生物催化3-(4-氯苯基)-戊二腈去對稱性水解合成光學(xué)純巴氯芬的關(guān)鍵前體

徐美珍，任杰，龔勁松，董文玥，吳洽慶，許正宏，朱敦明

1 江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院制藥工程研究室，江蘇 無錫 214122

2 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國家工程實驗室，天津 300308

生物催化3-(4-氯苯基)-戊二腈去對稱性水解合成光學(xué)純巴氯芬的關(guān)鍵前體

徐美珍1，任杰2，龔勁松1，董文玥2，吳洽慶2，許正宏1，朱敦明2

1 江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院制藥工程研究室，江蘇 無錫 214122

2 中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所 工業(yè)酶國家工程實驗室，天津 300308

徐美珍, 任杰, 龔勁松, 等. 生物催化 3-(4-氯苯基)-戊二腈去對稱性水解合成光學(xué)純巴氯芬的關(guān)鍵前體. 生物工程學(xué)報, 2013, 29(1): 31?40.

Xu MZ, Ren J, Gong JS, et al. Biocatalytic desymmetric hydrolysis of 3-(4-chlorophenyl)-glutaronitrile to the key precursor of optically pure baclofen. Chin J Biotech, 2013, 29(1): 31?40.

研究了利用生物催化劑制備 (S)-4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸。以3-(4-氯苯基)-戊二腈為底物，采用苯酚-次氯酸鈉法對實驗室保藏的菌株進(jìn)行篩選，得到一株產(chǎn)物立體選擇性較高的菌株赤霉菌Gibberella intermediaWX12，并對其催化特性和發(fā)酵條件進(jìn)行了初步研究。以30 g/L的乳糖和20 g/L的蛋白胨分別為碳、氮源，發(fā)酵培養(yǎng)96 h，收集的菌體在50 mmol/L磷酸緩沖液 (pH 8.0) 中30 ℃催化反應(yīng)24 h，將3-(4-氯苯基)-戊二腈轉(zhuǎn)化為4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸，產(chǎn)率為90%。將產(chǎn)物化學(xué)轉(zhuǎn)化為巴氯芬，手性HPLC分析表明水解產(chǎn)物構(gòu)型是 (S)，其對映異構(gòu)體過量值ee＞99%。該產(chǎn)物可以用來合成光學(xué)純的 (R)-和(S)-巴氯芬。

腈水解酶，3-(4-氯苯基)-戊二腈，4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸，巴氯芬

腈類化合物 (R-CN) 是有機(jī)合成中的重要中間體[1]，它的水解反應(yīng)被廣泛應(yīng)用于氨基酸、酰胺、羧酸及其衍生物的合成[2-3]，在有機(jī)合成中占有極其重要的地位，腈水解的方法主要有化學(xué)水解法和生物轉(zhuǎn)化法[4-6]。腈的傳統(tǒng)化學(xué)水解需要強(qiáng)酸或強(qiáng)堿、高溫、高壓等反應(yīng)條件，生產(chǎn)成本高，而且副產(chǎn)物多，產(chǎn)量低，環(huán)境污染嚴(yán)重；相反，生物轉(zhuǎn)化法反應(yīng)條件溫和，環(huán)境污染小，并具有良好的化學(xué)選擇性[7]、區(qū)域選擇性[8]和對映選擇性[9]等優(yōu)點。

巴氯芬 (Baclofen)，商品名力奧來素(Lioresa1)，化學(xué)名β-4-氯苯基-γ-氨基丁酸，是γ-氨基丁酸的取代衍生物，曾作為肌松藥用于臨床，后續(xù)研究還發(fā)現(xiàn)其具有鎮(zhèn)咳、抗癲癇、治療頑固性呃逆、中風(fēng)及脊髓損傷引起的疼痛、三叉神經(jīng)痛等臨床作用[10-11]。巴氯芬是一種手性藥物，存在一對對映異構(gòu)體，據(jù)文獻(xiàn)報道，(R)-巴氯芬的活性是 (S)-巴氯芬的100倍[11]。但由于光學(xué)純的巴氯芬的合成成本較高，目前市場上的巴氯芬藥品仍是消旋體。

