N-糖基化對(duì)KCNE1功能的影響

李小青，茅家慧，胡亞娥，施海燕，沈之君

(南通大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)與病理生理學(xué)系，江蘇南通 226001)

N-糖基化是蛋白翻譯后修飾的一種，對(duì)蛋白功能的正常發(fā)揮起重要作用。KCNE1為電壓門(mén)控性鉀離子通道Iks的調(diào)控亞基，KCNQ1為功能亞基。KCNE1不存在時(shí)，KCNQ1表現(xiàn)出快速激活和快速失活特征;在KCNE1調(diào)控下，通道表現(xiàn)為緩慢激活特征，失活速度減慢，并且通道電導(dǎo)率明顯增加4～7倍，電壓依賴性曲線右移。該通道參與心肌動(dòng)作電位復(fù)極化［1］，尤其是在機(jī)體受到刺激后交感神經(jīng)興奮的情況下發(fā)揮重要作用。臨床上，KCNQ1和KCNE1的突變可分別導(dǎo)致LQT1和LQT5［2］。因此，研究該通道的功能和調(diào)控對(duì)臨床治療相關(guān)疾病有重要意義。N-糖基化在KCNE1中的作用尚無(wú)系統(tǒng)研究。N-糖基化在KCNE1中功能的研究可增進(jìn)對(duì)KCNE1功能調(diào)控的認(rèn)識(shí)，并增加對(duì)Iks通道調(diào)控的理解，也為臨床上預(yù)防與KCNE1 N-糖基化有關(guān)的疾病，并為尋找新的治療靶點(diǎn)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

人源KCNE1基因表達(dá)載體KCNE1-pcDNA 3.1:NIH Mammalian Gene Colletion(MGC);人源KCNQ1基因表達(dá)載體KCNQ1-PCI:同濟(jì)大學(xué)陳義漢教授惠贈(zèng);質(zhì)粒體外表達(dá)細(xì)胞株HEK293B:上海細(xì)胞研究所;PNGaseF:New England Biolabs，貨號(hào) P0704;點(diǎn)突變?cè)噭┖?QuikChange?Lightning Site-Directed Mutagenesis試劑盒):Stratagene，貨號(hào)210518;KCNE1抗體:Santa Cruze，貨號(hào)sc-16796(WB 使用濃度1∶1 000，細(xì)胞免疫熒光使用濃度1∶100);KCNQ1抗體:Santa Cruze，貨號(hào)sc-20186(使用濃度1∶2 000);Goat anti-rabbit IgG(H+L):Thermo，貨號(hào) 31460(使用濃度 1∶5 000);Rabbit anti-goat IgG(H+L):Thermo，貨號(hào)31402(使用濃度1∶5 000);Alex Flour?488 donkey anti-goat:Invitrogen，貨號(hào)A11055(使用濃度1∶500);脂質(zhì)體FuGENE?HD Transfection Reagent:Roche，貨號(hào) 04709705001;Dynal beads-ProteinG:Invitrogen，貨號(hào) 100.04D。

1.2 方法

1.2.1 PNGaseF 消化 KCNE1 實(shí)驗(yàn)

PNGaseF(peptide-N-glycosidase F):特異水解N寡糖-肽連接鍵，去除N-糖基化糖鏈。KCNE1蛋白裂解液(蛋白20 μg)按照使用說(shuō)明處理后加入2 μl PNGaseF，37℃孵育2 h。然后將產(chǎn)物加蛋白上樣緩沖液處理后經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法分析。本研究中使用的SDS-PAGE濃度均為:分離膠濃度15%，濃縮膠濃度5%。

1.2.2 KCNE1 N-糖基化位點(diǎn)突變體質(zhì)粒的構(gòu)建與表達(dá)

1.2.2.1 突變體質(zhì)粒構(gòu)建 以野生型KCNE1-pcDNA 3.1為模板，按照點(diǎn)突變?cè)噭┖胁僮鞣椒?gòu)建KCNE1-N5Q、KCNE1-N26Q和 KCNE1-N5，26Q 3個(gè)突變體。KCNE1-N5Q上下游引物為:上游引物5'-CCAGGATGA TCCTGTCTCAAACCACAGCGGTGACGC-3'，下游引物 5'-GCGTCACCGCTGTGGTTTGAGACAGGATCATCCTGG-3';KCNE1-N26Q上下游引物為:上游引物5'-GTTCAGC AGGGTGGCCAAATGTCGGGCCTGGC-3'，下 游 引 物5'-GCCAGGCCCGACATTTGGCCACCCTGCTGAAC-3'。

1.2.2.2 突變體質(zhì)粒表達(dá) 將KCNE1野生型及3個(gè)突變體，按照8 μl脂質(zhì)體/4 μg KCNE1的比例，分別轉(zhuǎn)染至已在60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)12～24 h的HEK293B細(xì)胞中，培養(yǎng)36 h后提取蛋白，經(jīng)蛋白質(zhì)印跡法分析。

