UPLC－MS/MS定性測(cè)定紫薯花青苷方法研究

高 玥，李新生，2，3，* ，韓 豪，朱渭兵，馬嬌燕，楊智勇

(1.陜西理工學(xué)院，陜西漢中723000;2.陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西漢中723000;3.陜西省黑色有機(jī)食品工程技術(shù)研究中心，陜西漢中723000;4.楊凌金薯種業(yè)科技有限公司，陜西楊凌712100)

紫薯(Ipomoea batatas(L.)Lam)，屬旋花科甘薯屬草本植物，薯肉呈紫色至深紫色，又叫黑薯、紫心甘薯或紫肉甘薯，它不僅含普通甘薯的營(yíng)養(yǎng)成分，而且含有大量的花青苷和硒元素［1］。紫薯花青苷主要為?；ㄇ嘬眨?］，因此，紫薯花青苷作為食品添加劑具有較好的著色能力和穩(wěn)定性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道紫薯花青苷具有抗氧化、抗突變、抗腫瘤、增強(qiáng)記憶等多種生理功能［3－5］。根據(jù)國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀，目前花青苷常用的檢測(cè)方法有可見(jiàn)分光光度法、紫外－可見(jiàn)分光光度法、高效液相色譜法等［6－8］，但單純使用 UV 或HPLC均存在檢測(cè)靈敏度低，檢測(cè)用時(shí)長(zhǎng)等不足。關(guān)于紫薯花青苷超高效液相色譜—三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC/MS－MS)測(cè)定方法尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以紫薯為實(shí)驗(yàn)材料，建立UPLC/MS－MS測(cè)定方法，分析紫薯花青苷的組分，旨在為紫薯花青苷的分析檢測(cè)提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫薯樣品 農(nóng)林47、紫薯1號(hào)，楊凌金薯種業(yè)科技有限公司;乙腈、甲醇 色譜純，霍尼韋爾公司;甲酸 色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;矢車菊素－3－葡萄糖苷(Cy－3－glu)Cas No.7084－24－4，C21H21O11，相對(duì)分子質(zhì)量449.38，含量99.5%，sigma公司;芍藥素－3－葡萄糖苷(Pn－3－glu)Cas No.6906－39－4，C22H23ClO11，相對(duì)分子質(zhì)量 498.9，含量99.5%，sigma公司。

超高效液相—三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 配電噴霧離子源，美國(guó)waters公司;BSA224S型電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;RE－52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;LC－800離心機(jī) 科大創(chuàng)新股份有限公司;DZF6050真空干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司;KQ－100DA型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品溶液制備

1.2.1.1 材料預(yù)處理 將選好的紫薯塊根清洗干凈，切片(厚度約2～5mm的薄片)，在45℃溫度下烘干(失水70%左右)，然后用粉碎機(jī)粉碎，過(guò)篩80目，放置干燥、避光的地方，待用。

1.2.1.2 樣品制備 準(zhǔn)確稱取5g樣品倒入50mL的平底燒瓶?jī)?nèi)，加入50mL 90%甲醇溶液(含0.1%甲酸)，超聲提取30min，取上清液于100mL棕色容量瓶中，二次加50mL 90%酸性甲醇(含0.1%甲酸)超聲提取30min，合并兩次提取液，搖勻，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮10倍后再置40℃真空干燥箱中干燥至溶劑揮干，然后用6%甲酸水溶液溶解，并定容于25mL棕色容量瓶中。離心后，分別取2.5mL紫薯花青苷樣品紫薯1號(hào)和農(nóng)林47的定容液于50mL容量瓶中，用6%甲酸水溶液再次定容后，用0.2μm的針頭過(guò)濾器過(guò)濾，于超高效液相－三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取1mg花青苷標(biāo)準(zhǔn)品，用6%的甲酸水溶液溶解并定容至25mL棕色容量瓶中，搖勻后靜置，即為40μg/mL的花青苷標(biāo)準(zhǔn)品母液。再將標(biāo)準(zhǔn)品母液稀釋40倍即為1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品工作液，4℃下保存，儲(chǔ)備時(shí)間不超過(guò)48h。

