達(dá)以及CRABPII與E-FABP的差異性表達(dá)。采用前向逐步法，在α=0.05的水平上，腫瘤的大?。≒=0.024）、有無癌轉(zhuǎn)移（P=0.040）和TNM分期（P=0.001）這3個因素被篩入Cox模型內(nèi)（表5），是影響NSCLC患者預(yù)后的獨立危險因素。NSCLC的腫瘤直徑＞3 cm的患者其死亡風(fēng)險是直徑≤3 cm患者的1.448倍；伴有癌轉(zhuǎn)移的患者其死亡風(fēng)險較不伴有癌轉(zhuǎn)移患者增加了64%；隨著TNM分期的遞增，患者的死亡風(fēng)險依次增加53.4%。

表 4 CRABPII和E-FABP在NSCLC原發(fā)癌中的差異性表達(dá)與各臨床病理特征的關(guān)系Tab 4 Relationship between difference expression of CRABPII and E-FABP and clinicopathological characteristics of NSCLC

3 討論

圖3 CRABPII陰性表達(dá)組和陽性表達(dá)組NSCLC患者的生存曲線Fig3 The survival curves of NSCLC patients with negative and positive expression of CRABPII

圖4 E-FABP陰性表達(dá)組和陽性表達(dá)組NSCLC患者的生存曲線Fig4 The survival curves of NSCLC patients with negative and positive expression of E-FABP

圖5 CRABPII與E-FABP差異性表達(dá)的NSCLC患者生存曲線Fig5 The survival curves of NSCLC patients with difference expression between CRABPII and E-FABP

表 5 Cox回歸模型篩選的影響NSCLC患者的危險因素Tab 5 The risk factors of NSCLC patients selected by Cox regression model

細(xì)胞視黃酸結(jié)合蛋白（cellular retinoic acid-binding proteins, CRABPs）是調(diào)節(jié)RA和RAR之間相互作用的重要物質(zhì)，包括CRABPI和CRABPII。CRABPI通過影響與RA代謝有關(guān)的酶從而調(diào)節(jié)RA的代謝，CRABPII與RA的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)[3]。CRABPII作為RA的轉(zhuǎn)運蛋白，其主要作用是結(jié)合RA，并將RA轉(zhuǎn)運至細(xì)胞核，與RAR相互作用，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)揮RA調(diào)節(jié)細(xì)胞分化[4]、調(diào)控細(xì)胞周期[5]、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[6]，進(jìn)而抑制細(xì)胞生長的作用。CRABPII基因在腫瘤中和正常組織中的表達(dá)存在差異，其在精囊腺中的高表達(dá)被認(rèn)為可能是精囊腺不易發(fā)生腫瘤的原因[7]。在乳腺癌小鼠動物模型中，CRABPII能抑制腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移[8]。本研究發(fā)現(xiàn)在NSCLC原發(fā)癌中，CRABPII的表達(dá)與患者的性別、腫瘤有無轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)。CRABPII在女性患者中的陽性表達(dá)率高于男性患者，這可能與雌激素有關(guān)，雌激素能誘導(dǎo)并調(diào)節(jié)CRABPII的表達(dá)[9]。CRABPII的表達(dá)還與腫瘤細(xì)胞的侵襲能力有關(guān)，CRABPII在伴有轉(zhuǎn)移的NSCLC中的陽性表達(dá)率低于無轉(zhuǎn)移的NSCLC；而且CRABPII的表達(dá)隨TNM分期的上升而下降的趨勢，并且與NSCLC患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。本實驗結(jié)果提示，在NSCLC中，CRABPII可能具有抑制腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和腫瘤演進(jìn)的作用，尚有待進(jìn)一步深入研究證實。

