超高壓處理對海參體壁粗酶活性的影響

郝夢甄，胡志和，肖學勇

（天津市食品生物技術(shù)重點實驗室，天津商業(yè)大學生物技術(shù)與食品科學學院，天津300134）

海參（Stichopus Japonicus）又名刺參、沙哩等，棘皮動物門，海參綱，是重要的海洋無脊椎動物，已有5000萬年歷史，種類有1200多種。我國海參主要分布在黃海、渤海海域和廣東、廣西及海南沿海，主要經(jīng)濟品種分別為刺參和梅花參，其中刺參是我國品質(zhì)最好的海參種類之一[1]。研究證明，海參體壁中含有海參多糖、海參皂苷、海參膠原蛋白、海參腦苷酯、神經(jīng)節(jié)苷酯等多種生物活性物質(zhì)[2]，具有提高免疫功能、抗腫瘤、抗凝血、抗血栓、降血脂、抗衰老等多種生理功效[3－5]。目前海參的傳統(tǒng)加工方法主要是將鮮海參制作成干參或鹽漬參[6]，大量的活性成分在加工過程中流失，但鮮海參因其自溶酶的作用很難在常溫下保存，組織蛋白酶B（Cathepsin B，CB）是一種溶酶體半胱氨酸蛋白水解酶，對肌肉蛋白質(zhì)有廣泛的降解作用[7]。因此鮮海參保藏問題亟需解決。超高壓技術(shù)（ultra high－pressure，UHP）是一種新型的非熱殺菌技術(shù)，起源于化工領(lǐng)域，能有效殺滅食品中的微生物[8－10]，保留有效功能成分和芳香物質(zhì)，并且在一定壓力范圍能有效抑制食品中的酶類[11－13]。由于酶的化學本質(zhì)是蛋白質(zhì)，其生物活性與其三維結(jié)構(gòu)有關(guān)，酶的生物活性產(chǎn)生于活性中心，活性中心是由分子的三維結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的[14]。蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)的改變與體積變化有關(guān)，而超高壓有利于體積減小的反應發(fā)生，因此酶活會受到高壓的影響。每種酶都存在最低失活壓力，低于這個壓力酶就不會失活，在特定時間內(nèi)當壓力超過這個值時酶失活速度會加速直到完全失活[15]。Ludikhuyze等[16-17]對超高壓下的動力學研究得出，各類酶的超高壓滅活酶模型主要符合一級反應動力學模型（A=A0e-kt）。恒溫恒壓條件下K的獲得都采用Eyring理論和Arrhenius理論[18]。目前超高壓的應用主要用于果蔬汁的冷殺菌以及肉類、水產(chǎn)的殺菌及保藏中，為了探索超高壓技術(shù)在鮮海參加工中的應用，本實驗研究了超高壓技術(shù)對從海參體壁中提取的粗酶酶活的影響，為鮮海參的超高壓加工提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮海參 購于煙臺鮑參堂；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硫酸銨（均為分析純） 天津市凱通化學試劑有限公司；干酪素（化學純）天津市東方衛(wèi)生材料廠；氫氧化鈉、碳酸鈉（分析純）天津市北方天醫(yī)化學試劑廠；三氯乙酸（分析純）天津市科密歐化學試劑有限公司；酪氨酸 美國Sigma公司；Folin-Phenol 喜潤（上海）生化試劑有限公司。

HPP.L3-600/0.6超高壓生物處理機 天津市華泰森森生物工程技術(shù)有限公司；FA1104N電子天平上海精密科學儀器公司；JJ-2（2003-61）組織搗碎勻漿機 常州國華電器有限公司；sigma 3-18k離心機北京博勱行儀器有限公司；電熱恒溫水槽 上海精宏實驗設(shè)備有限公司；VELP旋渦振蕩器 北京盈盛恒泰科技有限責任公司；TU-1810紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；Scientz-50N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司

