韭菜提取液體外抑菌活性的均勻?qū)嶒瀮?yōu)化

韓亞偉，左婷婷，陳利平，王志勇

（1.鄭州輕工業(yè)學(xué)院，河南鄭州 450002；2.機(jī)械工業(yè)第六設(shè)計院，河南鄭州 450007）

韭菜（Allium Tuberoum）為百合科蔥屬多年生草本植物，又名起陽草、壯陽草，主要以葉片、假莖供食，是我國特有的蔬菜之一[1]。其種植資源豐富，價廉易得，全國各地皆產(chǎn)，以河北、山西、吉林、江蘇、山東、安徽和河南等地產(chǎn)量最大[2]。韭菜味道鮮美，富含營養(yǎng)，除含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物，還含有豐富的胡蘿卜素、VC以及微量元素，其中Fe、Mn和Zn含量較高[3]，兼具主菜及調(diào)味功能，是宴席上常見的美味[4]。韭菜不僅營養(yǎng)價值高，而且具有多方面的藥用功能，其葉、根、籽均可入藥?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，韭菜含揮發(fā)性精油有特殊辛香有助于疏調(diào)肝氣，促進(jìn)食欲；韭菜含有豐富的纖維素，可以促進(jìn)腸道蠕動、預(yù)防大腸癌的發(fā)生，同時又能減少對膽固醇的吸收，從而起到預(yù)防和治療動脈硬化、冠心病等疾病的作用[5]；韭菜可治療跌打損傷，有消炎止痛，散瘀止血的功效[6]。此外，韭菜籽具有“溫補肝腎，壯陽固精”功效[7]。由于韭菜分布范圍較窄，因此國際上也少有其相關(guān)的研究報道[8]。從目前的文獻(xiàn)資料來看，國內(nèi)對韭菜的研究還剛剛起步，其深入的程度和廣度遠(yuǎn)遠(yuǎn)比不上其他蔬菜。有關(guān)韭菜的報道主要是研究栽培技術(shù)及食療方面[1]。也有學(xué)者對韭菜進(jìn)行了抗植物病原菌的研究[9]，但對人體致病菌的抑制作用，則很少見報道。本文通過單因素實驗和均勻?qū)嶒瀬碓u價和優(yōu)化韭菜提取液對一些常見致病菌的體外抑制作用，為韭菜更深入的研究提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮韭菜（平豐8號）平頂山農(nóng)科院提供；大腸桿菌（Escherichia coli），枯草桿菌（Bacillus subtilis），金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）。

LDZM－50（60KCS）型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；QYC－2102C型恒溫振蕩培養(yǎng)箱上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司；JJ－2型組織搗碎勻漿機(jī) 江蘇中大儀器廠；BR4i型多功能離心機(jī) 美國Thermo公司；SW－CJ－1F型單人雙面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；HH－2數(shù)型顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；PB－10型pH計 德國Sartorius公司；DNP－9162BS－Ⅲ型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的活化及菌懸液的制備 將供試菌從斜面上接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37℃、200r/min條件下恒溫振蕩培養(yǎng)12h，再用無菌的生理鹽水將菌液稀釋至107～108cfu/mL。振蕩均勻后備用。

1.2.2 韭菜提取液的制備 采用直接壓榨法制備韭菜提取液。其基本流程為：新鮮韭菜200g→自來水沖洗數(shù)次→75%乙醇表面消毒→無菌水沖洗數(shù)次→加入100mL無菌水壓榨→8層無菌紗布過濾→9000r/min離心10min→取上清液，4℃放置備用（相當(dāng)于干物質(zhì)濃度2g/mL）。

