花青素分離純化及其組分鑒定研究進(jìn)展

王秋霜，凌彩金，劉淑媚，趙超藝，李家賢

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，廣東省茶樹資源創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510640)

花青素(anthocyanidin)又叫花色素，是一類廣泛存在于植物中的水溶性色素，屬類黃酮化合物，是構(gòu)成花瓣和果實(shí)顏色的主要色素之一?；ㄇ嗨夭粌H使花卉、水果和蔬菜呈現(xiàn)美麗的顏色，還賦予更高的功能性?；ㄇ嗨鼐哂醒泳徦ダ?、抗氧化［1－4］、抗突變［5］、抑制腫瘤細(xì)胞發(fā)生［6］、預(yù)防心腦血管疾病、保護(hù)肝臟、降低 DNA 氧化損害［7］、降血糖［8］等多種生理功能。天然色素與合成色素相比安全性高，且具有一定的營養(yǎng)和藥理作用［9］。因此，開發(fā)利用天然色素資源日益受到人們的重視。提取、分離、純化是功能性物質(zhì)研究的第一步，因此本文將對(duì)該領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 花青素的基本概況

花青素存在于很多植物中，如紅葡萄、草莓、藍(lán)莓、茄子、紫薯等等。花青素大部分都是水溶性色素，是果實(shí)、植株、花呈現(xiàn)出紅、橙、紫、藍(lán)等顏色的重要原因［10］?；ㄇ嗨貙兕慄S酮化合物，基本結(jié)構(gòu)單元為α－苯基苯并吡喃型陽離子(圖1)，因3’及5’位置的取代基不同(羥基或甲氧基)，形成了各種各樣的花青素［11］。現(xiàn)已知的花青素有20多種，主要存在于植物中的有6種:天竺葵素(pelargonidin)、矢車菊素或芙蓉花色素(cyanidin)、翠雀素或飛燕草色素(delphindin)、芍 藥 素 (peonidin)、錦 葵 色 素(Malvidin)及牽?；ㄉ?Petunidin)等［12］。有研究認(rèn)為，在發(fā)酵和未發(fā)酵茶葉中已經(jīng)鑒定的花青素主要是前五種，其中最主要的是錦葵色素［10］。楊賢強(qiáng)等［13］發(fā)現(xiàn)，茶葉中花青素主要有四種，除了上述的前3種外還包括翹搖紫苷元(三策啶)。

此外，茶葉中還存在原花色素(proanthocyanidins)，由花白素和兒茶素聚合而成，酸性條件下兩類物質(zhì)可部分轉(zhuǎn)化為花青素［11］。自然條件下，游離的花青素主要以糖苷形式存在，花青素與葡萄糖鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖等通過糖苷鍵形成花色苷，已知天然的花色苷有250多種［11］。

花青素可以隨著細(xì)胞液的酸堿度而改變顏色:細(xì)胞液呈酸性則偏紅，細(xì)胞液呈堿性則偏藍(lán)。因?yàn)椴枞~細(xì)胞顯酸性，因此葉片顯現(xiàn)紅色?；ㄇ嗨卦谄胀ǖ木G色芽葉中僅含0.1%，紅紫色芽葉中含量高達(dá)1%以上［14］。低溫時(shí)，有些植物的莖葉會(huì)變成紫紅色，這是因?yàn)槿~片里的碳水化合物轉(zhuǎn)變成花青素的緣故，秋天的紅葉也是葉片的花青素引起的。光可增加花青素含量，高溫會(huì)使花青素降解。

2 花青素分離純化方法研究進(jìn)展

從植物中分離、純化得到花青素類物質(zhì)并應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域已經(jīng)成為花青素研究的新熱點(diǎn)。

圖1 花青素基本結(jié)構(gòu)Fig.1 Basic structure of anthocyanidin

由于花青素分子具有酸性與堿性基團(tuán)，因此較易溶于水、酸堿及有機(jī)醇溶劑中［11］。因此，花青素一般可以用極性溶劑來提取。傳統(tǒng)的提取方法是在低沸點(diǎn)的醇類中添加鹽酸，如使用酸性乙醇［15－19］;也有不加酸，僅僅用乙醇來提取［20－21］。但是，有學(xué)者研究認(rèn)為添加鹽酸可能引起花青素的分解［22］。因此，現(xiàn)在有學(xué)者提倡使用丙酮添加弱有機(jī)酸，但丙酮有一定的毒性，因此應(yīng)用并不廣泛［23］?；ㄇ嗨卦谳^強(qiáng)的酸性條件下相對(duì)穩(wěn)定，在提取液中有必要添加酸來維持其穩(wěn)定性。但是，添加酸的種類不同對(duì)花青素本身會(huì)產(chǎn)生影響，強(qiáng)酸可能引起糖苷鍵的斷裂，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性［24］。