目前，光學(xué)純巴氯芬的合成方法主要集中于化學(xué)合成[12-15]、手性拆分[16-18]以及酶催化-化學(xué)合成[19-20]?；瘜W(xué)水解方法通常需要高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿條件，并伴隨有大量鹽類形成，給分離純化帶來困難，也造成一定的環(huán)境污染；而酶法水解則具有高效性、高選擇性、反應(yīng)條件溫和、環(huán)境污染小、成本低、產(chǎn)物光學(xué)純度高等優(yōu)點，這符合原子經(jīng)濟(jì)性和綠色化學(xué)發(fā)展的要求。另外，化學(xué)法很難實現(xiàn)二腈到單腈單酸的選擇性水解，而酶法卻可輕易完成該反應(yīng)，故將傳統(tǒng)的有機(jī)合成與生物催化結(jié)合的方法 (化學(xué)-酶法) 在手性醫(yī)藥中間體合成方面顯示了巨大的優(yōu)勢[21]。而到目前為止，對腈的區(qū)域和立體選擇性生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)的研究還比較少，特別是以潛手性的二腈為底物，生物轉(zhuǎn)化生成光學(xué)活性的單氰基羧酸化合物的反應(yīng)更是稀少。王梅祥等[20]利用紅球菌Rhodococcussp. AJ270 細(xì)胞在催化轉(zhuǎn)化72 h后實現(xiàn)了3-(4-氯苯基)-戊二腈的選擇性水解，生成的產(chǎn)物為 (S)-4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物ee值為26%，在體系中添加丙酮后ee提高至63%。

本文從腈水解酶產(chǎn)生菌株的篩選入手，得到一株能將底物 3-(4-氯苯基)-戊二腈去對稱性水解成S構(gòu)型的4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸的菌株，并對其催化性能進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基 (g/L)：牛肉膏10，葡萄糖25，酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 5。pH 7.0，115 ℃滅菌20 min。發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：乳糖30，蛋白胨 10，NaCl 1.16，MgSO4·7H2O 0.12，KH2PO42.72，己內(nèi)酰胺 2.26。pH 7.0，115 ℃滅菌 20 min。

1.1.2 主要試劑和儀器

隔水式恒溫培養(yǎng)箱 (上海一恒，GHP-9270)；恒溫培養(yǎng)振蕩器 (上海智城，ZHWY-200D)；超凈工作臺 (蘇凈安泰，SW-CJ-1FD)；1260型高效液相色譜儀 (HPLC) 為 Agilent Technologies公司產(chǎn)品；手性分離柱Crownpak CR[+]和IB均為 DAICEL公司產(chǎn)品。蛋白胨、酵母粉為美國BD 公司產(chǎn)品；戊酸、丁二酸、2-，3-，4-氰基吡啶為 TCI公司產(chǎn)品；戊二酸、消旋巴氯芬為Alfa公司產(chǎn)品；(R)-巴氯芬為 TRC公司產(chǎn)品；其他試劑為國產(chǎn)分析純；HPLC所用流動相為色譜純。

1.2 催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)

離心收集發(fā)酵培養(yǎng)后的菌體，采用50 mmol/L磷酸緩沖液 (pH 7.2) 洗滌菌體3次，115 ℃烘干測菌體干重，按30 mg/mL的菌體干重將菌體重懸至5 mL體系，添加3-(4-氯苯基)-戊二腈0.04 g(終濃度 20 mmol/L)，催化反應(yīng)在 30 ℃、200 r/min條件下進(jìn)行。

1.3 酶活檢測

酶活采用國際單位，描述為：30 ℃下每分鐘生成1 μmol氨所需酶量為一個酶活單位 (U)；比酶活用每克干菌體 (DCW) 所產(chǎn)生的酶活表示(U/g)。腈水解酶菌株按方法1.2所示進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)，酶活采用苯酚-次氯酸鈉法測定反應(yīng)中生成的氨來快速檢測[22]。

1.4 高產(chǎn)菌株的篩選及鑒定

本實驗所采用的菌種由江南大學(xué)制藥工程實驗室保藏，將甘油管菌種接到種子培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，再按1%接種量轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，按1.2中方法進(jìn)行催化反應(yīng)，并按1.3中方法測定氨濃度并計算出酶活。

