微生物發(fā)酵生產(chǎn)α-酮戊二酸研究進(jìn)展

郭洪偉，堵國(guó)成,2，周景文,2，陳堅(jiān),2

1 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 2141222 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

微生物發(fā)酵生產(chǎn)α-酮戊二酸研究進(jìn)展

郭洪偉1，堵國(guó)成1,2，周景文1,2，陳堅(jiān)1,2

1 江南大學(xué)生物工程學(xué)院 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122
2 江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122

郭洪偉, 堵國(guó)成, 周景文, 等. 微生物發(fā)酵生產(chǎn)α-酮戊二酸研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2013, 29(2): 141?152.

Guo HW, Du GC, Chen JW, et al. Progress in microbial production of α-ketoglutarate. Chin J Biotech, 2013, 29(2): 141?152.

α-酮戊二酸是微生物三羧酸循環(huán)中重要的代謝中間產(chǎn)物，是連接細(xì)胞內(nèi)碳-氮代謝的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。文中從4個(gè)方面歸納了國(guó)內(nèi)外關(guān)于α-酮戊二酸研究進(jìn)展：能夠過(guò)量積累α-酮戊二酸的原核和真核微生物的發(fā)現(xiàn)和篩選；硫胺素缺陷型和氮源饑餓引起的 α-酮戊二酸過(guò)量積累的生理學(xué)特性；控制培養(yǎng)環(huán)境中的pH、溶氧和輔因子對(duì)生產(chǎn)α-酮戊二酸發(fā)酵過(guò)程控制與優(yōu)化；調(diào)控輔因子再生和代謝途徑改造高產(chǎn)菌株。最后，討論了微生物法生產(chǎn)α-酮戊二酸存在的不足和今后研究的方向。

α-酮戊二酸，微生物發(fā)酵生產(chǎn)，α-酮戊二酸高產(chǎn)微生物篩選，優(yōu)化控制，代謝改造

a-酮戊二酸 (a-ketoglutarate，a-KG) 是一種重要的短鏈羧酸分子，具有廣泛的應(yīng)用前景[1-3]。近年來(lái)，由于a-KG 能減輕腎病患者的腎臟負(fù)擔(dān)、減少并發(fā)癥和促進(jìn)患者手術(shù)后快速恢復(fù)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[4]；a-KG與精氨酸等氨基酸復(fù)配，能快速幫助運(yùn)動(dòng)員補(bǔ)充能量。除此以外，由于a-KG特殊的化學(xué)性質(zhì)，被廣泛用于化學(xué)合成行業(yè)[5-6]。以上三大應(yīng)用促使a-KG的需求量大幅增加。

雖然國(guó)際市場(chǎng)對(duì)該短鏈羧酸的需求不斷擴(kuò)大，但由于其分子中同時(shí)存在羰基和羧基的特殊化學(xué)結(jié)構(gòu)導(dǎo)致化學(xué)合成路線長(zhǎng)、收率低、合成過(guò)程中有毒化學(xué)試劑氰化物的使用等問(wèn)題，制約了化學(xué)合成a-KG在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域的使用[5]。此外，由于石油、煤炭等非可再生資源的快速消耗，以及有毒廢棄物的排放造成環(huán)境惡化問(wèn)題日益突出，所以以可再生生物資源為底物，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)a-KG成為最佳選擇。本文從高產(chǎn)菌株的篩選、高產(chǎn)菌株生理學(xué)特性、發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化控制和代謝工程改造 4個(gè)方面進(jìn)行歸納。

a-KG 是微生物細(xì)胞中三羧酸循環(huán)(Tricarboxylic acid cycle，TCA cycle) 中重要的代謝中間產(chǎn)物，環(huán)境中的碳源物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，經(jīng)過(guò)糖酵解形成丙酮酸 (Pyruvate，PYR)，以PYR形式進(jìn)入三羧酸循環(huán)的碳源物質(zhì)依次在丙酮酸脫氫酶系 (Pyruvate dehydrogenase complex，PDHC)、檸檬酸合成酶(Citrate synthase)、順烏頭酸酶 (Aconitase) 和異檸檬酸脫氫酶 (Isocitrate dehydrogenase) 作用下形成a-KG，a-KG 在a-酮戊二酸脫氫系(a-ketogluratate dehydrogenase，KGDH) 的作用下進(jìn)一步代謝成琥珀酰-CoA，進(jìn)入下一個(gè)碳代謝節(jié)點(diǎn)，在這一過(guò)程中伴隨著電子傳遞和能量產(chǎn)生，這一過(guò)程為細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖提供碳源物質(zhì)和能量；除此之外，a-KG經(jīng)轉(zhuǎn)氨基作用形成L-谷氨酸進(jìn)入氮代謝中，所以a-KG是連接碳代謝和氮代謝的重要代謝中間產(chǎn)物 (圖1)[7]。

a-KG能表征細(xì)胞中碳-氮平衡水平，在機(jī)體內(nèi)能參與多種調(diào)節(jié)過(guò)程。Forchhammer研究表明：a-KG能與廣泛存在于植物、微生物和藻類細(xì)胞內(nèi)對(duì)細(xì)胞內(nèi)碳源、氮源和能量水平的感知的調(diào)控因子PII蛋白結(jié)合，調(diào)控細(xì)胞碳、氮源代謝。在不同氮源條件下，大腸桿菌Escherichia coli中PII蛋白能與組氨酸激酶NtrB/NtrC調(diào)節(jié)系統(tǒng)中的NtrB結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)glnA和glnK等氮源代謝基因的表達(dá)[8]。

