RP－HPLC測(cè)定保加利亞乳桿菌腺苷酸方法的建立與應(yīng)用

孫茂成，李艾黎，霍貴成，孟祥晨，戚曉熙

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030)

保加利亞乳桿菌呈桿狀，一般呈長(zhǎng)、大鏈，不運(yùn)動(dòng)，無(wú)芽孢，革蘭氏陽(yáng)性，異養(yǎng)兼性厭氧型乳酸菌，是典型的酸奶發(fā)酵菌種之一［1－3］，它的代謝性質(zhì)直接影響酸奶的品質(zhì)，如口感、風(fēng)味和益生功能［4－7］等，解析其復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)和代謝物組的變化已成為目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。代謝組學(xué)的出現(xiàn)和發(fā)展成為研究微生物代謝和代謝工程的有力工具，與基因組學(xué)、蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)共同支撐起了系統(tǒng)生物學(xué)，為研究生物體完整的生命信息提供了代謝水平的支持［8－9］。淬滅是代謝組學(xué)研究中很重要的一個(gè)步驟，要求瞬間停止菌體的代謝反應(yīng)，從而獲得真實(shí)的菌體代謝片段［10］。60%(V/V)(－40℃)甲醇是使用最廣泛的淬滅液，可以亞秒級(jí)停止代謝反應(yīng)［11］。但是近來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道這種淬滅方法可以造成一些微生物胞內(nèi)代謝物的泄露，從而影響代謝組學(xué)研究的數(shù)據(jù)真實(shí)性［12－13］。建立有效的淬滅手段已成為獲得真實(shí)代謝物組數(shù)據(jù)的必要條件。隨之而來(lái)，也就要求建立一個(gè)簡(jiǎn)單快速準(zhǔn)確的方法來(lái)判斷淬滅液的淬滅效果。Faijes M［14］和 Hannes L［15］發(fā)現(xiàn)腺苷酸是個(gè)很好的鑒定淬滅液淬滅效果的指標(biāo)，ATP是胞內(nèi)代謝物泄露的良好指標(biāo)，能荷值(EC)可以指示菌體代謝反應(yīng)是否完全停止，正常生長(zhǎng)的菌體細(xì)胞EC值在0.8～0.9之間;這兩位作者分別通過(guò)酶法和液質(zhì)聯(lián)用(LC－MS)測(cè)定腺苷酸并成功地評(píng)價(jià)了淬滅液的淬滅效果，可見(jiàn)腺苷酸是個(gè)簡(jiǎn)單準(zhǔn)確的淬滅評(píng)價(jià)指標(biāo)。但是傳統(tǒng)的酶法所需試劑昂貴、操作費(fèi)時(shí)，現(xiàn)代的LC－MS法需要的設(shè)備價(jià)格不菲。高效液相色譜測(cè)定腺苷酸不失是一種快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的方法，已廣 泛 應(yīng) 用 于 動(dòng) 物 臟 器［16－20］、血 液［21］和 植 物 組織［22－24］內(nèi)腺苷酸的測(cè)定，但是應(yīng)用于微生物的腺苷酸的測(cè)定則鮮有報(bào)道。本研究目的是建立一種適用于保加利亞乳桿菌腺苷酸快速準(zhǔn)確檢測(cè)的高效液相色譜方法，從而為代謝組學(xué)的淬滅研究提供方法支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

保加利亞乳桿菌 KLDS 1.0204，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離保存;標(biāo)準(zhǔn)品5＇－三磷酸腺苷二鈉鹽(ATP)、5＇－二磷酸腺苷二鈉鹽(ADP)、5＇－一磷酸腺苷二鈉鹽(AMP)Sigama 公司;MRS肉湯培養(yǎng)基 北京陸橋;甲醇 色譜純;磷酸二氫鉀、氫氧化鈉 均為國(guó)產(chǎn)分析純。

高效液相色譜儀 配備2487紫外檢測(cè)器和Empower色譜工作站，美國(guó)Waters;ALPHA 1－4 LSC冷凍干燥機(jī) 德國(guó)Christ。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的制備 將保加利亞乳桿菌 KLDS 1.0204的種子培養(yǎng)液按3%接種于MRS肉湯液體培養(yǎng)基中，42℃培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期，取30mL發(fā)酵液，離心(7000 × g，5min，4℃)，菌體沉淀用生理鹽水洗兩次，5mL 60%(V/V)甲醇/水(－40℃)的淬滅液與菌體沉淀快速混合，離心(10000×g，5min，－20℃)，收集的上清液即為淬滅液，凍干后保存于－80℃。預(yù)熱至95℃的2mL去離子水迅速傾倒至菌體，沸水浴3min，冰浴上冷卻5min，離心(10000×g，5min，4℃)，收集的上清液即為胞內(nèi)提取物，凍干后保存于－80℃直至分析。