1.2.3 體外抑菌實驗

1.2.3.1 濃度對體外抑菌實驗的影響 二倍稀釋法用無菌水將韭菜提取液稀釋成5個不同的濃度梯度，即2、1、0.5、0.25、0.125g/mL。無菌移液槍吸取100μL上述菌懸液加入到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，并用無菌涂布棒將菌液涂布均勻。待平板表面干燥后，用無菌鑷子放置5個已滅菌的牛津杯。其中3個各加入100μL同一濃度的韭菜提取液，作為3個平行。另外兩個分別加入100μL無菌水作為陰性對照、100μL 10mg/mL氨芐青霉素作為陽性對照。上述操作完成后，將平板于超凈工作臺中靜置20min后，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，以十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.3.2 溫度對體外抑菌實驗的影響 將2g/mL的韭菜提取液分別置于40、60、80、90、100℃的恒溫水浴鍋中處理20min后備用[10]。另取部分韭菜提取液于121℃高壓蒸汽滅菌20min后備用。無菌移液槍吸取100μL上述菌懸液加入到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，并用無菌涂布棒將菌液涂布均勻。待平板表面干燥后，用無菌鑷子放置4個已滅菌的牛津杯。其中3個各加入100μL同一溫度處理的韭菜提取液，為3個平行。另外一個加入100μL常溫下提取的未處理的韭菜原提取液作為對照。上述操作完成后，將平板于超凈工作臺中靜置20min后，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，以十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.3.3 pH對體外抑菌實驗的影響 用2mol/L的HCl和2mol/L NaOH分別將常溫下提取的韭菜原提取液的pH調(diào)整為3、4、5、6、7、8、9、10，并于4℃條件下放置備用。無菌移液槍吸取100μL的上述菌懸液加入到營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，并用無菌涂布棒將菌液涂布均勻。待平板表面干燥后，用無菌鑷子放置4個已滅菌的牛津杯。其中3個各加入100μL相同pH的韭菜提取液，作為3個平行對照。另外一個加入100μL未處理的韭菜原提取液作為對照。上述操作完成后，將平板于超凈工作臺中靜置20min后，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，以十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行單因素的方差分析，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間差異用Duncan檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 不同濃度的韭菜提取液對供試菌的抑制效果如表1所示，韭菜提取液對3種供試菌抑菌圈的大小隨濃度的增加而逐漸增大。當(dāng)韭菜提取液的濃度增加到2g/mL時，其對大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別達(dá)到了21.2、22.5、27.7mm，且對大腸桿菌和枯草桿菌的抑制作用與10mg/mL的氨芐青霉素陽性對照相接近。這一結(jié)果表明，韭菜提取液的濃度與其抑菌活性呈正相關(guān)，即濃度越大，抑菌圈直徑越大，抑菌活性就越強，且這種影響是顯著的。濃度（g/mL）抑菌圈直徑（mm）大腸桿菌 枯草桿菌 金黃色葡萄球菌

表1 不同濃度的韭菜提取液對供試菌的抑制效果Table 1 Effects of concentration on the tested bacteria of Chinese chives extract

2.1.2 不同溫度的韭菜提取液對供試菌的抑制效果

如表2所示，100℃以下的韭菜原提取液（2g/mL）對3種供試菌均有一定的抑制作用，且在80℃時抑菌效果最好。對同種菌而言，當(dāng)韭菜提取液溫度在40℃和60℃時，抑菌圈大小變化不明顯；而溫度上升到80℃時，抑菌作用有所增強。當(dāng)溫度上升到80℃以上時，抑菌圈直徑則隨著溫度的上升而逐漸減小，至121℃時，韭菜提取液對3種供試菌已無抑制作用，抑菌圈直徑顯示為牛津杯的外徑。這種現(xiàn)象表明韭菜提取液中的抑菌物質(zhì)具有一定的熱穩(wěn)定性，但當(dāng)溫度過高時，將會破壞抑菌物質(zhì)的活性，使其抑制作用減弱甚至消失。這一結(jié)論與Hsieh等的研究結(jié)果相一致[11]。

表2 不同溫度的韭菜提取液對供試菌的抑制效果（mm）Table 2 Effects of temperature on the tested bacteria of Chinese chives extract

