高產(chǎn)酸乳酸菌的篩選、鑒定和生長特性研究

趙 婧，李 慧，張玉玉，周春麗，宋 弋，李全宏

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，國家果蔬加工工程技術(shù)研究中心，農(nóng)業(yè)部果蔬加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，果蔬加工教育部工程研究中心，北京100083)

近年來，隨著益生菌產(chǎn)品日益受到消費(fèi)者的青睞，乳酸菌作為一種公認(rèn)的安全性較高的益生菌，其應(yīng)用越來越廣泛。不僅是乳制品，谷物、蔬菜等都可作為乳酸菌的發(fā)酵基質(zhì)［1］。應(yīng)用的廣泛性為乳酸菌的品質(zhì)提出了更高的要求。因此，篩選具有優(yōu)良性能的乳酸菌，研究乳酸菌的生長特性對于乳酸菌制品的工業(yè)化生產(chǎn)有著積極的意義。產(chǎn)酸性能是乳酸菌的一個(gè)重要的特性，乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)酸對改善制品的口感和風(fēng)味有著積極的意義［2］，高產(chǎn)酸的乳酸菌在乳酸菌制品生產(chǎn)過程中較普通乳酸菌可以縮短發(fā)酵時(shí)間，提高生產(chǎn)效率，從而降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。國內(nèi)學(xué)者在乳酸菌產(chǎn)酸性能方面作了大量研究，但在高產(chǎn)酸乳酸菌的篩選和生長特性方面的研究還比較少，本研究從實(shí)驗(yàn)室篩選保存的8株優(yōu)良乳酸菌中進(jìn)一步篩選出了3株產(chǎn)酸量高且生長良好的乳酸菌。并對這3株乳酸菌進(jìn)行了分析鑒定和生長特性的研究，為在以后的生產(chǎn)中更好地利用這些優(yōu)良菌種奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)室分離保存的乳酸菌8株(編號(hào):ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6、ST7、ST8);瓊脂、MRS 肉湯 生化試劑(BR);碳酸鈣、過氧化氫、氯化鈉、鹽酸、鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉 分析純(AR);結(jié)晶紫染色液、盧戈氏碘液、95%乙醇、石炭酸復(fù)紅染液;細(xì)菌微量生化鑒定管:乳酸桿菌糖發(fā)酵鑒定套裝(七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉籽糖)、色氨酸肉湯、硝酸鹽肉湯、胰蛋白胨大豆肉湯、明膠、醋酸鉛培養(yǎng)基 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;Kovacs靛基質(zhì)試劑、酚紅、硝酸鹽還原試劑甲乙液 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

WH－3微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;YT－CJ－1N型超凈工作臺(tái) 北京亞泰科隆實(shí)驗(yàn)科技開發(fā)中心;LX－B35L型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌鍋 合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司;DHP－9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;PHS－3C型精密pH計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;WFZ UV－2802H型紫外可見分光光度計(jì) 尤尼柯儀器有限公司;XSP－2CA普通光學(xué)顯微鏡 上海永亨光學(xué)儀器制造有限公司;XMTB恒溫水浴鍋 北京市長風(fēng)儀器表公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 高產(chǎn)酸菌株的篩選

1.2.1.1 初篩 初篩采用鈣溶圈法［3］，分別挑1環(huán)活化好的菌株接種于100mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37℃左右培養(yǎng)24h。將無菌的牛津杯置于加入1%CaCO3的MRS瓊脂平板中央，在牛津杯［4］中分別注入500μL菌液，置于37℃左右培養(yǎng)，待牛津杯中的菌液干后，將牛津杯取下，繼續(xù)培養(yǎng)2～3d，測量鈣溶圈直徑大小。選取鈣溶圈直徑較大的菌株進(jìn)入復(fù)篩。

1.2.1.2 復(fù)篩 復(fù)篩采用酸堿滴定法［5］，分別挑1環(huán)活化好的菌株接種于100mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37℃左右培養(yǎng)48h。取1mL發(fā)酵液，用50mL蒸餾水稀釋，以酚酞作指示劑，用0.1mol/L的NaOH溶液滴定至微紅色，記錄用去NaOH溶液的體積。酸度以100mL發(fā)酵液消耗NaOH的mol數(shù)來表示:

式中:CNaOH指 NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的摩爾濃度(0.1mol/L);VNaOH指滴定所用的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積(L)。

選取發(fā)酵酸度較高的菌株為高產(chǎn)酸菌株。

1.2.1.3 乳酸定性 以2%乳酸為標(biāo)準(zhǔn)溶液，對篩選出的高產(chǎn)酸乳酸菌發(fā)酵液進(jìn)行紙層析實(shí)驗(yàn)。展開劑為水∶苯甲醇∶正丁醇 =1∶5∶5(v/v/v)，并加入 1% 的甲酸;以0.04%的溴甲酚紫酒精溶液為顯色劑，待層析液揮發(fā)之后，向?qū)游鰹V紙噴灑并計(jì)算Rf值［6］。

式中d1為各顯色斑點(diǎn)中心與點(diǎn)樣點(diǎn)之間的距離(cm)，d2為點(diǎn)樣點(diǎn)與展開劑前沿的距離(cm)。

1.2.2 高產(chǎn)酸菌株的鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將篩選出的菌種分別接種到MRS瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)48h，觀察菌落特征，取單菌落，涂片并進(jìn)行革蘭氏染色和芽孢染色，油鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.2.2 生理生化鑒定 過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、吲哚實(shí)驗(yàn)、精氨酸水解實(shí)驗(yàn)、明膠液化實(shí)驗(yàn)、硫化氫產(chǎn)生實(shí)驗(yàn)［7］、常見糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)(七葉苷、纖維二糖、麥芽糖、甘露醇、水楊苷、山梨醇、蔗糖、棉子糖)［8］。

1.2.2.3 16S rDNA分析鑒定 將待檢菌株送于北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司進(jìn)行16S rDNA序列測定，并用GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast分析。

1.2.3 菌株的生長特性研究

1.2.3.1 菌株生長曲線的測定 將保存的已鑒定菌株在斜面培養(yǎng)基上活化2次，然后取1環(huán)接種于100mL MRS肉湯培養(yǎng)基中活化1次，再分別以3%的接種量接種于200mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)，每隔4h取10mL培養(yǎng)液，測定菌懸液在600nm處的OD值和pH，并繪制生長曲線［9］。

1.2.3.2 菌株最適生長溫度測定 菌株活化方法同1.2.3.1，將活化好的菌株以3%的接種量接種于100mL MRS 肉湯培養(yǎng)基中，分別置于 32、35、37、40、45℃下培養(yǎng)24h，測定菌懸液在600nm處的OD值，確定最適合生長溫度［10］。

1.2.3.3 菌株最適初始pH測定 菌株活化方法同1.2.3.1，將活化好的菌株以3%的接種量接種于100mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，調(diào)整培養(yǎng)基的初始pH分別為4、5、6、7、8，置于最適溫度下培養(yǎng)24h，測定菌懸液在600nm處的OD值，確定菌株生長最適合的初始 pH［10］。

1.2.3.4 菌株最適鹽濃度測定 菌株活化方法同1.2.3.1，將活化好的菌株以3%的接種量接種于100mL MRS肉湯培養(yǎng)基中，調(diào)整培養(yǎng)基的初始鹽(NaCl)濃度值分別為 6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%，調(diào)整最適pH，置于最適溫度下培養(yǎng)24h，測定菌懸液在600nm處的OD值，確定最適合的初始鹽濃度［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 高產(chǎn)酸菌株篩選結(jié)果

2.1.1 初篩結(jié)果 根據(jù)方法1.2.1.1進(jìn)行8株乳酸菌的鈣溶圈實(shí)驗(yàn)，由于培養(yǎng)基中添加了1%的CaCO3，所以隨著乳酸菌的生長，乳酸菌產(chǎn)生的酸不斷溶解培養(yǎng)基中的CaCO3，形成的透明圈不斷變大。如圖1所示，在相同的時(shí)間內(nèi)，由于產(chǎn)酸量不同，菌液周圍的透明圈大小產(chǎn)生明顯的差異。用直尺測量各菌株的鈣溶圈直徑，測量結(jié)果如表1所示，根據(jù)鈣溶圈法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取鈣溶圈直徑≥1.50cm的菌株進(jìn)入復(fù)篩。因此，進(jìn)入復(fù)篩的菌株為:ST1、ST2、ST3、ST5、ST6、ST7。