1.2.2 色譜條件 色譜柱:SinoChrom ODS－BP C18(5μm，4.6mm ×250mm);流動(dòng)相:甲醇－30mmol/L 磷酸鉀(pH7.0)緩沖液(V∶V=5∶95);紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254nm;柱溫25℃;流速0.7mL/min;進(jìn)樣量20μL。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與曲線的繪制 精密稱取一定量的ATP、ADP和AMP標(biāo)準(zhǔn)品，用流動(dòng)相溶解并定容配制成濃度為100mg/L的儲(chǔ)備液。精密吸取儲(chǔ)備液，稀釋成 50、25、10、5、2.5mg/L，以峰面積為橫坐標(biāo)，腺苷酸的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求出直線回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的選擇

將放置在－80℃中的樣品取出，用1mL流動(dòng)相復(fù)溶，快速混勻后用0.45μm的濾膜過(guò)濾，立即進(jìn)行色譜分析。這樣操作簡(jiǎn)單，使得在樣品量較多的時(shí)候檢測(cè)更及時(shí)，避免待測(cè)物質(zhì)的降解。

2.2 流動(dòng)相的選擇

2.2.1 磷酸鹽濃度的選擇 在柱溫25℃和流速1mL/min，比較 50、40、30、20mmol/L 的磷酸鹽濃度(pH6.5)對(duì)腺苷酸的分離效果。隨著磷酸鹽濃度的增加，ATP、ADP、AMP的保留值增大，但是鹽濃度過(guò)大對(duì)儀器及色譜柱的腐蝕性也大。當(dāng)磷酸鹽濃度降到20mmol/L，ATP受到干擾峰的影響。其它的磷酸鹽濃度均可以較好分離腺苷酸，但是應(yīng)該選擇低濃度且不影響腺苷酸分離效果的磷酸鹽濃度，故選擇磷酸鹽的濃度為30mmol/L。

2.2.2 甲醇濃度的選擇 磷酸鹽流動(dòng)相不但會(huì)減少色譜柱的使用壽命而且容易堵塞色譜柱和色譜檢測(cè)器，在流動(dòng)相中適當(dāng)添加有機(jī)溶劑會(huì)減少對(duì)色譜柱的傷害。在30mmol/L的磷酸鹽流動(dòng)相(pH6.5)中分別添加5%、10%和15%的甲醇溶液，比較其對(duì)腺苷酸的分離效果的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著甲醇濃度的增加，ATP和 ADP的分離度逐漸降低，添加10%甲醇時(shí)，ATP受到干擾峰的影響;添加15%甲醇時(shí)，ATP與 ADP分離不開(kāi)。故本實(shí)驗(yàn)采用在30mmol/L磷酸鹽流動(dòng)相中添加5%甲醇溶液。

2.3 pH的選擇

腺苷酸在中性或弱酸性的條件下相對(duì)穩(wěn)定。采用1.2.2的色譜條件，比較流動(dòng)相pH為7.0、6.5和5.5時(shí)對(duì)腺苷酸的分離效果。隨著pH的降低，ATP、ADP和AMP的保留時(shí)間逐漸提前，當(dāng)pH為5.5時(shí)，ATP與ATP的峰形開(kāi)始出現(xiàn)拖尾;當(dāng)pH分別為7.0、6.5時(shí)，ATP和ADP的保留時(shí)間基本一致，只是AMP在pH為6.5時(shí)，保留時(shí)間明顯延后。故選取流動(dòng)相的pH為7.0，在不影響腺苷酸分離效果的基礎(chǔ)上，可以對(duì)樣品進(jìn)行快速分析檢測(cè)。

2.4 柱溫的選擇

對(duì)比柱溫為25和30℃對(duì)腺苷酸分離效果的影響。結(jié)果顯示柱溫為30℃時(shí)會(huì)導(dǎo)致AMP的峰形出現(xiàn)分叉，而柱溫為25℃時(shí)ATP、ADP和AMP的分離度和峰形均令人滿意。

2.5 流速的影響

設(shè)置柱溫25℃，分析流動(dòng)相流速分別為0.5、0.7、1.0mL/min時(shí)對(duì)腺苷酸分離效果的影響。結(jié)果顯示流速的改變會(huì)直接影響色譜柱柱壓和腺苷酸的出峰時(shí)間。當(dāng)流速為0.7mL/min時(shí)，分析一個(gè)樣品僅在10min之內(nèi)，且色譜柱柱壓適中，故選擇流速為0.7mL/min。