E-FABP與脂肪酸的攝取、轉(zhuǎn)運和代謝有關(guān)，并且作為信號分子參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化和基因的表達(dá)[10]。近年來多項研究發(fā)現(xiàn)，很多在腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞中差異性表達(dá)的基因，其表達(dá)的增加或缺失與腫瘤的發(fā)生和演進(jìn)有關(guān)，而E-FABP就是這樣一種基因[11,12]。在肺鱗狀細(xì)胞癌[13]、肝細(xì)胞癌[14]、前列腺癌[15]中，E-FABP均較相應(yīng)正常組織高表達(dá)。另外，E-FABP基因是一個腫瘤轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)基因，能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移[16]。E-FABP不僅與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，而且還參與腫瘤的演進(jìn)。本實驗結(jié)果顯示，在正常肺組織中，E-FABP的陽性表達(dá)見于II型肺泡上皮細(xì)胞和部分支氣管腺體。E-FABP與表面活性物質(zhì)的合成有關(guān)，具有維持表面活性物質(zhì)平衡的作用[17]。在NSCLC原發(fā)癌組織中，E-FABP的表達(dá)與腫瘤的有無轉(zhuǎn)移和病理分級有關(guān)。E-FABP在NSCLC組織中的陽性表達(dá)率高于正常肺組織，提示E-FABP可能參與了NSCLC的發(fā)生。E-FABP在有轉(zhuǎn)移的NSCLC中陽性表達(dá)率高于無轉(zhuǎn)移的NSCLC，其在NSCLC原發(fā)癌組織中的陽性表達(dá)率高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織。Uma等[18]在舌鱗狀細(xì)胞癌中也發(fā)現(xiàn)，E-FABP mRNA在原發(fā)癌組織中的表達(dá)是其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的4倍，提示在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中腫瘤細(xì)胞在一定程度上丟失了表達(dá)E-FABP的能力。E-FABP能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，但是在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌組織中的表達(dá)卻有所下降，E-FABP在轉(zhuǎn)移過程中的具體調(diào)節(jié)機制有待更深入的研究。以上結(jié)果提示：E-FABP不僅參與了NSCLC的發(fā)生，還可能與NSCLC腫瘤細(xì)胞的侵襲能力有關(guān)，即能促進(jìn)NSCLC腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。

CRABPII和E-FABP作為RA的轉(zhuǎn)運蛋白，調(diào)節(jié)RA與兩種不同的核受體-RAR和PPARβ/δ相互作用。CRABPII將RA轉(zhuǎn)運至RAR，抑制細(xì)胞生長；而E-FABP將RA轉(zhuǎn)運至PPARβ/δ，促進(jìn)細(xì)胞增殖。在不同的細(xì)胞中兩種結(jié)合蛋白表達(dá)水平的不同，也會引起受RA調(diào)節(jié)的相關(guān)基因表達(dá)的不同，進(jìn)而引起對RA不同的效應(yīng)[2]。CRABPII/E-FABP呈高比例時，主要通過RAR通路，發(fā)揮促凋亡作用；相反，當(dāng)CRABPII/E-FABP呈低比例時，則主要通過PPARβ/δ通路，發(fā)揮促增殖的作用。兩種受體，RAR和PPARβ/δ可以存在于同一種細(xì)胞或者同一細(xì)胞中，細(xì)胞中CRABPII和E-FABP的比例關(guān)系決定RA激活何種核受體，影響細(xì)胞的增殖和凋亡。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，在NSCLC原發(fā)癌組織中，CRABPII和E-FABP的表達(dá)在（-）、（+）、（++）、（+++）中的分布不同，E-FABP在NSCLC原發(fā)癌組織中的陽性表達(dá)較CRABPII占優(yōu)勢。CRABPII和E-FABP的差異性表達(dá)與腫瘤的大小、病理分級、有無癌轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)，并影響NSCLC患者的預(yù)后，提示在NSCLC中，E-FABP的表達(dá)愈占優(yōu)勢，瘤體愈大，腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的幾率愈大，臨床分期愈晚，患者的預(yù)后愈差。

雖然RA的抑制細(xì)胞生長的作用已經(jīng)明確，但其在腫瘤治療上卻往往因為明顯的藥物細(xì)胞毒性和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中形成的RA抵抗而受限[19]。E-FABP/PPARβ/δ通路的發(fā)現(xiàn)也為RA應(yīng)用于腫瘤治療提供了新的啟示。在CRABPII存在的情況下，生理濃度的RA足以發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用，外源性的RA并不會增強此作用；而缺乏CRABPII，即使RA的濃度很高，RAR也不會被活化[20]。那么，在生理濃度RA的作用下，細(xì)胞中CRABPII/E-FABP的比例就成了影響細(xì)胞增殖的焦點。據(jù)文獻(xiàn)報道，13-順式-維甲酸、全反式維甲酸能逆轉(zhuǎn)或者阻止癌前病變支氣管粘膜鱗狀上皮化生的進(jìn)展，維甲酸類化合物作為肺癌化學(xué)預(yù)防藥物的潛在價值已備受關(guān)注[21]；而體內(nèi)外實驗均提示E-FABP的下調(diào)能抑制細(xì)胞的致瘤和轉(zhuǎn)移能力[15,22]。綜上，CRABPII、E-FABP以及CRABPII/E-FABP的比例關(guān)系有望成為肺癌個性化靶向治療研究的新方向。