1.2.3 色譜流動(dòng)選擇 選用矢車菊素－3－葡萄糖苷和芍藥素－3－葡萄糖苷為分離實(shí)驗(yàn)樣，UPLC C18(2.1mm×50mm，1.7μm)為樣品色譜分離柱，柱溫:40℃，流速:0.3mL/min，進(jìn)樣量:10μL為實(shí)驗(yàn)條件，分別采用0.5%甲酸水溶液、1%甲酸水溶液、6%甲酸水溶液、10%甲酸水溶液和乙腈等溶劑作為流動(dòng)相，以實(shí)驗(yàn)樣分離度、色譜峰形為考核指標(biāo)，選擇適用于流動(dòng)相的溶劑及梯度洗脫條件。

1.2.4 質(zhì)譜條件選擇 離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子掃描;檢測(cè)模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè);毛細(xì)管電壓:3kV;離子源溫度:110℃;脫溶劑氣溫度:400℃;脫溶劑氣流量:800L/h;錐孔氣流量:50L/h。并分別采用300ng/mL矢車菊素－3－葡萄糖苷和芍藥素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液在電噴霧離子源(ESI)正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定矢車菊素－3－葡萄糖苷和芍藥素－3－葡萄糖苷的分子母離子，并對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，確定兩個(gè)特征子離子，比較碰撞電壓和錐孔電壓對(duì)檢測(cè)的影響，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)。

1.2.5 花青苷測(cè)試樣溶液配制溶劑的選擇 分別采用蒸餾水、50%甲醇、甲醇、甲醇(含6%甲酸)、50%甲醇(含6%甲酸)、6%甲酸水溶液配制花青苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳的質(zhì)譜和色譜條件下，采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行監(jiān)測(cè)，優(yōu)化其溶劑。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件

選擇出的流動(dòng)相:A為乙腈，B為6%的甲酸水溶液，梯度洗脫條件如表1所示。

表1 超高效液相色譜參數(shù)Table 1 The table of UPLC gradient elution

2.2 質(zhì)譜條件

在ESI正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定了矢車菊素－3－葡萄糖苷的分子離子為m/z 449.1，與文獻(xiàn)報(bào)道一致［9］。以m/z 449.1為母離子，對(duì)其子離子進(jìn)行全掃描，m/z 287、m/z 136.9兩個(gè)子離子豐度較強(qiáng)，作為矢車菊素－3－葡萄糖苷定性分析子離子，其可能的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1所示。以MRM正離子模式優(yōu)化確定了最佳碰撞電壓和錐孔電壓的參數(shù)為錐孔電壓為32V，碰撞電壓分別為56、22V時(shí)，m/z 287和m/z 136.9碎片離子的強(qiáng)度較大。

圖1 矢車菊素－3－葡萄糖苷質(zhì)譜裂解方式Fig.1 Proposed fragmentation pathways of cyaniding－3－glucoside

在ESI正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定了芍藥素－3－葡萄糖苷的分子離子為m/z 623.9，以m/z 623.9為母離子，對(duì)其進(jìn)行子離子全掃描，m/z 311和150.9兩個(gè)子離子豐度較強(qiáng)，作為芍藥素－3－葡萄糖苷的定性分析子離子，其可能的結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖2所示。以MRM正離子模式優(yōu)化確定了最佳碰撞電壓和錐孔電壓的參數(shù)為錐孔電壓為30V，碰撞電壓分別為22、38V時(shí)，m/z 311和 m/z 150.9碎片離子的強(qiáng)度較大。

2.3 溶劑的優(yōu)化

圖2 芍藥素－3－葡萄糖苷質(zhì)譜裂解方式Fig.2 Proposed fragmentation pathways of peonidin－3－glucoside

結(jié)果表明:a.用蒸餾水配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值較低;b.50%甲醇、甲醇、甲醇(含6%甲酸)、50%甲醇(含6%甲酸)均出現(xiàn)峰形前伸的現(xiàn)象;c.6%的甲酸水溶液配制的標(biāo)準(zhǔn)溶液，響應(yīng)值最高，峰形最好(如圖3所示)。