1.2 實驗方法

1.2.1 海參體壁粗酶的提取 參考朱蓓薇[19]的研究方法稍作改進，新鮮海參去內(nèi)臟后用去離子水沖洗干凈，經(jīng)組織搗碎勻漿機搗碎的海參肉25g加入0.1mol/L pH6.3的磷酸緩沖液（PBS）75mL浸提，即質(zhì)量體積比1∶3。4℃下靜置過夜后8000r/min離心10min，收集上清液，加入（NH4）2SO4至20%飽和度，4℃靜置4h，8000r/min離心10min。棄沉淀，上清液繼續(xù)加入至70%飽和度，4℃靜置4h，8000r/min離心10min。沉淀經(jīng)冷凍干燥后，4℃保存。

1.2.2 超高壓處理 取1g干酶粉末加入0.1mol/L的磷酸緩沖液（pH=6.3）6mL溶解，取粗酶液裝于真空密封袋中，真空密封后進行超高壓處理，每組樣品做三次平行。單因素處理條件為：室溫（15℃）在壓力分別為0、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600MPa下處理10min；室溫下300MPa分別處理0、10、15、20、25、30、35、40min；分別在溫度15、20、30、40、45、50℃下300MPa處理10min。

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，設(shè)計正交實驗，因素及水平見表1。

表1 超高壓抑制海參體壁粗酶的正交實驗因素及水平Table 1 Factors and levels for orthogonal test of the inhibiting enzyme from Stichopus Japonicus body wall with UHP

通過正交實驗獲得超高壓抑制海參體壁粗酶酶活的最優(yōu)處理條件后，在此條件下對鮮海參進行超高壓處理，并按照方法1.2.3進行粗酶提取后進行酶活測定。

1.2.3 酶活測定 按照SB/T10317-1999蛋白酶活力測定方法進行測定，紫外可見分光光度計測定波長為660nm。粗酶活力按式（1）計算。

式中：C為根據(jù)樣品測得OD值，查標準曲線得相當?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)；4為4mL反應液取出1mL測定（即4倍）；N為酶液稀釋的倍數(shù)（6倍）；10為反應10min；W為樣品水分百分含量（0%）。

根據(jù)標準配制酪氨酸標準溶液后在660nm下進行吸光值測定，以未處理樣品的酶活力為100%，處理后樣品的酶活力與未處理樣品酶活力的比值為酶活殘存率，按式（2）計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪氨酸標準曲線

標準曲線測定結(jié)果如圖1所示。

圖1 酪氨酸標準曲線Fig.1 The standard curve of tyrosine solution

由圖1可知，酪氨酸濃度增大，光密度增加，并呈線性關(guān)系，通過線性回歸分析可得回歸方程：y=0.0132x+0.0227，R2=0.9978。

2.2 超高壓處理對海參體壁粗酶活性的影響

2.2.1 超高壓處理壓力對海參體壁粗酶活性的影響

壓力大小對海參體壁粗酶活性的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 15℃下不同壓力處理10min對海參體壁粗酶活性的影響Fig.2 Effect of different pressure treatment on the enzyme activity of Stichopus Japonicus body wall for 10min at 15℃

由圖2可以看出，在較低壓力范圍內(nèi)，隨著壓力的升高，海參體壁粗酶的酶活逐漸升高，250MPa處理時，酶活殘存率最高為100.78%，未處理的鮮海參體壁粗酶酶活為100.6U，250MPa下處理后酶活為101.38U，這與夏遠景[20]的實驗結(jié)果有差異，可能與實驗材料本身特性有關(guān)。250MPa時的酶活殘存率大于100%，說明超高壓改變了海參體壁粗酶的原有結(jié)構(gòu)，使其更易與底物酪蛋白反應。隨著壓力逐漸升高，海參體壁粗酶的酶活逐漸降低，酶活受到明顯抑制，600MPa時，酶活為24.37U，酶活殘存率最低為24.22%，說明超高壓處理能夠有效抑制海參體壁粗酶的酶活力。

2.2.2 超高壓處理時間對海參體壁粗酶活性的影響

處理時間對海參體壁粗酶活性的影響的結(jié)果如圖3所示。

圖3 15℃下300MPa處理不同時間對海參體壁粗酶活性的影響Fig.3 Effect of different pressure treating time with 300 MPa at 15℃on the enzyme activity of the Stichopus Japonicus body wall