2.6 腺苷酸的保留時(shí)間和線性范圍

取ATP、ADP和AMP的各自濃度為10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，然后按照優(yōu)化好的色譜條件進(jìn)行分析，根據(jù)各自腺苷酸的保留時(shí)間進(jìn)行定性，腺苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的液相分離圖譜見(jiàn)圖1。

分別精密稱量ATP、ADP和AMP標(biāo)準(zhǔn)品，用流動(dòng)相配制成各自濃度為100mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋成50、25、10、5和2.5mg/L，共6個(gè)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品，分別進(jìn)樣20μL，以峰面積為橫坐標(biāo)，腺苷酸的質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。直線回歸方程見(jiàn)表1。由此看出，質(zhì)量濃度與峰面積有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.9998。

2.7 精密度和回收率實(shí)驗(yàn)

2.7.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取10mg/L的混合標(biāo)品，分別進(jìn)行日內(nèi)和日間精密度測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2，說(shuō)明該法精密度良好。

圖1 腺苷酸標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC分離圖譜Fig.1 HPLC chromatogram of adenosine phosphates standards

表1 腺苷酸的回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 1 Regression equation and correlation coefficient of the adenosine phosphates

2.7.2 加標(biāo)回收率 在已知濃度的樣品中，分別加入高、中、低三種不同的腺苷酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述方法和條件測(cè)定其加樣回收率。結(jié)果如表3所示，ATP、AMP和 AMP的回收率分別為 94.12%～98.2%，102.5%～103.4%和108.2%～109.6%，RSD均小于3.3%，說(shuō)明該法比較準(zhǔn)確可靠。

表2 腺苷酸測(cè)定的精密度實(shí)驗(yàn)(n=5)Table 2 Precision of the measured results(n=5)

表3 樣品腺苷酸加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=3)Table 3 Recoveries of the measured results(n=3)

2.8 定量檢出限

定量限的確定是根據(jù)當(dāng)樣品峰的峰高與噪音峰的峰高的比值，即信噪比(RSN)，當(dāng)信噪比為10時(shí)的樣品濃度即為定量限。利用進(jìn)樣流動(dòng)相來(lái)確定空白的最大噪音峰的峰高，然后通過(guò)測(cè)定不斷稀釋ATP、ADP和AMP的標(biāo)品來(lái)確定定量限。ATP、ADP的定量限均為0.25mg/L，AMP的定量限為0.1mg/L。

2.9 評(píng)價(jià)冷甲醇淬滅保加利亞乳桿菌的效果

對(duì)淬滅液和胞內(nèi)提取物樣品按照上述優(yōu)化好的色譜條件進(jìn)行分析，色譜圖見(jiàn)圖2、圖3。由表5可見(jiàn)，保加利亞乳桿菌在60%(V/V)甲醇/水(－40℃)的淬滅液淬滅時(shí)造成腺苷酸的大量泄漏，表明胞內(nèi)小分子物質(zhì)存在大量泄漏;菌體EC=(ATP+1/2 ADP)/(ATP+ADP+AMP)=0.42±0.015，不在正常生長(zhǎng)的菌體細(xì)胞的0.8～0.9的范圍內(nèi)，表明菌體代謝反應(yīng)沒(méi)有完全停止，故該淬滅方案不適合保加利亞乳桿菌的代謝組學(xué)研究。雖然60%(V/V)甲醇/水(－40℃)的淬滅液是目前應(yīng)用最廣泛的，但并不是適用于每一種微生物。

圖2 胞內(nèi)提取物的腺苷酸色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of adenosine phosphates in cell extract

圖3 淬滅液的腺苷酸色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of adenosine phosphates in the supernatant of quenching fluid

表5 樣品中腺苷酸含量及胞內(nèi)代謝物泄露率(n=3)Table 5 The percentage of leaked adenosine phosphates in samples(n=3)

3 討論與結(jié)論

本研究中利用優(yōu)化的反相高效液相色譜方法，成功地對(duì)保加利亞乳桿菌在使用最廣泛的60%(V/V)甲醇/水(－40℃)淬滅后的淬滅液和胞內(nèi)提取物中的腺苷酸進(jìn)行分離定量，從而反映其淬滅效果，該淬滅液造成的保加利亞乳桿菌腺苷酸的泄露情況與 Hannes L［15］利用 LC－MS 法評(píng)價(jià) 60%(V/V)甲醇/水(－40℃)淬滅大腸桿菌時(shí)造成的泄露情況基本一致，也進(jìn)一步證明該色譜方法完全可以勝任對(duì)代謝組學(xué)研究中的淬滅效果的評(píng)價(jià)。此色譜方法的分離度、精密度、回收率和樣品分析時(shí)間均取得了令人滿意的效果，對(duì)今后保加利亞乳桿菌的代謝組學(xué)研究中的淬滅液篩選與評(píng)價(jià)提供了方法支持。

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