微射流和超聲波對長期貯藏大豆分離蛋白溶解性的影響

黃利華，黎海彬，彭述輝，陳 林

(廣州城市職業(yè)學(xué)院食品系，廣東廣州510405)

大豆除了直接食用和作為食品加工的原輔料外，還是一種重要的油料作物［1］。而豆粕則是大豆榨油后的主要剩余物，因其蛋白質(zhì)含量高達(dá)40%以上，從中提取大豆分離蛋白(SPI)是豆粕高值化利用的主要途徑之一。SPI因其具有較好的營養(yǎng)性和功能特性而在食品加工中廣泛應(yīng)用，蛋白質(zhì)良好的溶解性是應(yīng)用其功能特性的前提和基礎(chǔ)。SPI在貯藏中其溶解性一般會下降，究其原因可能是溫度、濕度等外部環(huán)境影響蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間關(guān)聯(lián)和蛋白質(zhì)分子內(nèi)部親/疏水性質(zhì)，最終反映蛋白質(zhì)溶解性發(fā)生的變化［2－3］。蛋白溶解性的研究較多集中在利用理化手段修飾改性蛋白，使其能夠和水分子較好結(jié)合。例如Jambrak A R等利用20、40、500Hz超聲對 SPI溶液處理，40Hz的溶解性最高［4］，Chen L等利用雙螺桿擠壓 SPI，其溶解性明顯提高［5］，涂宗財(cái)?shù)龋?］利用超高壓均質(zhì)處理SPI溶液，其溶解性隨壓力和蛋白濃度增加而升高，楊國龍等［7］用 Alcalase酶水解 SPI溶液，增強(qiáng)了SPI在水溶液中的擴(kuò)散性。微射流是利用高壓使蛋白溶液在交互容腔內(nèi)產(chǎn)生剪切和沖撞，從而改變分子的排列和結(jié)構(gòu)［8］。超聲具有波動和能量的雙重屬性，對于難溶性蛋白的分離制備具有較好效果［9］。目前對貯藏條件下蛋白溶解性的變化缺乏系統(tǒng)研究，本研究將微射流結(jié)合超聲技術(shù)，提高不同貯藏期內(nèi)SPI溶解性，從而有助于提升SPI功能特性，為拓展較長貯藏時(shí)間的大豆蛋白應(yīng)用提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豆粕(脫脂白豆粕片)山東日照;Mark、尿素、牛血清蛋白 Sigma;β－巰基乙醇(化學(xué)純)、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、尿素、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸等 均為國產(chǎn)分析純。

M－110L高壓納米微射流均質(zhì)機(jī) 美國MFIC公司;JY92－2D型超聲細(xì)胞粉碎機(jī) 上海新諾公司;WATERS高效液相 美國WATERS公司;F－3000紫外－可見分光光度計(jì) 日本HITACHI公司;Zetasizer Nano ZS納米激光粒度儀 英國Malvern公司;AR－1500流變儀 美國 AR公司;Avanti J－26XP離心機(jī) 德國BECKMAN公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大豆分離蛋白的制備和貯藏 采用常用的堿溶酸沉法制備大豆分離蛋白。粉碎脫脂豆粕，過80目篩，豆粕粉與水1∶10(w/v)，用1mol/L的NaOH調(diào)pH至8.0，30℃攪拌1.5h，在攪拌過程中始終維持pH為8.0，將溶液在4℃離心(10000×g，30min)，取上清液。用1mol/L HCl將上清液pH調(diào)至4.5，30℃下攪拌30min，然后在 4℃ 離心(12000 × g，10min)，取沉淀。將沉淀復(fù)溶，再次離心沉淀。將沉淀按1∶5(w/v)加水復(fù)溶，調(diào)pH至7.0，在4℃水中透析24h，每4h換一次水，將透析后SPI溶液調(diào)整濃度后冷凍干燥，塑封袋密閉后于室溫下置于干燥皿中貯藏。