綜上，研究a-KG的形成機(jī)制和其參與細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)作用具有廣泛的理論和實(shí)踐意義。

圖1 碳-氮源代謝聯(lián)系Fig. 1 Connection of carbon-nitrogen metabolism.pyruvate dehydrogenase;citrate synthase;aconitase;isocitrate dehydrogenase;ketoglutarate dehydrogenase;succinl-CoA synthase;succinate dehydrogenase;fumarase;malate dehydrogenase;glutamate dehydrogenase;glutamine sythetase;glutamate sythase;pyruvate carboxylase.

1 過(guò)量積累a-KG菌株的發(fā)現(xiàn)與篩選

1.1 能夠過(guò)量積累a-KG的原核微生物

早在 1946年，Lockwood等發(fā)現(xiàn)了熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescens在胞外積累a-KG的現(xiàn)象，他們的研究表明：當(dāng)培養(yǎng)基中碳源∶氮源含量比例為 40∶1～400∶1時(shí)，P.fluorescensNRRL B-6可以利用100 g/L葡萄糖積累 16～17 g/L a-KG[9]。隨后，Asai等發(fā)現(xiàn)多種原核微生物菌種能過(guò)量積累a-KG，包括帖質(zhì)沙雷氏菌Serratia marcescens和多種芽胞桿菌屬Bacillusssp.的菌株。這些菌株能積累18 g/L的a-KG，但是伴隨著代謝副產(chǎn)物丙酮酸的積累[10]。1969年，Tanaka等發(fā)現(xiàn)石蠟節(jié)桿菌Arthrobacter paraffineus能利用石蠟積累高達(dá)70 g/L的a-KG，這是目前發(fā)現(xiàn)原核生物中積累a-KG最高的菌株[11]，此外，也有報(bào)道利用代謝工程手段對(duì)谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum改造發(fā)酵生產(chǎn)a-KG。Verseck等利用一株谷氨酸脫氫酶編碼基因缺失的谷氨酸棒桿菌，并在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)維持發(fā)酵液中高的NH4+濃度從而抑制谷氨酸合酶和谷氨酰胺合成酶活性，使得發(fā)酵液中a-KG濃度達(dá)到5 g/L[12]。

以上研究開創(chuàng)了利用微生物過(guò)量積累a-KG的先河，并對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)的培養(yǎng)條件進(jìn)行了初步探索，但是這些原核微生物不能有效地維持細(xì)胞內(nèi) pH值的平衡，導(dǎo)致產(chǎn)量低和生產(chǎn)強(qiáng)度不高，從而未能實(shí)現(xiàn)工業(yè)大規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)。

1.2 能夠過(guò)量積累a-KG的真核微生物

真核微生物細(xì)胞能產(chǎn)生足夠的 ATP分子維持細(xì)胞內(nèi)的pH平衡和跨細(xì)胞膜H+梯度抵御低pH環(huán)境條件，更適合發(fā)酵法生產(chǎn)短鏈有機(jī)酸[13]，近年來(lái)研究報(bào)道的過(guò)量積累a-KG的微生物多以真核微生物為主。

1968年，F(xiàn)inogenova等利用液體石蠟生產(chǎn)微生物蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)解脂亞洛酵母Yarrowia lipolytica能夠積累a-KG[14]。這是真核微生物積累a-KG的首次報(bào)道。此后，研究人員進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)多種真核微生物能在胞外過(guò)量積累a-KG。1997年，Chernyavskaya等對(duì)比研究了來(lái)源于假絲酵母屬Candidassp.、畢赤酵母屬Pichiassp.和解脂亞洛酵母等 20株酵母菌株以乙醇為唯一碳源生產(chǎn)a-KG，這些酵母菌株都需要在發(fā)酵培養(yǎng)基中外源添加生物素或者硫胺素等輔因子才能過(guò)量積累a-KG[15]。2007年，Liu等通過(guò)控制發(fā)酵液中的Ca2+濃度、生物素和硫胺素等輔因子水平，促使過(guò)量積累的丙酮酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)，使Torulopsis glabrata能過(guò)量積累43.7 g/L的a-KG[16]。這些微生物在過(guò)量積累a-KG的過(guò)程中，有大量的丙酮酸、檸檬酸或異檸檬酸等副產(chǎn)物產(chǎn)生，利用代謝工程手段對(duì)其進(jìn)行改造日益成為研究熱點(diǎn)。