圖1 菌株鈣溶圈示意圖Fig.1 Schematic diagram of dissolved calcium circle of strains

2.1.2 復(fù)篩結(jié)果 根據(jù)方法1.2.1.2測定進(jìn)入復(fù)篩的六株乳酸菌最終發(fā)酵酸度，結(jié)果如圖2所示，菌株ST1、ST3和ST6的產(chǎn)酸量明顯高于其它幾株菌，與鈣溶圈法的結(jié)果相一致，三株菌的產(chǎn)酸量(以100mL發(fā)酵液消耗 NaOH的 mol數(shù)計(jì))均在1.9×10－2mol左右，且ST6＞ST3＞ST1，因此篩選出的高產(chǎn)酸菌株為菌株 ST1、ST3和 ST6。

表1 鈣溶圈法實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of Ca2+－medium plates screening

表2 發(fā)酵液Rf值測定結(jié)果Table 2 Rfvalue of the fermentation broth

表3 菌落形態(tài)觀察結(jié)果Table 3 Results of colony morphology observation

表4 糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of sugar fermentation test

圖2 各菌株產(chǎn)酸量柱形圖Fig.2 Acid production of each strain

2.1.3 乳酸定性結(jié)果 根據(jù)方法1.2.1.3進(jìn)行乳酸定性的紙層析實(shí)驗(yàn)，測定乳酸菌標(biāo)準(zhǔn)液和篩選出的三株乳酸菌的Rf值，并進(jìn)行比較，結(jié)果如表2所示:三株乳酸菌發(fā)酵液的Rf值與乳酸的Rf值基本一致，表明三株菌的發(fā)酵液中都產(chǎn)生乳酸。

2.2 高產(chǎn)酸菌株鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)觀察結(jié)果

2.2.1.1 菌落形態(tài)觀察結(jié)果 初步觀察篩選出的三株乳酸菌的菌落形態(tài)，結(jié)果如表3所示，三株乳酸菌的菌落都較小，其中菌株ST1稍大一些，菌落以乳白色為主，表面光滑，邊緣整齊，符合乳酸菌典型的菌落特征，但是還無法判斷是何種乳酸菌。

2.2.1.2 鏡檢結(jié)果 菌株ST1、ST3和ST6均為革蘭氏染色陽性，無芽孢，無鞭毛，桿狀。初步判斷三株菌均為乳酸桿菌。

2.2.2 生理生化鑒定結(jié)果

2.2.2.1 基礎(chǔ)生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 基礎(chǔ)生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:菌株ST1、ST3和ST6均不產(chǎn)生過氧化氫酶，不分解色氨酸，不液化明膠，不水解精氨酸，不分解含硫蛋白，不還原硝酸鹽，符合乳酸桿菌的特征［11］。

2.2.2.2 糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果 糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果(表4)顯示，菌株ST1和ST6符合干酪乳桿菌干酪亞種和鼠李糖乳桿菌的反應(yīng)結(jié)果，菌株ST3不符合任一常見乳桿菌屬內(nèi)種的反應(yīng)結(jié)果。但由于副干酪乳桿菌與干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌的親緣關(guān)系很近，很難利用傳統(tǒng)的發(fā)酵特性來區(qū)分它們［12］，所以通過糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)還不能確定三株菌的種類，需要通過進(jìn)一步的16S rDNA分析來鑒定。

2.2.3 16S rDNA分析鑒定結(jié)果 通過16S rDNA分析鑒定，菌株ST1的參考物種為副干酪乳桿菌，同源度99%;菌株ST3的參考物種為副干酪乳桿菌，同源度98%;菌株ST6的參考物種為鼠李糖乳桿菌，同源度99%。結(jié)合形態(tài)觀察、生理生化反應(yīng)的結(jié)果，最終確定菌株ST1和菌株ST3為副干酪乳桿菌，菌株ST6為鼠李糖乳桿菌。