2.1.3 不同pH的韭菜提取液對供試菌的抑制效果

如表3所示，不同pH的韭菜提取液對3種測試菌均有不同程度的抑制作用，且當(dāng)pH為6時抑菌效果最好。對于同種菌，當(dāng)pH低于6時，抑菌圈直徑隨pH的增大而先減小后增大；pH上升到6以上時，抑菌圈直徑隨pH的增大而逐漸減小，抑菌作用逐漸減弱；相同pH的韭菜提取液對金黃色葡萄球菌的抑制效果明顯強于大腸桿菌、枯草桿菌。

表3 不同pH的韭菜提取液對供試菌的抑制效果（mm）Table 3 Effects of pH on the tested bacteria of Chinese chives extract

2.2 均勻?qū)嶒?/h3>

2.2.1 均勻?qū)嶒炓蛩厮皆O(shè)計 綜合上述單因素實驗結(jié)果，以抑菌圈直徑作為檢測指標(biāo)，采用3因素8水平8組實驗的方式設(shè)計U8（83）[12]均勻?qū)嶒灡恚疾炝司虏颂崛∫旱臐舛龋╔1）、溫度（X2）、pH（X3）對體外抑菌活性的影響。因素水平如表4所示。

表4 U8（83）均勻?qū)嶒炘O(shè)計因素水平表Table 4 U8（83）table of uniform design

2.2.2 均勻?qū)嶒灲Y(jié)果 根據(jù)均勻?qū)嶒灡?，分別在相應(yīng)條件下進(jìn)行體外抑菌實驗并得到抑菌圈直徑，實驗結(jié)果如表5所示。

2.2.3 軟件分析 以金黃色葡萄球菌為例，采用Mathematics 4.0軟件對均勻?qū)嶒灲Y(jié)果進(jìn)行分析，得到如下結(jié)果：

表5 均勻?qū)嶒灲Y(jié)果Table 5 Results of uniform design

表6 參數(shù)表Table 6 Parameter table

采用Mathematics 4.0軟件對均勻?qū)嶒灲Y(jié)果進(jìn)行分析，1代表回歸方程中的常數(shù)項，復(fù)確定系數(shù)R2為0.962448，調(diào)整后為0.737138，估計方差為3.86313。方差分析表如表7所示。

表7 方差分析表Table 7 Analysis of variance table

按一元線性回歸分析，得到三個因素的影響都不顯著，因此考慮將影響最不顯著的因素（X3，即pH）刪去。然后繼續(xù)進(jìn)行回歸分析得到如下方程：Y（抑菌直徑）=-52.73+11.33X1+1.95X2-0.012+1.77X1X3-0.24X1X2-0.068。3個因素對韭菜提取液體外抑菌活性的影響主次順序是：X2（溫度）＞X1（濃度）＞X3（pH）。在測試條件范圍內(nèi)，經(jīng)過計算后最佳優(yōu)化條件為：濃度0.5g/mL，溫度80℃，pH為4時，韭菜提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強，抑菌圈直徑達(dá)到了25.0mm。經(jīng)實驗驗證在此優(yōu)化條件下得到的韭菜提取液對金黃色葡萄球菌的抑菌圈為22.4mm，與理論值的相對誤差2.6mm，且遠(yuǎn)超過各實驗值。說明均勻?qū)嶒瀮?yōu)化后的最優(yōu)條件組合制備的韭菜提取液具有最強的抑菌活性，優(yōu)化結(jié)果可靠。