在這些報(bào)道的酵母菌株中，Y.lipolytica因其生理特性清晰、生長(zhǎng)快速、底物譜寬、能過(guò)量積累三羧酸循環(huán)中多種中間代謝產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)被廣泛關(guān)注[17-18]。隨著Y.lipolytica全基因組序列的公布[19]和分子生物學(xué)操作所必需的質(zhì)粒等工具的完善，使其成為發(fā)酵法生產(chǎn)a-KG的理想菌株[20-22]。

1997年，Chernyavskaya等選育出一株可以利用乙醇為唯一碳源生產(chǎn)a-KG的高產(chǎn)菌Y. lipolyticaN1，該菌株能積累48 g/L的a-KG[15]。隨后，德國(guó)Barth研究小組以Y.lipolyticaH222菌株為出發(fā)菌株，利用分子生物學(xué)操作，對(duì)丙酮酸羧化酶、延胡索酸酶、順烏頭酸酶和乙醛酸循環(huán)中異檸檬酸裂解酶編碼基因進(jìn)行過(guò)量表達(dá)或者敲除降低產(chǎn)酸過(guò)程中代謝副產(chǎn)物[23-25]。

2010年，Zhou等從富含油脂的土壤中篩選得到一株能過(guò)量積累a-KG的菌株Y.lipolyticaWSH-Z06，在外源添加硫胺素的條件下，以甘油為碳源能積累39.2 g/L的a-KG[26]。2012年，Yin等利用Y.lipolyticaWSH-Z06為出發(fā)菌株，通過(guò)調(diào)控輔因子再生和過(guò)量表達(dá)三羧酸循環(huán)中酶兩個(gè)層次降低代謝副產(chǎn)物丙酮酸含量[27-28]。

上述報(bào)道的菌株歸納于表1。

2 微生物積累a-KG 的代謝途徑與調(diào)控過(guò)程

由于a-KG處于三羧酸循環(huán)的關(guān)鍵位置，不僅連接著細(xì)胞內(nèi)碳-氮代謝，而且還表征著細(xì)胞內(nèi)碳-氮代謝平衡狀態(tài)，并參與細(xì)胞內(nèi)多種調(diào)控過(guò)程。因此，分析a-KG積累過(guò)程，對(duì)于揭示碳-氮代謝平衡的生理機(jī)制，具有重要的理論意義。

2.1 硫胺素不足引起菌株過(guò)量積累a-KG

硫胺素是三羧酸循環(huán)中丙酮酸脫氫酶和酮戊二酸脫氫酶的輔因子，該輔因子的不足會(huì)引起細(xì)胞生理特性的改變。上世紀(jì) 60年代，F(xiàn)inogenova等發(fā)現(xiàn)當(dāng)硫胺素不足時(shí)，Y.lipolytica能積累a-KG[14]，他們的研究小組發(fā)現(xiàn)所有能過(guò)量積累a-KG的Y.lipolytica菌株都不能合成硫胺素中的嘧啶環(huán)，導(dǎo)致了這些菌株對(duì)外源添加硫胺素的依賴[18]。Morgunov等對(duì)這一現(xiàn)象進(jìn)行深入研究發(fā)現(xiàn)：Y.lipolytica在生產(chǎn)a-KG過(guò)程中，菌株過(guò)量合成a-KG和 PYR的過(guò)程伴隨著菌株的生長(zhǎng)速率下降，并且以硫胺素為輔因子的PDHC和KGDHC活性下降。由此，他們得出結(jié)論：硫胺素是菌株積累a-KG的關(guān)鍵因素[30]。

表1 a-KG生產(chǎn)菌株Table 1 a-KG producing organisms

硫胺素缺陷導(dǎo)致多種酵母菌株過(guò)量積累a-KG。2000年，Chernyavskaya等對(duì)比研究了在不同硫胺素濃度下20株酵母菌株利用乙醇為碳源合成a-KG情況，這20株酵母菌株中，生長(zhǎng)不依賴外源添加這一輔因子的酵母亦不能過(guò)量積累a-KG；低濃度硫胺素 (0.2～0.5 mg/L) 為菌體生長(zhǎng)限制因素時(shí)，菌體能過(guò)量合成a-KG；當(dāng)硫胺素濃度超過(guò)500 mg/L時(shí)，菌體停止合成a-KG[31]。當(dāng)環(huán)境中硫胺素充足時(shí)，PDHC和KGDHC能維持較高活力，三羧酸循環(huán)能順利進(jìn)行；當(dāng)環(huán)境中硫胺素不足時(shí)，這些以硫胺素為輔因子的PDHC和KGDHC活力大幅下降，從細(xì)胞外流入三羧酸循環(huán)中的碳源的物質(zhì)只能部分氧化成PYR和a-KG，菌體停止生長(zhǎng)，從而過(guò)量積累三羧酸循環(huán)中間代謝產(chǎn)物。此外，過(guò)量合成a-KG所需的最適硫胺素濃度與培養(yǎng)基中底物種類有關(guān)。當(dāng)葡萄糖為碳源時(shí)，酵母細(xì)胞合成a-KG需要的最適硫胺素濃度比以烷烴為碳源時(shí)對(duì)硫胺素需求量高3～5倍。