提取的方法主要包括超聲波輔助萃?。?5］、微波萃?。?6，18，20］、水浴加熱萃取等。提取條件的研究較多，包括酸的濃度(pH)、醇濃度、浸提時(shí)間、浸提溫度、料液比、提取次數(shù)等;在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上通過正交或者二次旋轉(zhuǎn)回歸方法對(duì)提取因素進(jìn)行優(yōu)化。

Kerio［10］等研究人員采用甲醇－鹽酸提取茶葉中的花青素。茶樹中有一類特殊的資源，即新生的芽葉呈現(xiàn)出紅紫色，主要是內(nèi)含花青素的原因。常溫下提取4h，然后濃縮、凍干，通過SPE固相萃取柱進(jìn)行純化，然后進(jìn)入液相色譜儀分析。國內(nèi)有學(xué)者用乙醇水溶液粗提得到茶葉花青素的水溶液，用石油醚脫脂后用三氯乙烷萃取，得到氯仿層溶液和水層;水層用乙酸乙酯萃取得到花青素水溶液，濃縮后干燥得到粗提物。接著采用硅膠柱層析分離，用不同的溶劑進(jìn)行梯度洗脫，將斑點(diǎn)相似或相同的洗脫液合并，濃縮干燥，采用紫外－可見光譜掃描并進(jìn)行初步鑒定，在465～550nm有吸收峰，可以確定含有花青素。羅正飛等［26］采用乙醇溶劑提取紫鵑茶中的花青素物質(zhì)，研究了最佳提取工藝:70%乙醇溶劑、回流30min、回流溫度 80℃，料液比 1∶10［12］，本文采用文獻(xiàn)［27］的方法測定了花青素含量。

黑布林是花青素提取的一種材料來源。有學(xué)者采用正交實(shí)驗(yàn)對(duì)黑布林皮中的花青素提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定了適宜的提取工藝條件為75%乙醇溶液、pH為2.5、浸提溫度50℃、浸提時(shí)間60min、料液比1∶5可得花青素最大提取率為0.539%。此外，還發(fā)現(xiàn)黑布林皮花青素可與常用的食品基質(zhì)配伍，對(duì)熱、酸及常見的金屬離子都有較好的穩(wěn)定性?；ㄇ嗨乜偭坎捎胮H示差法測定［15］。

對(duì)藍(lán)莓類材料中花青素提取的研究較多。有學(xué)者［19］采用乙醇浸提法提取藍(lán)莓果中的花青素。研究認(rèn)為最佳提取條件為 pH3.5、浸提溫度50℃、浸提60min、乙醇濃度50%，提取1次的提取率最高。還有研究人員比較了四種提取液對(duì)草莓和藍(lán)莓花青素提取的效果，發(fā)現(xiàn)甲醇—水—乙酸提取量最好，建議采用 HPLC 法對(duì)花 青 素進(jìn) 行 定 量［24］。Dai［28］采 用0.01%HCl/乙醇超聲處理黑莓湯，凍干后得到花青素提取物。篩選了不同酸性乙醇的濃度，分別為100%、90%、75%、50%、25%、10%。發(fā)現(xiàn)濃度為50%時(shí)的總提取含量最多?；ㄇ嗨氐目偭繙y定采用pH示差法;單體測定采用HPLC方法、在524nm下檢測主要花青素種類。

糧食作物中紫甘薯和紫玉米研究的較多。姚鈺蓉［29］的研究表明，通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)得到紫甘薯花青素最佳提取條件:甲酸濃度5%，提取溫度60℃，提取時(shí)間1h，料液比1∶10，提取3次。對(duì)紫玉米花青素提取的研究發(fā)現(xiàn)，以蒸餾水、酸性水溶液(pH3)和酸性醇為提取劑時(shí)，酸性醇的提取率明顯高于其他方法［30］。