1.2.2 微射流結(jié)合超聲波處理SPI溶液 根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)置納米微射流均質(zhì)機(jī)的輸出壓力為17400psi，即約為120MPa，濃度為5%的 SPI溶液通過微射流均質(zhì)1次。將通過微射流的SPI溶液放入超聲細(xì)胞粉碎機(jī)內(nèi)，操作功率500W，超聲探頭插入液體下面3cm，采用工作5s，間歇5s的方式，該操作方式通過不斷反復(fù)的振蕩，蛋白的溶解效果好于連續(xù)式振蕩。

1.2.3 凝膠電泳(SDS－PAGE)分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為4%。樣品制備:蛋白樣品溶于SDS－PAGE 樣品緩沖液(0.125mol/L Tris－HCl緩沖液，含 1%(w/v)SDS、2%(v/v)巰基乙醇、5%(v/v)甘油和0.025%(w/v)溴酚藍(lán)，電泳前煮沸5min。上樣量為10μL，凝膠電泳于恒流模式下進(jìn)行，在濃縮膠中電流40mA，進(jìn)入分離膠后增至80mA。凝膠染色液采用0.25%考馬斯亮藍(lán)(R－250)溶液，脫色采用高甲醇的醋酸溶液，甲醇/冰乙酸/去離子水按 227∶37∶236(v/v/v)。

1.2.4 溶解性測定 蛋白質(zhì)的溶解度測定根據(jù)Petrucelli S等報(bào)道的方法［10］，稍加改動，測量處理后溶液中的可溶性蛋白含量。稱取不同貯藏時(shí)間和微射流處理的蛋白樣品100mg，分散于10mL的去離子水中，室溫下磁力攪拌30min，然后用1mol/L NaOH或HCl溶液調(diào)節(jié)溶液的pH到7.0，再攪拌30min后，在20℃離心(12000×g，20min)。上清液經(jīng)過適度稀釋后，采用福林酚法測定蛋白質(zhì)含量，以牛血清白蛋白(BSA)為標(biāo)準(zhǔn)物做標(biāo)準(zhǔn)曲線。蛋白質(zhì)的溶解度為上清液蛋白濃度占總蛋白濃度的百分比，每個(gè)樣品重復(fù)測量3次。

1.2.5 凝膠排阻色譜 凝膠排阻色譜(SEC－HPLC)條件如下:WATERS 2487高效液相泵和1525紫外檢測器組成的 WATERS高效液相系統(tǒng)，采用 TSK G4000SW作為分析柱，洗脫液為50mmol/L磷酸緩沖溶液(pH 7.2，50mmol/L NaCl)，流速為0.8mL/min。洗脫液經(jīng)濾膜后(0.45μm)，再超聲脫氣。膜濾后的蛋白溶液(2mg/mL)上樣于TSK G4000SW柱(進(jìn)樣量為 20μL)，采用恒流洗脫。以藍(lán)色葡聚糖(2000ku)、伴清蛋白(75ku)、醛縮酶(158ku)、鐵蛋白(440ku)和甲狀腺球蛋白(669ku)的洗脫時(shí)間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 濁度測定 將不同保藏期和經(jīng)微射流結(jié)合超聲處理的SPI蛋白溶液稀釋至濃度為0.5%wt，溶劑分別為S1:水溶液(pH7.0);S2:pH7.0緩沖液(0.05mol/L的Tris－HCl，6mol/L 尿素和 10mmol/L 的 β－ 巰基乙醇)。把上述各種SPI蛋白溶液分別在600nm測吸光度，每個(gè)樣品測量3次。

1.2.7 粒度測定 加熱處理前先將不同保藏期和經(jīng)微射流結(jié)合超聲處理的SPI蛋白溶液通過0.45μm膜過濾，然后將處理的樣品稀釋成濃度為0.1%，在85℃下加熱10min，將樣品液加入到比色皿中。常溫測量是在25℃條件下進(jìn)行，對比蛋白聚集粒度的變化，每個(gè)樣品分別測量3次。

1.2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 17.0軟件和Excel 2003軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、數(shù)據(jù)處理和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲處理對可溶性蛋白的影響

將濃度5%貯藏360d的SPI溶液分別通過功率為 200、350、500、650、800W 的超聲處理 10min，結(jié)果如圖1所示，超聲處理能顯著提高SPI可溶性蛋白含量，可溶性蛋白含量隨超聲功率的加大而逐漸增加，但在功率500W以后其增幅減弱，統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異(p＞0.05)。