2.3 高產(chǎn)酸菌株生長特性

2.3.1 三株乳酸菌的生長曲線 由菌株生長曲線及pH變化曲線(圖3、圖4)可以看出，菌株ST3和ST6的生長情況基本一致，約4h進(jìn)入對數(shù)期，12h進(jìn)入穩(wěn)定期，菌液pH最低達(dá)到3.5左右。菌株ST1的生長較ST3和ST6略顯平緩，對數(shù)期不明顯，pH下降趨勢也較菌株ST3和ST6平緩，菌液pH最低達(dá)到3.7左右。

圖3 菌液OD值隨培養(yǎng)時(shí)間變化曲線Fig.3 Changes of OD values of broth with time

2.3.2 三株乳酸菌的最適生長條件

圖4 菌液pH隨培養(yǎng)時(shí)間變化曲線Fig.4 Changes of pH values of broth with time

2.3.2.1 菌株最適溫度范圍 由圖5可以看出，菌液OD值在一定范圍內(nèi)隨著溫度的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，表明溫度過低或過高都不適宜菌株的生長，因此選取菌液OD值≥2.5所對應(yīng)的溫度范圍為菌株的最適生長溫度范圍，結(jié)果如下:菌株ST1和菌株ST3的最適生長溫度為31～37℃，菌株ST6的最適生長溫度為37～43℃。溫度過低或過高都會(huì)影響菌株的生長。

圖5 菌液OD值隨培養(yǎng)溫度變化曲線Fig.5 Changes of OD values of broth with temperature

2.3.2.2 菌株生長的最適pH范圍 由圖6可以看出，培養(yǎng)基初始pH過低(＜4)會(huì)嚴(yán)重影響菌株的生長;在弱酸性的環(huán)境中(pH5～7)，菌株的生長較為旺盛;pH大于7，菌株生長明顯減弱。對于菌株ST3和ST6，以菌液OD值≥2.5時(shí)pH范圍作為菌株的最適生長pH范圍，均為6～7。對于菌株ST1，以菌液OD值≥2時(shí)pH范圍作為菌株的最適生長pH范圍，為5～7。

2.3.2.3 菌株生長鹽濃度范圍 由圖7可以明顯看出，當(dāng)培養(yǎng)基鹽濃度(NaCl)≤14%時(shí)，菌株ST1和菌株ST3的生長幾乎沒有受到影響，菌株ST6受到輕微的抑制。當(dāng)鹽濃度＞14%時(shí)，三株菌的生長均受到明顯的抑制。

3 結(jié)論

圖7 菌液OD值隨培養(yǎng)基鹽濃度變化曲線Fig.7 Changes of OD values of broth with salt concentration

對實(shí)驗(yàn)室保存的8株乳酸菌進(jìn)行了篩選和鑒定，繪制了三株乳酸菌的生長曲線和產(chǎn)酸曲線，結(jié)果顯示:篩選出的3株高產(chǎn)酸乳酸菌生長良好，其產(chǎn)酸量最高可達(dá)1.98×10－2mol，發(fā)酵最終pH最低可達(dá)3.5左右，表現(xiàn)出優(yōu)良的產(chǎn)酸性能。經(jīng)鑒定，菌株ST1和ST3為副干酪乳桿菌，菌株ST6為鼠李糖乳桿菌。研究了溫度、初始pH、初始鹽濃度對三株乳酸菌生長的影響。得出結(jié)論:其中兩株副干酪乳桿菌的最適生長溫度低于鼠李糖乳桿菌，三株菌在pH＜7的弱酸性環(huán)境下能較好的生長，培養(yǎng)基初始鹽濃度(NaCl)＞14%會(huì)明顯抑制菌株的生長。研究結(jié)果顯示，兩株副干酪乳桿菌與鼠李糖乳桿菌在菌落特征、生理生化反應(yīng)以及生長特性方面與鼠李糖乳桿菌都都極為相似，可能是二者親緣關(guān)系較近的緣故。副干酪乳桿菌作為一種近年來日益受關(guān)注的菌種，在產(chǎn)酸、食品發(fā)酵和防腐等方面顯示出巨大的應(yīng)用潛力。本研究對菌株適宜生長的溫度、初始pH以及初始鹽濃度等條件的測定將為后續(xù)研究中乳酸菌發(fā)酵過程中條件的控制提供依據(jù)。

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