對實驗室保存的所有腈水解酶菌株進(jìn)行篩選，得到對底物3-(4-氯苯基)-戊二腈有活性的菌株 21株，轉(zhuǎn)化率 50%以上有 2株 (XY32和CN7)，但是其產(chǎn)物均為3-(4-氯苯基)-戊二酸，不具有選擇性；轉(zhuǎn)化率在 20%以上的菌株有 7株(CA4-3、CN7、CA4-1、XY32、CN4、CN5、WX12)。最終選擇產(chǎn)物為3-(4-氯苯基)-4-氰基丁酸、轉(zhuǎn)化率為34%的WX12為出發(fā)菌株進(jìn)行后續(xù)實驗。

WX12在察氏培養(yǎng)基固體平板上30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d，并進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步觀察。分子生物學(xué)鑒定采用 ITS-5.8S rDNA序列分析方法[23]。菌體與石英砂混合后液氮研磨，根據(jù)Biospin真菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取。以 ITS1 (5￠-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3￠)和ITS4 (5￠-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3￠) 為引物[23]，對菌株的ITS-5.8S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，54 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 90 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用TIANGEN試劑盒回收，與載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選并驗證載體已成功連接到目的片段后由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司完成測序。將所測得的序列與 GenBank數(shù)據(jù)庫中的已有序列進(jìn)行Blast比對分析。系統(tǒng)進(jìn)化分析由分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA version 3.1完成。

1.5 巴氯芬的合成

以4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸為底物，經(jīng)兩步化學(xué)反應(yīng)可合成巴氯芬[20]：第一步，氰基氨化，不完全水解生成酰胺；第二步，霍夫曼降解反應(yīng)，酰胺變成氨基 (圖1)。

圖1 4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸合成巴氯芬過程[20]Fig. 1 Synthesis of baclofen from 4-cyano-3-(4-chlorophenyl)-acid[20].

在第一步的腈基氨化反應(yīng)中，每200 mg單腈單酸產(chǎn)物，加入3 mL的NaOH (2.5 mol/L) 和6 mL H2O2，反應(yīng)過程中以TLC進(jìn)行實時監(jiān)測，直至無單腈單酸殘余。終止反應(yīng)，邊攪拌邊加入濃HCl進(jìn)行中和，可發(fā)現(xiàn)有白色小顆粒狀固體析出，至固體析出不再增多為止，冰浴1 h，抽濾，旋干，可得到白色粉末狀產(chǎn)物單酰胺單酸156 mg(產(chǎn)率 72.3%)。

第二步反應(yīng)中，單酰胺單酸先用2.5 mol的1 mol/L的NaOH溶解，另外2.5 mol的1 mol/L的NaOH與1.2 mol的Br2(38.8 μL) 冰浴下混合，冰浴下緩慢加入到單酰胺單酸溶解液中，冰浴中反應(yīng)30 min，常溫反應(yīng)30 min，40 ℃反應(yīng) 30 min，70 ℃反應(yīng)約2 h (實驗過程中進(jìn)行波層色譜層析(HPLC) 實時監(jiān)測，當(dāng)?shù)孜锿耆暮蠼K止反應(yīng))。緩慢滴加濃鹽酸使中和至pH=6，離心，上清和沉淀分別進(jìn)行TLC和HPLC檢測。

1.6 分析方法

1.6.1 產(chǎn)物4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸的檢測

轉(zhuǎn)化反應(yīng)終止后用濃鹽酸將樣品調(diào)至酸性(pH 2)，再加入等體積甲基叔丁基醚，渦旋儀混勻后于12 000 r/min離心1 min。取上層有機(jī)相用薄層色譜層析 (TLC) 進(jìn)行初步檢測。展開劑為二氯甲烷∶冰醋酸=50∶1，在254 nm的紫外燈下觀察。吹干展開劑，將層析板置于溴甲酚綠乙醇溶液中數(shù)秒后，使其受熱至有樣品顯色 (底物無顏色；產(chǎn)物顯黃色)。有產(chǎn)物點出現(xiàn)的樣品取2 mL有機(jī)相，充分揮發(fā)，等體積HPLC流動相(正己烷∶異丙醇=1∶9) 溶解，HPLC定量檢測，檢測條件為：大賽璐鍵合型手性柱CHIRALPAK?IB (4.6 mm×250 mm, 5 μm)，含 0.05%冰醋酸的異丙醇/正己烷=9/1為流動相，流速0.4 mL/min，波長為230 nm處檢測。