從圖3可以看出，常溫下隨著超高壓處理時間的延長，海參粗酶酶活先降后升再降，在處理15min時，酶活殘存率存在最大值，為77.02%；15min后隨著時間的延長，酶活逐漸受到抑制而降低，超高壓處理40min時，酶活殘存率最低，為36.76%。本實驗說明隨著處理時間的延長，海參體壁粗酶酶活將會受到有效抑制。

2.2.3 超高壓處理溫度對海參體壁粗酶活性的影響

處理溫度對海參體壁粗酶活性的影響的結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同溫度下300MPa處理10min對海參體壁粗酶活性的影響Fig.4 Effect of different temperature with 300MPa for 10min on the enzyme activity of the Stichopus Japonicus body wall

由圖4可以明顯看出，超高壓處理在一定溫度范圍內(nèi)，海參體壁粗酶酶活殘存率有升高的趨勢，在海參體壁粗酶反應最適溫度40℃時，酶活殘存率最高為83.45%；溫度高于40℃后，隨著溫度的升高，海參體壁粗酶酶活明顯降低，50℃時最低為52.42%；說明在溫度高于40℃時，升高超高壓處理的溫度能夠有效抑制海參體壁粗酶酶活力。

2.2.4 超高壓處理對海參體壁粗酶活性的正交分析結(jié)果 由表3對超高壓處理海參體壁粗酶的正交實驗方差分析可以看出，超高壓處理的壓力、時間和溫度三因素均對粗酶殘存率影響顯著，結(jié)合正交實驗的極差分析可以得出，在實驗設(shè)定的條件范圍內(nèi)，使酶活殘存率最低的條件即超高壓處理的最優(yōu)條件壓力為600MPa、時間為35min、溫度為45℃。經(jīng)實驗驗證在該條件下處理的海參體壁粗酶酶活殘存率為19.11%，結(jié)果優(yōu)于表2中的數(shù)值。

表2 L9（34）正交實驗結(jié)果Table 2 Experimental design and results for L9（34）orthogonal test

表3 正交實驗結(jié)果方差分析表Table 3 Variance analysis for orthogonal array experimental results

2.2.5 超高壓處理對鮮海參中粗酶的影響 在45℃下，600MPa處理35min條件下，利用超高壓直接處理鮮海參后進行體壁粗酶提取并測定酶活，酶活殘存率為28.43%，結(jié)果比驗證實驗中超高壓直接作用于粗酶液的殘存率值19.11%高，說明海參體壁組織對其中的粗酶有保護作用。

3 討論與結(jié)論

目前，對海參體壁中粗酶組成成分的研究不是很深入，杜英等[21]從海參腸及海參體壁中提取了海參乙酰膽堿酯酶粗酶并對其酶學性質(zhì)進行了研究，發(fā)現(xiàn)其最適反應pH為8.0，最適反應溫度為35℃左右，與海參自溶的一種重要的酶是海參體壁組織蛋白酶B。Turk等[22]研究發(fā)現(xiàn)組織蛋白酶B是能直接或間接地激活細胞凋亡的主要蛋白酶，與細胞凋亡關(guān)系密切。趙露露等[23]已從海參體壁中提取了海參體壁組織蛋白酶B，并對其酶學性質(zhì)進行了研究，發(fā)現(xiàn)其最適反應pH為5.5，最適反應溫度為40℃。以上兩種酶的最適反應pH及最適反應溫度與本實驗的粗酶系有所差距，說明酶單獨作用與綜合作用條件不一致。

本實驗通過研究可知，在較高的處理條件下超高壓對海參體壁粗酶酶活抑制效果明顯，并通過正交實驗獲得超高壓處理抑制海參體壁粗酶酶活的最優(yōu)條件為壓力600MPa，時間35min，溫度45℃，實驗驗證海參體壁粗酶酶活殘存率結(jié)果為19.11%，并且在此條件下測得超高壓直接作用鮮海參的體壁粗酶酶活殘存率也僅為28.43%，充分說明了超高壓處理能夠有效抑制酶活力，這為超高壓處理在海產(chǎn)品中廣泛應用提供了一定理論依據(jù)。

[1]李銀塔，李鈺金，陳英鄉(xiāng)，等.即食鮮海參生產(chǎn)工藝研究[J].肉類研究，2010（6）：78-81.