2.2 環(huán)境中的碳氮比對(duì)a-酮戊二酸積累的影響

Finogenova等發(fā)現(xiàn)由環(huán)境中的氮源不足引起的生長(zhǎng)限制能促使Y.lipolyticaN1菌株在硫胺素過(guò)量條件下過(guò)量合成檸檬酸 (Citric acid，CA) 和異檸檬酸 (Isocitric acid，ICA)[32]。

Chernyavskaya等研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)環(huán)境中的不同碳氮比對(duì)積累產(chǎn)物種類有重要影響，發(fā)酵液中過(guò)量的碳源和限量的氮源 (C∶N=40∶1～400∶1) 是促使細(xì)胞過(guò)量合成a-KG的因素之一，當(dāng)?shù)蜐舛?(3 g/L) 的 (NH4)2SO4成為菌體生長(zhǎng)限制性因素時(shí)，發(fā)酵液中主要產(chǎn)物是檸檬酸 (30 g/L) 而非a-KG (5 g/L)；當(dāng)(NH4)2SO4濃度提高至10 g/L時(shí)，細(xì)胞主要合成a-KG，檸檬酸的合成受到抑制；當(dāng) (NH4)2SO4濃度進(jìn)一步提高至12 g/L時(shí)，菌體生長(zhǎng)和a-KG的合成都受到抑制[31]。類似地，Il’cheko發(fā)現(xiàn)當(dāng)菌體開始積累三羧酸循環(huán)中間代謝產(chǎn)物時(shí)，如果維持發(fā)酵液中的 (NH4)2SO4濃度為0.9～1 g/L時(shí)，a-KG積累的速率達(dá)到最大；當(dāng) (NH4)2SO4完全被消耗后，發(fā)酵液中的主要產(chǎn)物是檸檬酸[33]。細(xì)胞在過(guò)量積累檸檬酸時(shí)，細(xì)胞中的谷氨酸脫氫酶幾乎為0；而在過(guò)量積累a-KG時(shí)，谷氨酸脫氫酶活性較高，高濃度的NH4+離子能抑制谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶的活性[34]。

然而，上述研究并未揭示培養(yǎng)環(huán)境中不同碳氮比影響產(chǎn)物譜的機(jī)制和菌體生理特性的改變。

2.3 過(guò)量積累a-KG菌株細(xì)胞內(nèi)代謝特點(diǎn)

2.3.1 檸檬酸和a-KG是菌株應(yīng)對(duì)不良環(huán)境條件的策略

2002 年，Il￠chenko 等對(duì)比Y.lipolyticaN1在過(guò)量積累a-KG和過(guò)量積累檸檬酸條件下，三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán) (Glyoxylate cycle) 中酶的活力，在過(guò)量合成a-KG條件下，除了檸檬酸合成酶外，三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)中所有其他酶的活性都要比過(guò)量合成檸檬酸條件下的酶活性要高。由此推斷：當(dāng)外界環(huán)境中氮源物質(zhì)完全被消耗完，導(dǎo)致三羧酸循環(huán)和乙醛酸循環(huán)中酶活力下降，唯獨(dú)檸檬酸合成酶保持較高的活力，促使細(xì)胞過(guò)量積累檸檬酸，微生物細(xì)胞過(guò)量合成檸檬酸抵御環(huán)境不良條件。另一方面，由于低濃度硫胺素引起的微生物細(xì)胞生長(zhǎng)限制，菌體通過(guò)過(guò)量合成a-KG應(yīng)對(duì)外界不良的環(huán)境條件，此時(shí)，環(huán)境中的NH4+被用來(lái)合成氨基酸[35]。

2.3.2 產(chǎn)酸階段細(xì)胞內(nèi)氮代謝的改變

2003 年，Il￠chenko 等對(duì)比Y.lipolyticaN1在過(guò)量積累a-KG和檸檬酸時(shí)細(xì)胞內(nèi)氮代謝相關(guān)酶的活力，當(dāng)菌株在過(guò)量合成a-KG時(shí)，以NADP+為輔因子的谷氨酸脫氫酶的活力和以NAD+為輔因子的谷氨酸脫氫酶都維持較高活力，而在過(guò)量合成檸檬酸的菌株細(xì)胞內(nèi)這兩個(gè)酶的活力幾乎為0。由于過(guò)量積累a-KG的發(fā)酵液中NH4+濃度接近20～30 mmol/L，而過(guò)量積累檸檬酸的發(fā)酵液中 NH4+濃度接近于 0，高濃度NH4+離子能抑制谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶的活性，因此在過(guò)量合成檸檬酸的菌體細(xì)胞內(nèi)的谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶都維持較高活力，而這兩種酶在過(guò)量合成a-KG的條件下活力很低，甚至為0。由此可見在a-KG過(guò)量積累的條件下，細(xì)胞利用NH4+合成谷氨酸；在檸檬酸積累過(guò)程中，谷氨酰胺的酰胺基作為菌體氮代謝的來(lái)源。除此之外，在過(guò)量積累a-KG的細(xì)胞內(nèi)，天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活力都很高，而在過(guò)量積累檸檬酸的細(xì)胞內(nèi)，只有天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶活力維持很高[34]。