圖3 矢車菊素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的總離子色譜圖Fig.3 Total ion current of cyanidin 3－glucoside standard solution

2.4 紫薯花青苷樣品組分的測(cè)定

2.4.1 紫薯1號(hào)樣品花青苷組分的測(cè)定

2.4.1.1 矢車菊素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液的MRM掃描 在優(yōu)化的液相和質(zhì)譜條件下，對(duì)矢車菊素－3－葡萄糖苷花青苷標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)樣，以m/z 449.1＞287和m/z 449.1＞136.9為定性離子對(duì)，矢車菊素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液在錐孔電壓為32V，碰撞電壓分別為22、56V時(shí)，其保留時(shí)間3.49min。(色譜圖見(jiàn)圖4)。

圖4 矢車菊素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的總離子色譜圖Fig.4 Total ion current of cyaniding－3－glucoside standard solution

2.4.1.2 紫薯1號(hào)樣品溶液MRM掃描 在矢車菊素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液相同的儀器參數(shù)條件下，以m/z 449.1＞287和m/z 449.1＞136.9為定性離子對(duì)，分析紫薯1號(hào)中花青苷是否有矢車菊素－3－葡萄糖苷。由紫薯1號(hào)花青苷提取液的總離子色譜圖(見(jiàn)圖5)可得，三個(gè)主要色譜峰為 3.49、5.19和13.43min，其中保留時(shí)間為3.49min的色譜峰與矢車菊素－3－葡萄糖苷的保留時(shí)間一致，且分子量相同，兩個(gè)特征子離子分別為m/z 287和m/z 136.9，與標(biāo)準(zhǔn)品一致，確定為矢車菊素－3－葡萄糖苷。保留時(shí)間為5.19min的色譜峰的分子量與矢車菊素－3－葡萄糖苷的分子量相同，具有相同的特征離子對(duì)，但是保留時(shí)間與矢車菊素－3－葡萄糖苷不同，可見(jiàn)該化合物是矢車菊素－3－葡萄糖苷的同分異構(gòu)體，但是具體結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步研究。由于流動(dòng)相為梯度洗脫，樣品分析時(shí)間在0～12，12～15min為清洗色譜柱和平衡色譜柱壓力時(shí)間，故保留時(shí)間為13.43min的色譜峰為流動(dòng)相變化明顯產(chǎn)生的溶劑峰，而非樣品出的峰。

圖5 紫薯1號(hào)的總離子色譜圖Fig.5 Total ion current of Purple sweet potato(Zishu No.1)

2.4.2 農(nóng)林47樣品花青苷組分的測(cè)定

2.4.2.1 芍藥素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液 MRM掃描 在優(yōu)化的液相和質(zhì)譜條件下，對(duì)芍藥素－3－葡萄糖苷花青苷標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)樣，以m/z 623.9＞311和m/z 623.9＞150.9為定性離子對(duì)，矢車菊素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液在錐孔電壓為30V，碰撞電壓分別為22、38V時(shí)，其保留時(shí)間4.32min。(色譜圖見(jiàn)圖6)

2.4.2.2 農(nóng)林47樣品溶液MRM掃描 在芍藥素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液相同的儀器參數(shù)條件下，以m/z 623.9＞311和m/z 623.9＞150.9為定性離子對(duì)，分析農(nóng)林47中花青苷是否有芍藥素－3－葡萄糖苷。由農(nóng)林47花青苷提取液的總離子色譜圖(見(jiàn)圖7)可得，四個(gè)主要色譜峰為 4.32、5.44、6.82、9.16、16.23min，其中保留時(shí)間為4.32min的色譜峰與芍藥素－3－葡萄糖苷的保留時(shí)間一致，且分子量相同，兩個(gè)特征子離子分別為m/z 623.9＞311和 m/z 623.9＞150.9m/z，與標(biāo)準(zhǔn)品一致，確定為芍藥素－3－葡萄糖苷。保留時(shí)間為5.44、6.82和9.16min的色譜峰的分子量與芍藥素－3－葡萄糖苷的分子量相同，具有相同的特征離子對(duì)，但是保留時(shí)間與芍藥素－3－葡萄糖苷不同，可見(jiàn)該兩種化合物是芍藥素－3－葡萄糖苷的同分異構(gòu)體，但是具體結(jié)構(gòu)還有待進(jìn)一步研究。由于流動(dòng)相為梯度洗脫，樣品分析時(shí)間在0～12、12～15min為清洗色譜柱和平衡色譜柱壓力時(shí)間，故保留時(shí)間為13.23min的色譜峰為流動(dòng)相變化明顯產(chǎn)生的溶劑峰，而非樣品出的峰。