[2]宋迪，吉愛國，梁浩，等.刺參生物活性物質(zhì)的研究進展[J].中國生化藥物雜志，2006，27（5）：316-319.

[3]謝永玲，張明月，張靜，等.海參肽對小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用[J].中國海洋藥物雜志，2009，28（4）：43-45.

[4]高森，王靜鳳，王玉明，等.冰島刺參調(diào)節(jié)血脂及其作用機制[J].武漢大學學報：理學版，2009，55（3）：324-328.

[5]逄龍，王靜鳳，王玉明，等.北極刺參多糖、皂苷和膠原蛋白多肽對血管內(nèi)皮細胞的保護作用[J].中國藥科大學學報，2007，38（5）：437-441.

[6]段續(xù)，王輝，任廣躍，等.海參的干制技術(shù)及其研究進展[J].食品工業(yè)科技，2012，33（10）：427-431.

[7]趙露露，董秀萍，于蕾，等.海參體壁組織蛋白酶B酶學性質(zhì)的研究[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（8）：5-9.

[8]徐夏旸，張甫生，陳芳，等.超高壓殺菌白蘿卜汁的關(guān)鍵工藝研究[J].食品科學，2012，33（4）：8-12.

[9]LOPEZ-CABALLERO M E，PEREZ M M，BORDERIAS J，et al.Extension of shelf-life of prawns（Penaeus japonicus）by vacuum packaging and high-pressure treatment[J].Journal of Food Protection，2000，63（10）：1381-1388.

[10]KURAL A G，CHEN H.Conditions for a 5-log reduction of Vibrio vulnificus in oysters through high hydrostatic pressure treatment[J].International Journal of Food Microbiology，2008，122：180-187.

[11]曾慶梅，潘見，謝慧明，等.超高壓處理對多酚氧化酶活性的影響[J].高壓物理學報，2004，18（2）：144-148.

[12]陳賀慶，潘思軼，王可興.超高壓處理對鮮橙汁中果膠酶及過氧化物酶活性的影響[J].食品科學，2011，32（15）：54-57.

[13]CAMPUS M，ADDIS M F，CAPPUCCINELLI R，et al.Stress relaxation behaviour and structural changes of muscle tissues fromGilthead Sea Bream（Sparus aurata L.）following high pressure treatment[J].Journal of Food Engineering，2010，96：192-198.

[14]林淑英，孔保華.超高壓對食品中的酶的影響[J].食品與機械，1999（5）：30-31.

[15]HENDRICKX M，LUDIKHUYZE L，VANDENBROCAK I，et al.Effect of High Pressure on Enzymes Related to Food Quality[J].Food Science and Technology，1998（9）：197-203.

[16]LUDIKHUYZE L， INDRAWATI， BROECK I V D， et al.Effect of Combined pressure and temperature on soybean lipoxygense.Influence of extrinsic and intrinsic factors on isobaricisothermal inactivation kinetics[J].J Agric Food Chem，1998，46（10）：4074-4080.

[17]BROECK I V D，LUDIKHUYZE L R，LOEY A M V，et al.Inactivation of orange pectinesterase by combined high-pressure and temperature treatments：a kinetic study[J].J Agric Food Chem，2000，48（5）：1960-1970.

[18]勵建榮，俞堅.超高壓對酶活的影響[J].食品科技，2006（9）：18-20.

[19]朱蓓薇，韓冰.海參自溶酶的分離純化和部分性質(zhì)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30（4）：132-137.

[20]夏遠景，劉志軍，李寧，等.超高壓處理對海參自溶酶活性影響的研究[J].高壓物理學報，2009，23（5）：377-383.

[21]杜英，朱蓓薇，吳海濤，等.海參乙酰膽堿酯酶的酶學特性研究[J].食品與機械，2011，27（2）：8-12.

[22]TURK B，TURK D，TURK V.Lysosomal cysteine proteases：more than scavengers[J].Biochimica et Biophysica Acta，2000，1477：98-111.

[23]趙露露，董秀萍，于蕾，等.海參體壁組織蛋白酶B酶學性質(zhì)的研究[J].食品研究與開發(fā)，2008，29（8）：5-9.