以經(jīng)核磁鑒定的產(chǎn)物和底物 3-(4-氯苯基)-戊二腈為標(biāo)樣，測定此條件下物質(zhì)的摩爾量與峰面積之間的關(guān)系，分別滿足線性關(guān)系y1(底物)=6014A1+31.92 (R2=0.999) 與y2(產(chǎn)物)=2359A2?339.0 (R2=0.999)。故

1.6.2 巴氯芬的檢測

采用薄層層析法 (TLC) 定性檢測，通過茚三酮顯色；手性HPLC檢測[24]條件為：Daicel手性色譜柱CROWNPAK?CR(+)/(-) (4.0 mm×150 mm，5 μm)，含10%甲醇、pH 1.5的高氯酸水溶液為流動相，流速1.0 mL/min，檢測波長為200 nm，柱溫 40 ℃。(R)-巴氯芬和(S)-巴氯芬的保留時間分別為tS=17.3 min，tR=27.1 min，故 (S)-巴氯芬(即產(chǎn)物(S)-4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸) 的對映體過量值為：

式中，AS：液相色譜分析 (S)-巴氯芬的峰面積。AR：液相色譜分析 (R)-巴氯芬的峰面積。

2 結(jié)果

2.1 高產(chǎn)菌株鑒定

通過篩選獲得了一株編號為WX12的菌株，在發(fā)酵培養(yǎng)基中成菌球狀，平板觀察為白色絲狀，顯微觀測形態(tài)如圖2所示，分子生物學(xué)鑒定結(jié)果為赤霉菌G. intermediaWX12，對該菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果見圖3。

圖2 赤霉菌WX12的顯微鏡觀測圖Fig. 2 Microscope pictures of Gibberella intermedia WX12.

圖3 通過neighbor-joining法構(gòu)建的基于菌株WX12的ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on ITS sequences of strain WX12 constructed by the neighbor-joining method.

2.2 發(fā)酵產(chǎn)酶曲線

種子液以1%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，定時取樣，按方法1.2稱量菌體干重，靜息細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)8 h后苯酚-次氯酸鈉法測定酶活。由圖4可知：發(fā)酵培養(yǎng)96 h，菌體干重和酶活均達(dá)到最大值，分別為 3.94 g/L和49.57 U/g。

2.3 催化特性研究

2.3.1 最適溫度和pH

按方法 1.2中的轉(zhuǎn)化體系，分別在不同 pH值的緩沖液和不同溫度轉(zhuǎn)化反應(yīng) 24 h，得到WX12 的最佳轉(zhuǎn)化條件為：30 ℃ (圖 5A)，pH=8.0的磷酸鈉緩沖液 (圖5B)。

圖4 WX12發(fā)酵產(chǎn)酶曲線Fig. 4 Time course of enzyme production for WX12.

圖5 溫度和pH對轉(zhuǎn)化過程的影響Fig. 5 Effect of temperature (A) and pH (B) on the reaction. (A) The reaction was carried out in sodium phosphate buffer (pH 7.2). (B) The reaction was carried out at 30 °C and different pH (pH=6.0?9.0: Sodium phosphate buffer solution; pH=9.0?10.0: Na2CO3/NaHCO3 buffer).

2.3.2 轉(zhuǎn)化實驗進(jìn)程

按上述轉(zhuǎn)化體系在最適溫度和pH值條件下進(jìn)行催化轉(zhuǎn)化反應(yīng)，測定反應(yīng)進(jìn)程，結(jié)果如圖6所示?？芍恨D(zhuǎn)化時間為24 h時產(chǎn)率達(dá)最大值90%。

2.3.3 底物特異性

圖6 腈水解酶的催化轉(zhuǎn)化進(jìn)程Fig. 6 Catalytic conversion process of WX12 nitrilase.