2.3.3 改變代謝途徑對(duì)三羧酸循環(huán)進(jìn)行回補(bǔ)

2010 年，Il￠chenko 等發(fā)現(xiàn)Y.lipolyticaN1在過(guò)量積累a-KG的條件下，細(xì)胞中的谷氨酸、丙氨酸和g-氨基丁酸含量在17種氨基酸中含量最高，與之前研究得到的細(xì)胞中谷氨酸脫氫酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶活力高的結(jié)論相吻合，并且細(xì)胞勻漿中的谷氨酸脫羧酶、g-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶和琥珀酰半醛脫氫酶活力很高，綜合之前研究表明：由于硫胺素缺乏導(dǎo)致 KGDHC活力低，三羧酸循環(huán)中斷，細(xì)胞過(guò)量積累a-KG，細(xì)胞無(wú)法通過(guò)三羧酸循環(huán)合成琥珀酰-CoA，在該條件下，谷氨酸脫羧形成g-氨基丁酸，在g-氨基丁酸轉(zhuǎn)氨酶作用下形成琥珀酰半醛，再由琥珀酰半醛脫氫形成琥珀酸，對(duì)三羧酸循環(huán)進(jìn)行回補(bǔ)[36]。

3 微生物法產(chǎn)a-KG 的發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化與控制

對(duì)微生物發(fā)酵生產(chǎn)a-KG的影響較大的環(huán)境因素主要有：環(huán)境pH、發(fā)酵液中溶氧水平和發(fā)酵液中輔因子添加等，目前對(duì)發(fā)酵過(guò)程控制的研究主要集中在這三方面。

3.1 控制環(huán)境中的pH

Yu等利用 7 L發(fā)酵反應(yīng)器發(fā)酵生產(chǎn)a-KG時(shí)，對(duì)比研究了3種不同維持發(fā)酵液中pH值的策略：當(dāng)利用4 mol/L的NaOH維持發(fā)酵液中的pH為4.5時(shí)，菌體量為9.6 g/L DCW，最大a-KG產(chǎn)量為22.0 g/L，副產(chǎn)物丙酮酸高達(dá)36.9 g/L，這現(xiàn)象與之前 Chernyavskaya等的研究中維持發(fā)酵中pH 4.0有著較大的差別[31]。如果在發(fā)酵過(guò)程中不使用pH中和劑并對(duì)發(fā)酵全過(guò)程pH值變化解析發(fā)現(xiàn)：菌體生長(zhǎng)階段發(fā)酵液中的pH從6.5下降至3.5；伴隨著pH進(jìn)一步下降至2.7，有大量的a-KG積累，這一過(guò)程a-KG的生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到最大，隨后生產(chǎn)強(qiáng)度下降，此時(shí)pH降至2.4。因此，在菌體生長(zhǎng)階段用CaCO3維持發(fā)酵液中的pH值，在產(chǎn)酸階段利用4 mol/L的NaOH溶液維持發(fā)酵液中 pH 3.0，a-KG 的產(chǎn)量達(dá)到53.4 g/L，丙酮酸的含量為21.3 g/L[37]。

低pH值不僅有利于發(fā)酵生產(chǎn)階段積累過(guò)量的a-KG，并且由于減少pH中和劑的使用，減少下游的分離提取步驟，有利于降低生產(chǎn)成本。

3.2 控制發(fā)酵液中的溶氧水平

1991年，F(xiàn)inogenova等在研究發(fā)酵生產(chǎn)異檸檬酸時(shí)發(fā)現(xiàn)：發(fā)酵液中高溶氧水平對(duì)Y.lipolytica產(chǎn)酸有利[38]。這一現(xiàn)象也出現(xiàn)在發(fā)酵生產(chǎn)a-KG的過(guò)程中，Chernyavskaya等利用同一菌株以乙醇為碳源發(fā)酵產(chǎn)a-KG時(shí)，研究了發(fā)酵液中的不同溶氧水平對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酸情況，研究表明：維持低溶氧水平時(shí)，不僅發(fā)酵液中的菌體濃度比高溶氧水平時(shí)的菌體濃度高，達(dá)到15 g/L，而且菌體對(duì)發(fā)酵液中的NH4+的利用更快、更徹底，與此相對(duì)應(yīng)地，維持高溶氧水平的發(fā)酵液中的NH4+未被完全利用，此時(shí)外源添加NH4+并維持20～30 mmol/L，比a-KG合成速率達(dá)到最大，最高產(chǎn)量達(dá)到49 g/L。因此，溶氧水平能影響細(xì)胞對(duì)NH4+利用速率，從而影響a-KG的積累[31]。

