高效液相色譜法同時測定綠原酸及其五種主要代謝產(chǎn)物

羅曉燕，吳九九，溫艷梅，阮 征，駱成堯，周 艷，蔡力創(chuàng)，劉文群，印遇龍

（1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌330031；2.江西省科學(xué)院生物資源研究所，江西南昌330029；3.江西省科學(xué)院計算機(jī)信息中心，江西南昌330029）

多酚在日常食物中含量豐富，具有多種生物活性，目前對多酚的研究已成為食品和營養(yǎng)領(lǐng)域的研究熱點[1-3]。綠原酸屬于廣泛存在于葵花籽、咖啡豆、杜仲等植物中的一類酚酸，其中在咖啡豆中的含量占了2%～8%[4-6]。Cho等[7]表明綠原酸能改善小鼠體重，調(diào)節(jié)脂肪代謝和肥胖相關(guān)的激素水平。史秀玲等[8]發(fā)現(xiàn)綠原酸對四氯化碳所致的小鼠肝損傷具有保護(hù)作用。Chagas-Paula等[9]表明腫柄菊中的綠原酸具有很好的抗炎效果。綠原酸在微生物作用下的代謝產(chǎn)物與其生物活性的發(fā)揮密切相關(guān)。研究表明，綠原酸不易被胃腸的消化液消化，在小腸的吸收率低，大部分進(jìn)入結(jié)腸被微生物降解[10-12]。Gonthier等[13]通過高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法檢測綠原酸在小鼠體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其代謝物主要有咖啡酸、阿魏酸、m-香豆酸、苯甲酸、馬尿酸、3-羥基苯丙酸等。Monteiro等[14]采用高效液相色譜（High performance liquid chromatography，HPLC）法測定咖啡豆中綠原酸在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，主要有咖啡酸、阿魏酸、p-香豆酸、香草酸等。目前，綠原酸及其他酚酸的測定的方法主要有紫外-可見分光光度法、高效液相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MSn）法等[15-19]，分光光度法測有相同發(fā)色團(tuán)的總含量，而不是單一成分的含量，有時測定結(jié)果可作參考。HPLC－MSn法雖然快速、準(zhǔn)確，但預(yù)處理復(fù)雜，分析成本高。因此需要建立一種操作簡單、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好的方法檢測綠原酸及其主要代謝產(chǎn)物，HPLC法是一種較好的選擇。本實驗建立了一次性檢測綠原酸及其5種主要的代謝產(chǎn)物（咖啡酸、阿魏酸、p－香豆酸、3－羥基苯丙酸及馬尿酸）HPLC法，為綠原酸的代謝及其進(jìn)一步的研究提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠原酸、咖啡酸、阿魏酸、p－香豆酸、3－羥基苯丙酸及馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品 色譜純，純度≥98%，貴州迪大科技有限公司；水 實驗室自制雙蒸水；甲醇 色譜純；冰醋酸 分析純。

Agilent 1200高效液相色譜儀 配有紫外檢測器，美國安捷倫公司；SC－3614低速離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；AL104分析天平 梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；5418R冷凍離心機(jī)德國艾本德公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：美國Agilent Eclipse XDB－C18（250mm×4.6mm，5μm）聯(lián)合Eclipse XDB－C18（20mm×4.0mm，5μm）保護(hù)柱；流動相：甲醇（A）和體積分?jǐn)?shù)1%的冰醋酸水溶液（B），采用梯度洗脫程序：0～5min，A 100%～50%；5～10min，A 50%～30%；10～15min，A 30%～0%；15～17min，A 0%～100%；檢測波長：0～10min，320nm；18～19min，253nm；19～24min，320nm；流速：1mL/min；柱溫：25℃。

1.3 糞便懸浮液的制備

取大鼠新鮮糞便按1∶5（m/v）的比例加入生理鹽水，加入玻璃珠振蕩5min，讓糞便與生理鹽水充分混勻后用4層紗布過濾去渣，制成糞便懸浮液，然后將糞便懸浮液在121℃下高溫滅菌20min，待冷卻后置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精確稱取一定量的綠原酸、咖啡酸、3－羥基苯丙酸、p－香豆酸、阿魏酸和馬尿酸標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于制備好的20mL糞便懸浮液，分別配制成濃度為450、300、100、312、100、135mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)需要將此混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液用滅菌的糞便懸浮液逐級稀釋。貯存于4℃?zhèn)溆谩７治銮?，?.45μm膜過濾。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸計算，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的測定

準(zhǔn)確移取1.4配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋至一定濃度后進(jìn)樣20μL，在1.2的色譜條件下分析，如圖1所示。綠原酸、咖啡酸、3－羥基苯丙酸、p－香豆酸、阿魏酸和馬尿酸均能良好分析，且6種酚酸類物質(zhì)在20min內(nèi)得到了很好的分離。

圖1 混合酚酸類標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of phenolic compounds solution

2.2 線性關(guān)系考察

精密量取1.4配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，逐級稀釋，每個濃度20μL進(jìn)樣，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制各標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1。由表1可見，6種酚酸的相關(guān)系數(shù)為0.9979～0.9999，檢出限為0.098～0.363，說明綠原酸及其主要代謝產(chǎn)物在一定范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度實驗

精確量取混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.2色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，每次20μL，以綠原酸、咖啡酸、p－香豆酸、3－羥基苯丙酸、阿魏酸和馬尿酸的峰面積計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（n=6），6種酚酸的RSD分別為：0.58%、0.86%、0.65%、1.32%、0.93%、0.90%，表明該儀器精密度良好，具體結(jié)果見表2。

2.4 穩(wěn)定性實驗

精確量取預(yù)先配制好的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.2的色譜條件下分別于0、2、4、8、12、24h各進(jìn)樣20μL，結(jié)果綠原酸、咖啡酸、3－羥基苯丙酸、p－香豆酸、阿魏酸和馬尿酸的峰面積的RSD分別為：1.96%、1.88%、1.52%、2.07%、2.17%、0.34%，表明該樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 檢測方法的回歸方程、相關(guān)性系數(shù)、線性范圍及檢出限Table 1 Regression equation，correlation coefficient，linear range and detection limit for the method

表2 6種酚酸的精密度實驗結(jié)果（n=6）Table 2 The results of precision test of 6 phenolic acids（n=6）

2.5 加樣回收率實驗

分別取空白糞便懸浮液50mL均分9份，分別加入3組質(zhì)量水平（120%、100%、80%）的6種酚酸，配制成高中低三種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在1.2的色譜條件下進(jìn)樣20μL分析，每個樣重復(fù)三次進(jìn)樣，測定結(jié)果見表3。由表3可知，6種酚酸的平均回收率為86.84%～101.56%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.15%～2.29%，說明該方法回收率高。

3 結(jié)論

本實驗建立了同時測定綠原酸及其5種主要的代謝產(chǎn)物（咖啡酸、阿魏酸、p-香豆酸、3-羥基苯丙酸及馬尿酸）的HPLC法，用甲醇和1%的冰醋酸水溶液進(jìn)行梯度洗脫，6種酚酸類物質(zhì)在20min內(nèi)得到了很好的分離。分析結(jié)果表明，該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，能將混合液中6種酚酸類物質(zhì)進(jìn)行有效分離，縮短了分析時間，降低了分析成本，為分析檢測綠原酸代謝產(chǎn)物提供了方法保障。

表3 各成分的加樣回收率結(jié)果（n=3）Table 3 The results of recovery test for the method（n=3）

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