分別以不同的芳香腈、脂肪腈和雜環(huán)腈為底物，測定WX12的催化活性，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，WX12腈水解酶對脂肪腈類和雜環(huán)腈類具有較高的酶活，其中對丁二腈具有最高活性。而對芳香腈類物質(zhì)如苯甲腈也具有一定的水解效果，但當(dāng)氰基附近帶有較大的取代基團(tuán)時，由于受到立體阻遏效應(yīng)的影響，酶活性則顯著減小，如2-苯基丁腈、扁桃腈、芐烯丙二腈等不能被水解。

2.4 水解產(chǎn)物立體構(gòu)型的確定

WX12催化3-(4-氯苯基)-戊二腈水解得到的產(chǎn)物 4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸沒有光學(xué)純的標(biāo)準(zhǔn)品，不能直接檢測水解產(chǎn)物的構(gòu)型，但因后續(xù)化學(xué)合成反應(yīng)不改變產(chǎn)物的構(gòu)型，故可通過合成最終產(chǎn)物巴氯芬來進(jìn)行檢測。

WX12生物轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物按1.5中方法進(jìn)行終產(chǎn)物巴氯芬的合成，按1.6.2中方法進(jìn)行HPLC檢測 (圖7)，可知，生成的終產(chǎn)物為 (S)-巴氯芬，且ee＞99%。

表1 菌株對各種腈類化合物的酶活性Table 1 Nitrilase activity towards various aliphatic, aromatic and heterocyclic nitriles

圖7 WX12催化反應(yīng)產(chǎn)物巴氯芬的HPLC譜圖Fig. 7 The HPLC spectrum of product catalyzed by WX12. Green for the standard sample of racemic baclofen. Red for the standard sample of (R)-baclofen. Blue for the product catalyzed by WX12.

3 討論

化學(xué)-酶共催化有機(jī)合成法可以克服化學(xué)法與酶法單一催化有機(jī)合成反應(yīng)時存在的缺點，是有機(jī)合成反應(yīng)的新途徑[21]，然而利用化學(xué)-酶共催化法來催化潛手性的 3-(4-氯苯基)-戊二腈轉(zhuǎn)化成為合成巴氯芬關(guān)鍵中間體 4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸的研究卻鮮有報道。

本研究篩選得到腈水解酶菌株G. intermediaWX 12，最優(yōu)催化轉(zhuǎn)化條件為：30 ℃，50 mmol/L磷酸鈉緩沖液 (pH 8.0)，轉(zhuǎn)化24 h，經(jīng)HPLC檢測產(chǎn)率達(dá)90.2%。產(chǎn)物4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸經(jīng)氰基不完全水解和霍夫曼重排反應(yīng)后所得的巴氯芬，HPLC鑒定為絕對構(gòu)型的 (S)-巴氯芬，ee＞99%。據(jù)文獻(xiàn)[17,20]報道，ee值為 77%的(S)-3-(4-氯苯基)-4-氰基丁酸，經(jīng)霍夫曼重排(Hoffman rearrangement) 可得到ee值為86%的(S)-巴氯芬；經(jīng)庫爾提斯重排 (Curtius rearrangement) 則可得到ee值為 85%的 (R)-巴氯芬。因此，(S)-4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸是合成光學(xué)純巴氯芬的重要前體，不但可以經(jīng)腈基水解至酰胺再通過霍夫曼重排可得到S構(gòu)型的巴氯芬，還可在羧基衍生后經(jīng)庫爾提斯重排得到氨基，繼而將剩余的氰基水解得到R構(gòu)型的巴氯芬。

具有腈基水解酶活性的菌株G. intermediaWX 12可高效、高區(qū)域選擇性、高立體選擇性水解對稱二腈化合物，得到光學(xué)純的單腈單酸中間體；而后續(xù)可通過不同的化學(xué)轉(zhuǎn)化可以合成光學(xué)純的 (R)或(S)-γ-氨基酸[20]，為光學(xué)純的γ-氨基酸的合成研究打下了基礎(chǔ)。

[1]Fleming FF, Yao LH, Ravikumar PC, et al.Nitrile-containing pharmaceuticals: efficacious roles of the nitrile pharmacophore. J Med Chem,2010, 53: 7902?7917.

[2]Tao JH, Lin GQ, Liese A. Biocatalysis for the Pharmaceutical Industry. Singapore: John Wiley &Sons (Asia) Pte Ltd., 2009: 163?178.

[3]Zheng YG, Xue YP, Liu ZQ, et al. Applications of nitrile converting enzymes in the production of fine chemicals. Chin J Biotech, 2009, 25(12):1795?1807 (in Chinese).