還有對(duì)一些紫紅色花中花青素提取的研究，如李升鋒［31］運(yùn)用四因素二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)方案，研究了溫度、時(shí)間、液料比、乙醇濃度對(duì)玫瑰茄干花萼花青素提取率的影響，確定了花青素提取的較好條件。國外的Ben Amor［32］利用熱化學(xué)快速降壓(DIC)使洛神葵花萼組織破碎，研究了各種操作參數(shù)，認(rèn)為DIC處理可以改善洛神葵花萼花青素的動(dòng)力學(xué)和提取的產(chǎn)率。

3 花青素分析方法及組成鑒定方法

花青素的測定方法包括用單一pH法和pH示差法;組成及組分含量鑒定采用色譜法。

單一pH法:采用水溶液浸提茶湯，用酸性乙醇顯色，在535nm測定花色苷含量，一般用平均比消光度(101.83)來測定花色苷總量［27］。

pH示差法:在兩個(gè)不同的pH下，花青素溶液的吸光值的差值與花青素的含量成比例。即在520和700nm下測定pH1.0和pH4.5處理液吸光度值的差異。國內(nèi)外很多研究采用這種方法測定，認(rèn)為該法能很好地消除溶液中雜質(zhì)對(duì)測定結(jié)果的影響［10］。

陳瓊等［33］采用上述兩種方法比較測定了茶樹芽葉花色苷含量，結(jié)果表明:單一pH法測定值高于pH示差法，兩者線性關(guān)系良好;pH示差法能較好地消除干擾物質(zhì)對(duì)測定結(jié)果的影響，為茶葉的花色苷定量分析提供了依據(jù)。

色譜法是樣品組分分離鑒定的重要分離手段，并在多種物質(zhì)的鑒定方面已經(jīng)大規(guī)模應(yīng)用。Kerio等［10］采用 SPE方法純化 kenya茶花青素后，利用HPLC－UV－Vis在520nm測定了花青素組分，在發(fā)酵和未發(fā)酵茶葉中鑒定出天竺葵素、矢車菊素、飛燕草色素、芍藥素和錦葵色素。其中最主要的是錦葵色素。

Nafiz Oncu Can［34］等采用梯度洗脫利用 HPLCDAD在18min內(nèi)對(duì)28種水果和蔬菜中的花青素進(jìn)行了分離和鑒定，鑒定了6種食物中最多的花青素物質(zhì)，如三種葡萄糖苷的天竺葵色素、花青素、芍藥素、花翠素、牽牛花色素、錦葵色素苷元。

反向逆流色譜(CCC)已經(jīng)成功地應(yīng)用到分離和純化花青素物質(zhì)，CCC分離所用的溶劑是極性的，因?yàn)楹衝－丁醇，所以在濃縮和揮發(fā)時(shí)比較難把握。通常會(huì)使用三氟乙酸(TFA)防止花青素平衡向陽離子方向轉(zhuǎn)化，也會(huì)改善分離效果［35］。紫露草葉、紫棉、接骨木果汁、紅酒、黑莓中花青素也開展了CCC高速逆流色譜的分析，HPLC－ESI－MS得到了純的花青素［36］。Cato Fr?ytlo［37］利用 Toyopearl HW－40F gel和反相液相色譜法可以分離黑醋栗的花青素，而不需要使飛燕草素－3－O－葡萄糖苷和花青素－3－O－蕓香糖苷及小的芍藥素和錦葵色素－3－O－蕓香糖條帶重疊。

國內(nèi)學(xué)者利用高效液相色譜－電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(HPLC－ESI－MS/MS)對(duì)藍(lán)莓提取物中的花青素和黃酮醇進(jìn)行了分析，結(jié)構(gòu)上的不同導(dǎo)致花青素和黃酮醇在紫外－可見光譜吸收、離子化以及裂解方式上都存在差異［38］?；ㄇ嗨卦?30nm附近有特征吸收，負(fù)離子模式下黃酮醇可以生成負(fù)離子和自由基負(fù)離子，而正離子型的花青素則幾乎不產(chǎn)生質(zhì)譜信號(hào)，這一顯著差異可以區(qū)別花青素和黃酮醇。研究中鑒定了飛燕草定－3－O－葡萄糖苷，錦葵定－3－O－葡萄糖苷和槲皮素［38］。