3 結(jié)論

本實驗采用牛津杯法對韭菜提取液的體外抑菌效果進(jìn)行了初步探索，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)濃度在0.25g/mL以上時，韭菜提取液對常見革蘭氏陽性菌枯草桿菌、金黃色葡萄球菌以及革蘭氏陰性菌大腸桿菌均有明顯的抑制效果。不同條件處理得到的韭菜提取液具有不同的抑菌活性。單因素實驗表明，韭菜提取液的濃度與抑菌活性呈正相關(guān)；80℃時的韭菜提取液對供試菌的抑制效果最好，而121℃處理后的韭菜提取液，由于高溫失去了抑菌活性；酸性條件對韭菜提取液的影響不大，但在堿性范圍內(nèi)，抑菌活性則隨著pH的增大而逐漸減弱，這可能是堿性環(huán)境破壞了韭菜提取液中抑菌成分的活性；同樣條件下的韭菜提取液對金黃色葡萄球菌的抑制效果明顯好于大腸桿菌、枯草桿菌，對其他兩種菌的抑制作用則相差不大。均勻?qū)嶒灡砻?，以金黃色葡萄球菌為例進(jìn)行回歸分析，得到最佳優(yōu)化條件為：濃度0.5g/mL，溫度80℃，pH為4。此條件下處理的韭菜提取液，體外抑菌活性得到了明顯增強。

以10mg/mL的氨芐青霉素作為陽性對照，發(fā)現(xiàn)2g/mL的韭菜提取液對大腸桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為氨芐青霉素的78.52%、80.36%、65.95%。由此可見，韭菜提取液的抑菌效果已經(jīng)很明顯。而作為陰性對照的無菌水對供試菌則無抑制作用。近年來，由于抗生素的亂用與濫用，造成許多細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥菌株，并且其出現(xiàn)的頻率已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過抗生素的研發(fā)速度，這給疾病的治療帶來了很大的難度[13]。研究發(fā)現(xiàn)，韭菜提取液中存在豐富的天然活性物質(zhì)，且具有明顯的抑菌效果。與抗生素相比，它具有綠色、安全、不存在令細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)勢。但由于韭菜提取液的抑菌活性成分尚不清楚，因此有關(guān)活性物質(zhì)的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定、抑菌機(jī)制有待進(jìn)一步深入系統(tǒng)地研究，以期為開發(fā)韭菜資源在醫(yī)藥、食品、保健方面的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

[1]李雪雁，陳海強.韭菜中提取類胡蘿卜素[J].食品研究與開發(fā)展，2009（10）：86.

[2]劉建濤，趙利.韭菜中生物活性成分及其分子生物學(xué)的研究進(jìn)展[J].食品科技，2006（8）：69.

[3]張玲，時延增，徐新剛.韭菜籽中氧基酸及微量元素分析[J].時珍國藥研究，1999，7（1）：21.

[4]王永成，時軍.韭菜籽提取物的溫腎助陽作用[J].中國中藥雜志，2005，30（13）：1017-1018.

[5]吳莉，張平.氣-質(zhì)聯(lián)用法檢測韭菜中香味成分的研究[J].廣東化工，2005（7）：67-68.

[6]婁衛(wèi)東，段大航，孫丕東.韭菜提取物及藥用研究現(xiàn)狀[J].中國民康醫(yī)學(xué)，2007，80（19）：671.

[7]中華人民共和國藥典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

[8]高新蕾，吳莉.韭菜中辛香味成分的分析、合成及微膠囊化[J].中國調(diào)味品，2004（6）：18-20.

[9]蔣繼志，史娟，趙麗坤，等.植物提取物對棉鈴蟲生長發(fā)育的影響[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，24（6）：99-102.

[10]Hsieh P C，Mau J L，Huang S H.Antimicrobial effect of various combinations of plant extracts[J].Food Microbiology，2001（18）：35-43.

[11]Chen C P，Hsieh P C.Development and characterization of the natural antimicrobials[J].Agricultural and Food Chemistry，1998，49（1）：183-188.

[12]潘麗軍，章銀良.實驗設(shè)計與數(shù)據(jù)處理[M].南京：東南大學(xué)出版社，2008.

[13]扈瑞平，敖長金，杜玲，等.沙蔥多糖的體外抑菌實驗研究[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報，2011，42（3）：299.