1.2.3 KCNE1 N-糖基化突變體亞細(xì)胞定位分析實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KCNE1 N-糖基化突變體亞細(xì)胞定位。方法:將HEK293B提前12 h培養(yǎng)在鋪有蓋玻片的12孔板上;按2 μl脂質(zhì)體/1 μg KCNE1的比例，將野生型和突變體分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞;36 h后進(jìn)行免疫染色:4%多聚甲醛固定30 min;0.2%Triton-X100的PBT通透細(xì)胞膜，15～30 min;KCNE1抗體孵育，4℃過(guò)夜;PBST漂洗3次，10 min·次－1;donkey anti-goat熒光Ⅱ抗孵育，室溫2 h;PBST漂洗3次，10 min·次－1;在細(xì)胞片上滴 80% 甘油約 20 μl，然后其上覆蓋蓋玻片，室溫放置15 min;制好的細(xì)胞玻片在熒光顯微鏡下觀察，拍照記錄。

1.2.4 KCNE1 N-糖基化突變體與KCNQ1相互作用分析

通過(guò)KCNE1 N-糖基化突變體與KCNQ1的免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)KCNE1 N-糖基化突變體與KCNQ1相互作用。HEK293B在60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)12～24 h后，細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%，以8 μl脂質(zhì)體/(2 μg KCNQ1+2 μg KCNE1)的轉(zhuǎn)染比例，將野生型及突變體分別與KCNQ1轉(zhuǎn)染細(xì)胞;細(xì)胞轉(zhuǎn)染36 h后依次進(jìn)行以下操作:以200 μl RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白;在200 μl蛋白裂解液中加入20 μl KCNQ1的抗體，4℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜;向上述反應(yīng)混合物中加入50 μl Dynal beads-ProteinG，4℃緩慢搖動(dòng)混合物2 h，然后經(jīng)PBS漂洗3次;利用磁力架收集磁珠-抗原-抗體復(fù)合物，PBS漂洗3次，得到沉淀物(磁珠-抗原-抗體);用60 μl上樣緩沖液將沉淀懸起，輕輕混勻;將上述樣品煮沸10 min，然后以磁力架棄去磁珠，上清經(jīng)過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)KCNE1。

2 結(jié) 果

2.1 KCNE1糖基化位點(diǎn)的鑒定

KCNE1含有129個(gè)氨基酸。N-糖基化的氨基酸的序列特征是Asn-X-Ser/Thr(X代表除脯氨酸外的任何一種氨基酸)，天冬酰胺作為糖鏈?zhǔn)荏w。根據(jù)上述條件分析，KCNE1上第5位(N5)和第26位(N26)符合條件(圖1，加粗斜體字母顯示)，說(shuō)明KCNE1可能存在N-糖基化。為進(jìn)一步確定KCNE1存在N-糖基化，使用特異的去除 N-糖基的酶 PNGaseF消化KCNE1，蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果(圖2)顯示:KCNE1經(jīng)消化后，3條條帶只剩下分子質(zhì)量最小的一條帶，證明KCNE1存在N-糖基化，N5和N26是可能的N-糖基化位點(diǎn)。

圖1 KCNE1“Asn-X-Ser/Thr序列”分析圖Fig 1 “Asn-X-Ser/Thr”sequencing analysis of KCNE1

圖2 KCNE1經(jīng)PNGaseF去N-糖基后蛋白免疫印跡圖Fig 2 Western blot of KCNE1 de-N-glycosylation treatment using PNGaseF

2.2 KCNE1 N-糖基化突變體的構(gòu)建及表達(dá)分析

將KCNE1 5位和26位的N突變?yōu)镼(谷氨酰胺，與天冬酰胺分子結(jié)構(gòu)類似，但不能被N-糖基化修飾)，得到KCNE1-N5Q(單點(diǎn)突變)、KCNE1-N26Q(單點(diǎn)突變)和KCNE1-N5，26Q(聯(lián)合突變)3個(gè)突變體。蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)結(jié)果(圖3)顯示:野生型KCNE1表現(xiàn)為3條條帶，但17kDa及26kDa與17kDa之間的條帶因上樣量較少，表現(xiàn)不明顯(參考圖2)。與野生型相比，兩個(gè)單點(diǎn)突變體均減少1條條帶，而聯(lián)合突則僅保留1條條帶，說(shuō)明N5和N26為KCNE1的兩個(gè)糖基化位點(diǎn)。同時(shí)，圖3顯示 KCNE1-N5Q和 KCNE1-N5，26Q表達(dá)相對(duì)減少，而KCNE1-N26Q的表達(dá)與野生型表達(dá)豐度接近。

圖3 KCNE1及其N-糖基化位點(diǎn)突變體蛋白免疫印跡分析圖Fig 3 Western blot of KCNE1 and the N-glycosylation mutants