4 結(jié)論和展望

4.1 花青素物質(zhì)的分離一般采用酸性醇溶液，利用超聲波輔助萃取、微波萃取、加熱萃取等方法進(jìn)行。提取條件包括酸的濃度(pH)、醇濃度、浸提時(shí)間、浸提溫度、料液比、提取次數(shù)等;在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上通過正交或者二次旋轉(zhuǎn)回歸方法對(duì)提取因素進(jìn)行優(yōu)化。總量測定方法為單一pH法和pH示差法;組分測定采用HPLC方法。

4.2 花青素使花瓣和果實(shí)呈現(xiàn)出亮麗的顏色，還具有延緩衰老、抗腫瘤細(xì)胞發(fā)生、預(yù)防心腦血管疾病、降血糖等多種生理功能。開發(fā)天然色素具有較高的使用安全性和功能性，因此相信隨著社會(huì)的不斷進(jìn)步、科技的日益創(chuàng)新，在天然色素的開發(fā)領(lǐng)域花青素資源具有更加廣泛的發(fā)展空間和前景。

［1］Pawe? Pas＇ko，Henryk Bartoń，Pawe? Zagrodzki.Anthocyanins，total polyphenols and antioxidant activity in amaranth and quinoa seeds and sprouts during their growth［J］.Food Chemistry，2009，115:994－998.

［2］Awika JM，Rooney LW，Waniska RD.Anthocyanins from black sorghum and their antioxidant properties［J］.Food Chemistry，2004，90:293－301.

［3］Kuresh A，Youdim，Antonio M，et al.Incorporation of the elderberry anthocyanins by endothelial cells increases protection against oxidative stress［J］.Free Radical Biology ＆ Medicine，2000，29(1):51－60.

［4］Idolo Tedesco，Gian Luigi Russo，F(xiàn)ilomena Nazzaro，et al.Antioxidant effect of red wine anthocyanins in normal and catalase－ inactive human erythrocytes［J］.JournalofNutritional Biochemistry，2001，12:505－511.

［5］Kazimierz G，Katarzyna S，Barbara B，et al.Antimutagenic activity of anthocyanins isolated from Aronia melanocarpa fruits［J］.Cancer Letters，1997，119:37－46.

［6］Neto CC，Amoroso JW，Liberty AM.Anticancer activities of cranberry phytochemicals:an update［J］.Mol Nutr Food Chem，2008，52:S18－S27.

［7］M?ller P，Lofta S，Alfthan G，et al.Oxidative DNA damage in circulating mononuclear blood cells after ingestion of blackcurrant juice or anthocyanin－ rich drink［J］.Mutation Research，2004，551:119－126.

［8］Grace MH，Ribnicky DM，Kuhn P，et al.Hypoglycemic activity of a novel anthocyanin－rich formulation from lowbush blueberry［J］.Vaccinium Angustifolium Aiton Phytomedicine，2009，16:406－415.

［9］黎稶，黃小風(fēng)，李中林.利用苦瓜子衣廢料制備食用色素的研究［J］.林產(chǎn)化工通訊，2003，37(2):3－7.

［10］Kerio LC，Wachira FN，Wanyoko JK，et al.Characterization of anthocyanins in Kenyan teas:extraction and identification［J］.Food Chemistry，2012，131:31－38.

［11］王日為，張麗霞，高吉?jiǎng)?茶葉中花青素類物質(zhì)研究展望［J］.茶葉科學(xué)技術(shù)，2002，4:4－8.

［12］李雙伶，郭俊凌，杜曉.茶樹紫色芽葉中花青素的提?。瓕游龇蛛x及初步鑒定［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(28):13799－13802，13809.

［13］楊賢強(qiáng)，王岳飛，陳留紀(jì)，等.茶多酚化學(xué)［M］.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2003:10－85.

［14］劉富知，黃建安，付冬和，等.茶樹上紅紫色芽葉部分生化特性研究［J］.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，26(1):55－57.

［15］張玲，邱松山，麥建華，等.黑布林皮中花青素的提取工藝優(yōu)化及穩(wěn)定性研究［J］.糧食與食品工業(yè)，2009，16(6):36－40.