2001年，Il￠chenko等深入研究了溶氧水平對(duì)菌體發(fā)酵產(chǎn)酸的影響，由于菌株因低NH4+引發(fā)檸檬酸積累時(shí)，此時(shí)，發(fā)酵液中的溶氧水平(pO2=5%或 pO2=50%) 的變化不會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的呼吸速率發(fā)生明顯的變化，維持相對(duì)穩(wěn)定的水平。由于硫胺素不足而引起的a-KG過(guò)量積累時(shí)，高溶氧水平 (pO2=50%) 發(fā)酵液中的細(xì)胞內(nèi)的好氧水平要比低溶氧水平 (pO2=5%) 發(fā)酵液中細(xì)胞內(nèi)好氧水平高1.5～2倍，而過(guò)量積累檸檬酸條件下的細(xì)胞內(nèi)呼吸水平要比過(guò)量積累a-KG條件下呼吸水平高2～2.5倍[33]。

與上述研究成果相似，Barth等利用Y.lipolyticaH222及經(jīng)過(guò)代謝工程改造的基因工程菌在發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)時(shí)，根據(jù)菌株生長(zhǎng)-產(chǎn)酸兩階段變化，分階段控制發(fā)酵液中的pH值和溶氧水平，生長(zhǎng)階段維持發(fā)酵液pH 5.0、pO2=50%，在產(chǎn)酸階段將這兩個(gè)參數(shù)分別維持在pH 3.8、pO2=10%，利用菜籽油為底物時(shí)，a-KG的產(chǎn)量高達(dá)134 g/L[25-39]。

3.3 在發(fā)酵液中外源添加輔因子等及控制優(yōu)化

輔因子的生成及細(xì)胞內(nèi)水平是調(diào)節(jié)微生物細(xì)胞代謝的關(guān)鍵參數(shù)，通過(guò)調(diào)節(jié)金屬離子、維生素、AMP/ADP/ATP[40-41]、NADH/NAD+(NADPH/NADP+)[42-44]和輔酶 A 及其衍生物[45]的細(xì)胞內(nèi)水平已經(jīng)實(shí)現(xiàn)多種發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)量提高和生產(chǎn)強(qiáng)度的加大[46]。

2003年，劉立明等利用多重維生素缺陷型的T.glatrabaCCTCC M202019搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸時(shí)，發(fā)現(xiàn)在外源添加 CaCO3調(diào)節(jié)發(fā)酵液中pH 時(shí)，Ca2+能使丙酮酸羧化酶 (Pyruvate carboxylase，PYC) 活性提高40%，從而調(diào)節(jié)碳代謝流流向a-KG，使得a-KG產(chǎn)量提高至15.8 g/L，此時(shí)，添加生物素亦能促進(jìn)T.glatraba積累a-KG[29]。在此基礎(chǔ)上，Huang等對(duì)外源添加的硫胺素和生物素優(yōu)化，不僅提高了a-KG的產(chǎn)量，而且發(fā)酵液中的葡萄糖耗盡后，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間促使前期積累的丙酮酸進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成a-KG[47]。2007年，Liu等利用T.glatrabaCCTCC M202019在7 L發(fā)酵罐中生產(chǎn)a-KG時(shí)，通過(guò)控制發(fā)酵液中的 Ca2+、生物素和硫胺素的含量等控制手段調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的PDHC、KGDHC和PYC的活性，將碳代謝流重新分布，有效地促使碳代謝流從丙酮酸代謝節(jié)點(diǎn)流向三羧酸循環(huán)中a-KG代謝節(jié)點(diǎn)，最終a-KG的產(chǎn)量達(dá)到43.7 g/L[16]。

綜上，在發(fā)酵生產(chǎn)a-KG過(guò)程中，根據(jù)菌體在生長(zhǎng)和產(chǎn)酸階段的生理特點(diǎn)的變化，通過(guò)在生長(zhǎng)階段維持發(fā)酵液中的pH 5.0和pO2=50%，在產(chǎn)酸階段維持發(fā)酵液中的低pH值 (pH 3.8甚至pH 3.0) 和pO2=5%有利于菌體發(fā)酵產(chǎn)酸，在這過(guò)程中維持 20～30 mmol/L的 NH4+有利于菌體積累a-KG減少檸檬酸等代謝副產(chǎn)物的積累。通過(guò)添加 CaCO3調(diào)節(jié)發(fā)酵液 pH值，亦能提高丙酮酸羧化酶活力，增大流向三羧酸循環(huán)的流量。根究菌株生長(zhǎng)需要優(yōu)化添加生物素和硫胺素添加的最優(yōu)量是菌株過(guò)量積累a-KG的重要因素。

4 生產(chǎn)菌株代謝工程改造

目前針對(duì)生產(chǎn)菌株的代謝工程改造的工作主要集中于調(diào)控輔因子再生和中心代謝途徑的改造兩方面。

4.1 調(diào)控輔因子再生

a-KG是微生物三羧酸循環(huán)中重要中間代謝產(chǎn)物，受到乙酰 CoA、NAD+/NADH和NADP+/NADPH等多種輔因子的調(diào)控，所以通過(guò)調(diào)控這些輔因子的再生可直接或者間接調(diào)控a-KG的積累。