圖6 芍藥素－3－葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的總離子色譜圖Fig.6 Total ion current of Pn－3－glu standard solution

圖7 農(nóng)林47的總離子色譜圖Fig.7 Total ion current of Purple sweet potato(Nonglin 47)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用UPLC－MS/MS測(cè)定方法，從紫薯1號(hào)、農(nóng)林47花青苷提取液中檢測(cè)出兩種紫薯花青苷組分，分別為矢車菊素－3－葡萄糖苷和芍藥素－3－葡萄糖苷，目前對(duì)此紫薯1號(hào)、農(nóng)林47兩種樣品的花青苷分析尚未見(jiàn)報(bào)道。

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道采用高效液相色譜法分析矢車菊素－3－葡萄糖苷的保留時(shí)間為 13.551min［10］，采用UPLC/MS－MS法分析矢車菊素－3－葡萄糖苷的出峰時(shí)間為3.49min，相比較UPLC/MS－MS法分析保留時(shí)間明顯縮短。HPLC分析定性分析是依據(jù)樣品保留時(shí)間是否與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致作為鑒別標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析，而UPLC/MS－MS法是通過(guò)對(duì)母離子、子離子和保留時(shí)間雙重標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行定性分析，因此采用UPLC/MS－MS法分析花青苷具有準(zhǔn)確度高、有簡(jiǎn)單、快速的特點(diǎn)，解決了液相色譜檢測(cè)用時(shí)長(zhǎng)等問(wèn)題。

［1］張明，王燕.紫甘薯中的功能性成分研究［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2010(5):65－70.

［2］Fan Qiu，Jianguang Luo，Shun Yao，et al.Preparative isolation and purification of anthocyanins from purple sweet potato by high speed counter－current chromatography［J］.J Sep Sci，2009，32:2146－2151.

［3］Makoto YOSHIMOTO，Shigenori OKUNO.Antimutagenicity of Sweetpotato(Ipomoea batatas)Roota［J］.Biosci Biotechnol Biochem，1999，63(3):537－541.

［4］Dong－Tiann HUANG，Chun－Der LIN，Hsien－Jung CHEN，et al.Antioxidant and antiproliferative activities of sweet potato(Ipomoea batatas［L.］Lam ‘Tainong 57’)constituents［J］.Bot Bull Acad Sin，2004，45:179－186.

［5］Jungsook Cho，Jong Seong Kang，Pham Seet Long.Antioxidant and memory enhancing effects of purple sweet potatoes anthocyanin and cordyceps mushroom extract［J］.Arch Pharm Res，2003，26(10):821－824.

［6］J B Harborne.Spectral methods of characterizing anthocyanins［J］.Biochem J，1958，70(1):22－28.

［7］韓豪，李新生，張志鍵，等.膜技術(shù)在黑米花青苷色素脫脂和濃縮中的應(yīng)用［J］.食品科學(xué)，2012，33(6):297－300.

［8］毛建霏，付成平，郭靈安，等.可見(jiàn)分光光度法測(cè)定紫甘薯總花青素含量［J］.食品與發(fā)酵科技，2010，46(2):201－204.

［9］Abdel－ Aal E S M，Young J C，Rabalski I.Anthocyanin composition in black，blue，pink，purple，and red cereal grains［J］.J Agric Food Chem，2006，54(13):4696－4704.

［10］薛曉麗.HPLC法測(cè)定黑米中花青素的主要成分及含量［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37(11):4854－4855.