［16］孫千鴻，黃聿明，梁卉，等.微波法提取銅錘草花青素的研究［J］.化工時(shí)刊，2010，24(6):29－32.

［17］譚禾平，王桂躍，陸國權(quán).紫玉米花青素的浸提技術(shù)研究［J］.食品科技，2007，10:182－184.

［18］賈士芳，董洪霞，董樹亭.微波輔助法提取紫玉米植株花青素工藝條件優(yōu)化研究［J］.中國食物與營養(yǎng)，2011，17(2):56－60.

［19］王兆雨，徐美玲，朱蓓薇.藍(lán)莓花青素的提取工藝條件［J］.大連輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，26(3):196－198.

［20］黃瓊，陳嬋，彭宏，等.微波法萃取紫色甘薯皮原花青素工藝的研究［J］.食品科技，2010，35(4):199－203.

［21］張鑫，張志軍，李會(huì)珍，等.紫蘇葉花青素的提取及測定［J］.食品研究與開發(fā)，2009，30(9):187－190.

［22］García－Viguera C，Zafrilla P，Tomas－Barberan FA.The use of acetone as extraction solvent for strawberry fruit anthocyanins［J］.Phytochemical Analysis，1998，9(6):274－277.

［23］Zheng YH，Wang CY，Wang SY，et al.Effect of high－oxygen atmospheres on blueberry phenolics anthocyanins，and antioxidant capacity［J］.Journal of Agriculture and Food Chemistry，2003，51(24):7162－7169.

［24］劉仁道，張猛，李新賢.草莓和藍(lán)莓果實(shí)花青素提取及定量方法的比較［J］.園藝學(xué)報(bào)，2008，35(5):655－660.

［25］趙爾豐，高暢，高欣，等.酶－超聲波輔助提取藍(lán)莓果渣中花青素的工藝研究［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41(4):98－102.

［26］羅正飛，梁明志，夏麗飛，等.“紫鵑”茶花青素提取工藝研究［J］.福建茶業(yè)，2011，3:22－24.

［27］黃易歡.茶學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)［M］.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社，1995:125－126.

［28］Dai J，Gupte A，Gates L，et al.A comprehensive study of anthocyanin－containing extracts from selected blackberry cultivars:Extraction methods，stability，anticancer properties and mechanisms［J］.Food and Chemical Toxicology，2009，47:837－847.

［29］姚鈺蓉.紫甘薯花青素的提取純化、穩(wěn)定性及抗氧化活性研究［D］.保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006:19－21.

［30］肖麗霞，汪芬，張超，等.提取劑對(duì)紫玉米花青素提取量的影響［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工·創(chuàng)新版，2009，6:38－44.

［31］李升鋒，徐玉娟，張友勝，等.玫瑰茄花青素提取條件優(yōu)化研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，11:83－86.

［32］Ben Amor B，Allaf K.Impact of texturing using instant pressure drop treatment prior to solvent extraction of anthocyanins from Malaysian Roselle(Hibiscussabdariffa)［J］.Food Chemistry，2009，115:820－825.

［33］陳瓊，陸瑞瓊.茶樹芽葉花色苷含量測定方法的研究［J］.北京工商大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2011，29(2):41－44.

［34］NafizOncu Can，GokselArli，ZekiAtkosar.Rapid determination of free anthocyanins in foodstuffsusinghigh performance liquid chromatography［J］.Food Chemistry，in press.

［35］Josep Valls，Silvia Millán，M Pilar Martí，et al.Advanced separation methods of food anthocyanins，isoflavones and flavanols［J］.Journal of Chromatography A，2009，1216:7143－7172.

［36］MichaelSchwarz，Silke Hillebrand，Saskia Habben.Application of high－speed countercurrent chromatography to the large－scale isolation of anthocyanins［J］.Biochemical Engineering Journal，2003，14:179－189.

［37］Cato Fr?ytlog，Rune Slimestad，?yvind M Andersen，et al.Combination of chromatographic techniques for the preparative isolation of anthocyanins－applied on blackcurrant(Ribes nigrum)fruits［J］.Journal of Chromatography A，1998，825:89－95.

［38］袁帥，姚勝軍，耿昱，等.HPLC－ESI－MS/MS識(shí)別藍(lán)莓提取物中的花青素和黃酮醇［J］.化學(xué)學(xué)報(bào)，2009，67(4):318－322.