圖1 超聲功率對可溶性蛋白的影響Fig.1 Effect of ultrasonic power on soluble protein

將濃度5%貯藏360d的SPI溶液分別通過功率為500W 超聲處理5、10、15、20、25min，結(jié)果如圖2 所示，延長超聲時(shí)間同樣也增加可溶性蛋白含量，但在15min以后其增幅減弱，20、25min的結(jié)果已無顯著差異(p＞0.05)。

超聲波具有能量和波動的雙重性，使蛋白溶液中產(chǎn)生的空化、剪切和熱作用，以致使蛋白質(zhì)的肽鏈結(jié)構(gòu)變得疏松，增強(qiáng)了與水分子結(jié)合能力，從而提高可溶性蛋白含量。超聲波還可使蛋白分子產(chǎn)生高速振蕩，改變了蛋白質(zhì)的構(gòu)象和結(jié)構(gòu)，使親水性氨基酸殘基暴露，增強(qiáng)蛋白質(zhì)的親水性［11］。

圖2 超聲時(shí)間對可溶性蛋白的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on soluble protein

2.2 微射流均質(zhì)對蛋白質(zhì)溶解性的影響

將濃度5%貯藏360d的SPI溶液分別通過微射流壓力4000、8000、12000、16000psi的微射流均質(zhì) 1次和2次，結(jié)果如圖3所示，可溶性蛋白含量隨壓力的增大而逐漸增大，而通過第2次均質(zhì)后可溶性蛋白含量有所下降。微射流均質(zhì)是利用高壓使蛋白溶液在交互容腔內(nèi)產(chǎn)生剪切和沖撞，從而改變分子的排列和結(jié)構(gòu)，達(dá)到增加蛋白溶解性的目的［8］。微射流結(jié)合超聲波處理改變了蛋白的分子結(jié)構(gòu)，增加了蛋白分子與水分子的結(jié)合能力，使可溶性蛋白含量增加。第2次通過微射流均質(zhì)使蛋白疏水基團(tuán)更多暴露，從而減弱了蛋白與水的結(jié)合能力，降低其溶解性。

圖3 微射流均質(zhì)次數(shù)對可溶性蛋白的影響Fig.3 Effect of homogeneous times of microfluidization on soluble protein

2.3 微射流和超聲波對SPI溶解性的影響

將4份SPI在同等條件下貯藏，分別在0、120、240、360d取出測量SPI溶液中可溶性蛋白的含量。如圖4所示，在0～360d的范圍內(nèi)，隨著貯藏時(shí)間的延長，SPI可溶性蛋白含量顯著下降(p＜0.05)，將貯藏360d的SPI分別通過微射流和超聲波處理(MF+U)，蛋白分子去折疊化，也增加了蛋白分子的擴(kuò)散性和親水性，SPI的可溶性蛋白含量也從0d的59.5%±1.2%降低到360d的43.3% ±1.6%。而經(jīng)過微射流和超聲波處理后，SPI可溶性蛋白含量(88.1% ±1.3%)顯著提高?？扇苄缘鞍缀康奶岣呃碚撋贤瑯哟龠M(jìn)蛋白的乳化性、持水性和持油性等功能性質(zhì)的提高［12－13］。

2.4 SPI的凝膠電泳圖譜

圖4 不同貯藏期SPI的溶解性Fig.4 Solubility of SPI in different storage periods

圖5所示貯藏期為0、120、240、360d的 SPI凝膠電泳圖譜。不同貯藏期的SPI中各組分亞基發(fā)生變化，小分子量組分明顯增多，常溫貯藏條件下SPI理化性質(zhì)逐漸發(fā)生改變，蛋白質(zhì)分子去折疊，分子內(nèi)部的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。大豆球蛋白(glycinin)的疏水性堿性亞基部分(B)逐漸增多，增加了其不溶部分含量。將貯藏360d的SPI溶液通過微射流和超聲波處理，在高壓高剪切的環(huán)境中，其堿性亞基減少，蛋白的親水性增強(qiáng)，溶解性提高。大豆球蛋白和β－伴球蛋白的亞基解離，不同親/疏水性亞基的暴露改變了包括溶解性在內(nèi)的性質(zhì)［14］。