鄭裕國, 薛亞平, 柳志強(qiáng), 等. 腈轉(zhuǎn)化酶在精細(xì)化學(xué)品生產(chǎn)中的應(yīng)用. 生物工程學(xué)報, 2009,25(12): 1795?1807.

[4]Lou WY, Zong MH, Liu SL. Research progress on microbial nitrile hydrolysis reactions catalyzed by enzymes. Microbiol China, 2001, 28(6): 76?81 (in Chinese).

婁文勇, 宗敏華, 劉森林. 微生物酶催化腈水解反應(yīng)的研究進(jìn)展. 微生物學(xué)通報, 2001, 28(6):76?81.

[5]Kobayashi M, Nagasawa N, Yamada H．Enzymatic synthesis of acrylamide：a success story not yet over. Trends Biotechno1, 1992, 10(11): 402?408.

[6]He YC. Studies on the screen for new nitrilase strains and its application[D]. Shanghai: East China University of Science and Technology, 2008.

何玉財. 腈水解酶新菌株的篩選及其應(yīng)用研究[D]. 上海：華東理工大學(xué)，2008.

[7]A de Raddt, Klempier N, Farber K, et al.Chemoselective enzymatic hydrolysis of aliphatic and alicyclic nitriles. J Chem Soc Perkin TransⅠ,1992: 137?140.

[8]Otto MC, Wang MX. Regioselective biotransformations of dinitriles usingRhodococcussp. AJ270. J Chem Soc, Perkin TransⅠ , 1997:3197?3204.

[9]Banerjee A, Dubey S, Kaul P, et al. Enantioselective nitrilase fromPseudomonas putida: cloning,heterologous expression, and bioreactor studies.Mol Biotechnol, 2009, 41: 35?41.

[10]Xie RM. Research progress on clinical application of baclofen. World Clincal Drug, 2006, 27(3):148?153 (in Chinese).

謝瑞滿. 巴氯芬臨床應(yīng)用研究進(jìn)展. 世界臨床藥物, 2006, 27(3): 148?153.

[11]Chen YH, Mao ZJ, Yang WQ, et al. New technical synthesis of (R)-baclofen. Zhejiang Chem Ind,2008, 39(12): 1?8 (in Chinese).

陳云華, 毛偵軍, 楊偉強(qiáng), 等. (R)-巴氯芬的合成研究. 浙江化工, 2008, 39(12): 1?8.

[12]Yu XH, Jiang M, Shen ZH, et al. Synthesis of baclofen hydrochloride. Chin J Pharm, 2010, 41(6):407?409 (in Chinese).

虞心紅, 江淼, 諶志華, 等. 鹽酸巴氯芬的合成.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志, 2010, 41(6): 407?409.

[13]Rolf HP, Karl Schafer, David PG, et al. The synthesis of (R)-(?) and (S)-(+)-hydroxysaclofen.Tetrahedron, 1995, 51(42): 1465?1472.

[14]Patricia R, Wanda PA, Fernando C. An eff i cient synthesis of (R)-(?)-baclofen. Tetrahedron:asymmetr, 1999, 10: 2113?2118.

[15]Claudio M, Jacques L, Veronique A, et al. A chemoenzymatie strategy for the synthesis of enantiopure (R)-(?)-baclofen. Tetrahedron Lett,1997, 38, (7): 1195?1196.

[16]Elisabetta B, Nicola C, Claudio F, et al.Enantioselective synthesis of β-substituted butyric acid derivatives via orthoester Claisen rearrangement of enzymatically resolved allylic alcohols: application to the synthesis of(R)-(?)-baclofen. Tetrahedron: asymmetr, 1997,8(22): 3801?3805.

[17]Li J, Ji L. Method for preparing chiral baclofen:Chinese Patent, CN101514167A. 2009-08-26.

李靖, 冀蕾. 手性巴氯芬的制備方法: 中國專利，CN101514167A. 2009-08-26.

[18]Karla R, Ebert B, Thorkildsen C. et al. Synthesis and pharmacology of the baclofen homologues 5-amino-4-(4-chlorophenyl)pentanoic acid and theR- andS-enantiomers of 5-amino-3-(4-chlorophenyl)pentanoic acid. J Med Chem, 1999, 42: 2053?2059.