2012年，Zhou等在Y.lipolyticaWSH-Z06細(xì)胞中分別過(guò)量表達(dá)來(lái)源于S.cerevisiae的乙酰CoA合成酶編碼基因ScACS1和來(lái)源于小鼠Musmusculus的檸檬酸裂解酶編碼基因MmACL，不僅重組菌株比出發(fā)菌株生長(zhǎng)更旺盛，而且重組菌株細(xì)胞中乙酰 CoA合成酶的活力和乙酰CoA含量大幅提高，經(jīng)過(guò)發(fā)酵優(yōu)化后重組菌株在3 L發(fā)酵罐中積累的a-KG分別提高至52.6 g/L和56.5 g/L，同時(shí)，代謝副產(chǎn)物丙酮酸分別降至25.4 g/L和20.2 g/L[28]。以上例子通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞中乙酰CoA這一輔因子的再生，成功增大了從丙酮酸流向目標(biāo)代謝產(chǎn)物a-KG代謝流，足以說(shuō)明調(diào)控輔因子再生是提高目標(biāo)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)性能的有效手段。

4.2 中心代謝途徑改造

對(duì)目標(biāo)代謝產(chǎn)物的代謝途徑的改造是提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量的最直接的方法，主要包括增大流向目標(biāo)代謝產(chǎn)物的代謝流和削弱目標(biāo)代謝產(chǎn)物的進(jìn)一步代謝消耗兩種途徑。

4.2.1 增大流向目標(biāo)代謝產(chǎn)物的代謝通量“開源”

2007年，F(xiàn)?rster等過(guò)量表達(dá)和敲除異檸檬酸裂解酶編碼基因ICL1，試圖改變Y.lipolyticaH222產(chǎn)酸過(guò)程中檸檬酸/異檸檬酸比例，過(guò)量表達(dá)該編碼基因的重組菌株細(xì)胞內(nèi)的異檸檬酸裂解酶活力提高了 12～15倍，隨后的發(fā)酵試驗(yàn)表明該重組菌株在產(chǎn)酸過(guò)程中，菌株總產(chǎn)酸量不僅沒(méi)有受到影響，而且異檸檬酸占總產(chǎn)酸量的比例由10%～12%降低至3%～6%；ICL1基因敲除的重組菌株，細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)不到異檸檬酸裂解酶的活性，但是異檸檬酸在總產(chǎn)酸中的比例上升了 2%～5%[24]。圍繞該問(wèn)題，Holz等通過(guò)過(guò)量表達(dá)順烏頭酸酶編碼基因ACO1，過(guò)量表達(dá)ACO1的重組菌株細(xì)胞內(nèi)該酶的活性是出發(fā)菌株的 7.6～8.3倍，發(fā)酵試驗(yàn)表明，異檸檬酸占重組菌株發(fā)酵產(chǎn)酸的比例從 35%～49%提高至66%～71%[23]。

Yin等以Y.lipolyticaWSH-Z06為出發(fā)菌株分別過(guò)量表達(dá)來(lái)源于S.cerevisiae和米根霉Rhizopus oryzaePYC編碼基因ScPYC1和RoPYC2提高a-KG產(chǎn)量，降低丙酮酸等代謝副產(chǎn)物的含量，搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，重組菌株在a-KG分別提高了24.5%和35.3%，與此同時(shí)丙酮酸含量降低了51.9%和69.8%，隨后的3 L發(fā)酵罐試驗(yàn)中，經(jīng)過(guò)發(fā)酵優(yōu)化a-KG產(chǎn)量高達(dá)69.2 g/L[27]。與此相對(duì)應(yīng)的是，Otto等試圖在Y.lipolyticaH355菌株中分別過(guò)量表達(dá)延胡索酸酶編碼基因(FUM1)、PYC1改變發(fā)酵產(chǎn)酸過(guò)程中的代謝副產(chǎn)物。過(guò)量表達(dá)FUM1使胞內(nèi)延胡索酸酶水平提高了 27～28倍，同時(shí)延胡索酸、蘋果酸、琥珀酸和丙酮酸等代謝雜酸含量降至原出發(fā)菌株的42%；過(guò)量表達(dá)PYC1使胞內(nèi)PYC的活力提高7倍，但是上述代謝副產(chǎn)物并沒(méi)有下降，與出發(fā)菌株相比，這些副產(chǎn)物的含量提高了 62%；在同時(shí)過(guò)量表達(dá)FUM1和PYC1的重組菌株的細(xì)胞內(nèi)這兩個(gè)酶的活力都上升了，但是這些副產(chǎn)物的含量提高了51%，過(guò)量表達(dá)FUM1降低代謝副產(chǎn)物含量效果被中和[39]。

4.2.2 削弱目標(biāo)代謝產(chǎn)物的進(jìn)一步代謝消耗“節(jié)流”