圖5 SPI各組分的SDS－PAGE圖Fig.5 SDS－PAGE of SPI components

2.5 SPI的凝膠色譜圖

不同貯藏期的SPI和通過微射流結(jié)合超聲處理蛋白的凝膠排阻色譜圖如圖6所示，主要的洗脫峰出現(xiàn)在15min以內(nèi)，貯藏期為0～360d的SPI，峰形和出峰時(shí)間變化趨勢近似。但是，從圖中也發(fā)現(xiàn)主峰面積和出峰時(shí)間并沒有明顯的規(guī)律?？赡苁荢PI中亞基在貯藏過程中既存在解聚，同時(shí)也存在聚合［5］。而通過微射流和超聲處理的SPI溶液，其主峰峰面積減少，可能是蛋白疏水聚集減少，蛋白易發(fā)生水合作用，有利于蛋白溶解性的提高。

圖6 不同貯藏期和處理后SEC－HPLC圖譜Fig.6 SEC－HPLC of SPI in different storage periods and treatment

2.6 微射流和超聲波對SPI聚集粒徑影響

蛋白的粒徑反映了在溶液中的擴(kuò)散情況，貯藏期0～360d的SPI在85℃下加熱10min蛋白聚集程度的粒度分布情況如圖7所示，溶液中的蛋白聚集粒徑隨貯藏時(shí)間延長，聚集的粒徑也增大。在360d貯藏后，SPI的熱聚集甚至出現(xiàn)了雙峰粒徑(255nm)。而通過微射流和超聲處理的SPI其粒徑最小(21nm)，其分布范圍也更加集中，顯著改變了貯藏360d SPI粒徑的雙峰模式。這一結(jié)果與微射流處理蛋白粒徑變化趨勢相一致［15］。

圖7 不同貯藏期和處理后SPI聚集的粒度Fig.7 Aggregation size of SPI in different storage periods and treatment

2.7 微射流和超聲波對SPI聚集濁度影響

圖8顯示了在600nm波長下不同SPI溶液中的濁度分析，反映了不同處理?xiàng)l件下蛋白懸浮液的透光率。S1溶液為水溶液，顯示了SPI熱聚集在可見光下的透光率。不管是S1的水溶液中還是S2的緩沖液中，貯藏期0～360d的范圍內(nèi)，SPI溶液的濁度隨貯藏時(shí)間延長而逐漸增大，溶液中蛋白的聚集程度越來越強(qiáng)。而經(jīng)過微射流和超聲波處理，蛋白溶液的濁度明顯下降，吸光度下降，透光率提高。

圖8 不同溶劑中SPI溶液濁度Fig.8 Turbidity of SPI in different solvent

S2緩沖液中存在尿素和巰基乙醇，尿素破壞了蛋白的許多疏水鍵和氫鍵等非共價(jià)鍵，使蛋白的溶解性增加。巰基乙醇則破壞蛋白分子內(nèi)二硫鍵等共價(jià)鍵，S2緩沖液中的濁度與S1比較明顯下降，可以推測溶液中SPI生成聚集主要是疏水鍵和氫鍵等非共價(jià)鍵起連接作用。

3 結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)明確了在常溫密閉貯藏條件下，SPI的溶解性隨著貯藏時(shí)間的延長而逐漸下降，可溶性蛋白含量從貯藏0d的59.5% ±1.2%降低到360d的43.3%±1.6%。凝膠電泳圖譜和排阻色譜顯示SPI在貯藏期0～360d內(nèi)，SPI亞基等成分發(fā)生解聚，SPI聚集的粒徑隨貯藏時(shí)間延長而變大，分布范圍更寬，SPI聚集溶液濁度分析也顯示隨貯藏時(shí)間延長溶液濁度值更高。經(jīng)過微射流和超聲波雙重處理，SPI可溶性蛋白含量上升到88.1%±1.3%。凝膠排阻色譜波峰顯示SPI中親水性變化，SPI聚集的粒徑顯著下降，SPI聚集的濁度在水溶液中要顯著高于尿素和巰基乙醇的緩沖液，SPI聚集主要是由非共價(jià)鍵連接。

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