2.3 KCNE1 N-糖基化突變體亞細(xì)胞定位分析

細(xì)胞免疫熒光結(jié)果(圖4)表明:野生型KCNE1在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的分布較為均勻。與野生型相比，KCNE1-N26Q在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分布較少，主要分布在細(xì)胞核周圍的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域，表現(xiàn)為顯著的蛋白囤積特征(白色↑↑所示)，KCNE1-N5Q與KCNE1-N5，26Q則該特征表現(xiàn)不明顯(白色↑所示)。突變體不同程度的蛋白囤積現(xiàn)象，可能與突變體表達(dá)豐度有關(guān)系，如圖3所示:KCNE1-N26Q表達(dá)量較大，而KCNE1-N5Q和KCNE1-N5，26Q表達(dá)減少，因此前者可表現(xiàn)出明顯的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)區(qū)域蛋白囤積特征，后兩者則不明顯。上述結(jié)果顯示，突變體在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)障礙，說(shuō)明N-糖基化參與了蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，其中N26Q的糖基化在蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)中的作用最為突出。

圖4 KCNE1及其N-糖基化突變體細(xì)胞免疫熒光圖Fig 4 Immunofluorenscent studies of KCNE1 and the N-glycosylation mutants

2.4 KCNE1 N-糖基化突變體與KCNQ1相互作用分析

采用免疫共沉淀的方法探究N-糖基化位點(diǎn)突變體KCNE1與KCNQ1的相互作用是否發(fā)生改變。結(jié)果(圖5)顯示:與野生型類似，KCNE1 N-糖基化突變體均能與KCNQ1結(jié)合，說(shuō)明N-糖基化修飾在KCNE1與KCNQ1的相互作用中不起重要作用。但N-糖基化修飾是否影響兩者之間的結(jié)合能力，尚需進(jìn)一步蛋白定量分析。

圖5 KCNE1及其N-糖基化突變體與KCNQ1免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖Fig 5 Co-immunoprecipitation of KCNE1 and its N-glycosylation mutants with KCNQ1

3 討 論

N-糖基化在蛋白的功能中發(fā)揮著重要角色。表現(xiàn)在:加強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性使其能夠抵抗消化酶的作用;參與蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［3］;幫助蛋白的正確折疊和組裝;也參與蛋白的分泌過(guò)程，例如促進(jìn)人類生長(zhǎng)因子的分泌［4］。有研究報(bào)道糖基化參與了大鼠血管平滑肌細(xì)胞骨保護(hù)素mRNA表達(dá)調(diào)節(jié)［5］。在離子通道中的作用表現(xiàn)在兩方面:調(diào)控蛋白的膜表達(dá)［6-7］;調(diào)控離子通道的功能，例如通道激活和門(mén)控特性［8］;近期有研究發(fā)現(xiàn):N-糖基化依賴性阻斷是藥物引起心律失常的一種新的機(jī)制［9］。本研究探究了其對(duì)KCNE1功能的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，N-糖基化位點(diǎn)參與了蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，并且呈現(xiàn)位點(diǎn)功能的差異性，KCNE1-N26Q蛋白在細(xì)胞內(nèi)發(fā)生囤積現(xiàn)象明顯，說(shuō)明N26對(duì)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)起關(guān)鍵作用。免疫共沉淀結(jié)果顯示突變體仍能與KCNQ1結(jié)合，說(shuō)明KCNE1 N-糖基化修飾對(duì)兩者的相互作用不起關(guān)鍵作用，但N-糖基化修飾是否影響二者的結(jié)合能力尚待進(jìn)一步蛋白定量分析。以上研究是基于體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，N-糖基化對(duì)KCNE1功能的影響在生物體內(nèi)可能更為復(fù)雜。有研究報(bào)道，KCNE1也參與調(diào)控Ikr通道，KCNE1-D85N突變體會(huì)導(dǎo)致HERG通道電流減小85%［10］，因此其蛋白的N-糖基化功能失調(diào)可能影響HERG通道或其他與其相關(guān)的通道的功能。KCNE1-T7I是臨床上發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)［11］，可導(dǎo)致Jervell and Lange-Nielson Syndrome(耶韋爾和朗格-尼爾森綜合征，JLNS)。第7位(T7)是KCNE1蛋白的O-糖基化位點(diǎn)，第5位(N5)的改變可能影響T7正常的O-糖基化，以至影響蛋白的功能。KCNE1在不同物種內(nèi)的同源性分析表明，N5和N26位兩個(gè)糖基化位點(diǎn)保守程度極高，說(shuō)明糖基化位點(diǎn)在KCNE1內(nèi)的作用不可替代。本研究加深了N-糖基化在KCNE1中作用的認(rèn)識(shí)，增進(jìn)了對(duì)KCNE1與KCNQ1相互作用的了解，增加了對(duì)Iks通道調(diào)控的認(rèn)識(shí)，為臨床上預(yù)防和治療KCNE1 N-糖基化有關(guān)的疾病提供理論依據(jù)。

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