2009年，Verseck等對(duì)C. glutmicum谷氨酸脫氫酶編碼基因gdh敲除，gdh缺失的重組菌株在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)維持發(fā)酵液中高濃度的NH4+濃度從而抑制谷氨酸合酶和谷氨酰胺合成酶活性，使得發(fā)酵液中a-KG濃度達(dá)到5 g/L[12]。2011年，Holz等以Y.lipolyticaH222為出發(fā)菌株，試圖過(guò)量表達(dá) KGDHC中酮戊二酸脫氫酶編碼基因KGD1、硫辛酸酰基轉(zhuǎn)琥珀酰酶編碼基因KGD2和硫辛酰胺脫氫酶編碼基因LPD1削弱a-KG的代謝消耗，重組菌株細(xì)胞內(nèi)的a-KG脫氫酶的活力是出發(fā)菌株的1.8～2.1倍，在搖瓶中的發(fā)酵試驗(yàn)表明，重組菌株發(fā)酵液中a-KG含量降低，而丙酮酸含量提高[25]。

以上研究結(jié)果表明通過(guò)代謝工程手段能有效地改變細(xì)胞生理特性、提高生產(chǎn)性能和降低代謝副產(chǎn)物，但是通過(guò)分子生物學(xué)操作對(duì)代謝途徑的加強(qiáng)或消弱引起的細(xì)微擾動(dòng)會(huì)被微生物通過(guò)改變代謝途徑等細(xì)胞精細(xì)的調(diào)控手段“中和”，帶有一定盲目性，基于全局考慮的代謝工程改造將是今后研究工作的熱點(diǎn)。

5 展 望

上述研究在代謝積累a-KG機(jī)制、控制優(yōu)化和代謝工程等方面做了大量的工作，取得了很多可喜的成績(jī)，但是還存在著代謝副產(chǎn)物過(guò)多和過(guò)量積累a-KG機(jī)制不清楚等問(wèn)題，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)a-KG還需要在以下3方面做深入研究：1) 圍繞高產(chǎn)菌株發(fā)酵不同階段的代謝特點(diǎn)和生理特點(diǎn)的變化，在不同階段通過(guò)控制環(huán)境中的溶解氧、pH值、碳氮比和輔因子水平等環(huán)境因素，精確控制細(xì)胞內(nèi)的代謝流促使碳代謝流流向a-KG節(jié)點(diǎn)，減少分支代謝流量，減少副產(chǎn)物積累。2) 雖然通過(guò)代謝工程改造增強(qiáng)代謝途徑中上游基因表達(dá)和削弱a-KG下游基因的表達(dá)，能提高a-KG的積累，但是其他生理特性的改變也促使丙酮酸、富馬酸、琥珀酸和蘋果酸等代謝副產(chǎn)物的含量上升，需要從全局代謝網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)出發(fā)，尋找更為有效的代謝工程改造位點(diǎn)。3) 細(xì)胞內(nèi)a-KG水平是表征細(xì)胞內(nèi)碳氮代謝平衡水平，利用蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)等組學(xué)研究對(duì)生產(chǎn)菌株過(guò)量積累a-KG機(jī)理進(jìn)行系統(tǒng)的研究，特別是深入理解細(xì)胞內(nèi)碳氮代謝平衡，為挖掘潛在的代謝工程改造位點(diǎn)提供指導(dǎo)。通過(guò)后續(xù)研究提高a-KG產(chǎn)量，減少細(xì)胞向發(fā)酵液中分泌代謝副產(chǎn)物，減少后續(xù)分離成本，實(shí)現(xiàn)工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)。

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October 4, 2012; Accepted: November 26, 2012

Jingwen Zhou. Tel: +86-510-85918312; Fax:+86-510-85918309; E-mail: zhoujw1982@gmail.com

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 31171638, 21276109) 資助。

Progress in microbial production of α-ketoglutarate

Hongwei Guo1, Guocheng Du1,2, Jingwen Zhou1,2, and Jian Chen1,2

1Key Laboratory of Industrial Biotechnology of Ministry of Education,School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi214122,Jiangsu,China
2National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology,Jiangnan University,Wuxi214122,Jiangsu,China

a-ketogluratate is one of the key intermediates in the TCA cycle, playing an important role in the connection of carbon and nitrogen metabolism. This article aims at stating recent research progress in the production of a-ketoglutarate by microbial fermentation. First, a large group of microbes have been screened to accumulate a-ketoglutarate including prokaryotes and eukaryotes. Second, physiological characterization of over-accumulation of a-ketoglutarate is caused by thiamine defect and nitrogen starvation. Third, the process of fermentation was controlled and optimized by the manipulation of pH, dissolved oxygen and cofactors. Fourth, many metabolic engineering strategies were also presented fora-ketoglutarate production focusing on regeneration of cofactor and manipulation of the pathway. Last, we discussed the limitation of current progress and proposed the future research needs for microbial production of a-ketoglutarate.

a-ketoglutarate, production by fermentation, screening of organisms for over-accumulating a-ketoglutarate,optimization and regulation, metabolic modification

Supported by: National Natural Science Foundation of China (Nos. 31171638, 21276109).

(本文責(zé)編 陳宏宇)