[19]Wang MX, Zhao SM. Highly enantioselective biotransformations of 2-aryl-4-pentenenitriles, a novel chemoenzymatic approach to (R)-(?)-baclofen.Tetrahedron Lett, 2002, 43: 6617?6620.

[20]Wang MX, Liu CS, Li JS, et al. Microbial desymmetrization of 3-arylglutaronitriles, an unusual enhancement of enantioselectivity in the presence of additives. Tetrahedron Lett, 2000, 41:8549?8552.

[21]Jin LE, Yin HY, Bao WR, et al. Features and applications of chemoenzymatic synthesis. Ind Catal, 2009, 7(4): 6?9 (in Chinese).

靳利娥, 殷紅顏, 鮑衛(wèi)仁, 等. 化學(xué)-酶共催化合成反應(yīng)的特點及應(yīng)用. 工業(yè)催化, 2009, 7(4): 6?9.

[22]Gong JS, Lu ZM, Shi JS, et al. Isolation,identification, and culture optimization of a novel glycinonitrile-hydrolyzing fungus—Fusarium oxysporumH3. Appl Biochem Biotechnol, 2011,165: 963?977.

[23]Chen JS, Zheng FC. Application of ITS sequences in fungi classification and identification. Anhui Agri Sci, 2007, 35(13): 3785?3786, 3792 (in Chinese).

陳劍山, 鄭服叢. ITS 序列分析在真菌分類鑒定中的應(yīng)用. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35(13):3785?3786, 3792.

[24]Goda R, Murayama N, Fujimaki Y, et al. Simple and sensitive liquid chromatography?tandem mass spectrometry method for determination of the(S)-(+)- and (R)-(?)-enantiomers of baclofen in human plasma and cerebrospinal fl uid. J Chromatography B, 2004, 801: 257?264.

September 3, 2012; Accepted: December 3, 2012

Zhenghong Xu. Tel/Fax: +86-510-85918206; E-mail: Zhenghxu@jiangnan.edu.cn Dunming Zhu. Tel: +86-22-84861962; Fax: +86-22-84861996; E-mail: zhu_dm@tib.cas.cn

國家重點基礎(chǔ)發(fā)展計劃 (973計劃) (No. 2011CB710801)，天津科技計劃項目 (No. 09ZCKFSH01000) 資助。

Biocatalytic desymmetric hydrolysis of 3-(4-chlorophenyl)-glutaronitrile to the key precursor of optically pure baclofen

Meizhen Xu1, Jie Ren2, Jingsong Gong1, Wenyue Dong2, Qiaqing Wu2, Zhenghong Xu1,and Dunming Zhu2

1Laboratory of Pharmaceutical Engineering,School of Medicine and Pharmaceutics,Jiangnan University,Wuxi214122,Jiangsu,China
2National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes,Tianjin Institute of Industrial Biotechnology,Chinese Academy of Sciences,Tianjin300308,China

We produced (S)-4-cyano-3-(4-chlorophenyl)-butyrate by highly stereoselective biocatalyst in this study. A nitrilase-producing strain, namedGibberella intermediaWX12, was isolated by 3-(4-chlorophenyl)-glutaronitrile as substrate in the screening with phenol-sodium hypochlorite method. The fermentation conditions and catalytic properties of this strain were investigated. The preferred carbon and nitrogen sources for nitrilase production were lactose (30 g/L) and peptone (20 g/L). After being cultivated for 96 h, the cells were collected for use in biotransformation. The hydrolysis of 3-(4-chlorophenyl)-glutaronitrile was performed at 30 °C in phosphate buffer (pH 8.0, 50 mmol/L) for 24 h to give(S)-4-cyano-3-(4-chlorophenyl)-butyric acid with 90% yield and >99% ofee, which can be used for the synthesis of (R)-and (S)-baclofen. The configuration of product was determined by chemically converting it to baclofen and comparison with the authentic sample by chiral HPLC analysis.

nitrilase, 3-(4-chlorophenyl)-glutaronitrile, 4-cyano-3-(4-chlorophenyl)-butyric acid, baclofen

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CB710801), Tianjin Municipal Science & Technology Project (No. 09ZCKFSH01000).

(本文責(zé)編 郝麗芳)