甘肅地區(qū)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌的鑒定與檢測

文朝慧 王軍平 何蘇琴

（1甘肅出入境檢驗(yàn)檢疫局，甘肅蘭州 730020；2甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，甘肅蘭州730070）

番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌——丁香假單胞桿菌番茄致病變種Pseudomonas syringaepv.tomato（Okabe）Young，Dye et Wilkie為假單胞菌科假單胞菌屬丁香假單胞細(xì)菌，引起番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病，可為害番茄的葉、莖、花、葉柄和果實(shí)。因其危害的嚴(yán)重性，番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌在2007年已列入《中華人民共和國進(jìn)境植物檢疫性有害生物名錄》以及《全國農(nóng)業(yè)植物檢疫性有害生物名單，2006》。番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病又稱番茄細(xì)菌性斑疹病、葉斑病，已在30多個(gè)國家有發(fā)生的報(bào)道，可造成5%～75%的產(chǎn)量損失（Yunis et al.，1980）。本試驗(yàn)從表現(xiàn)番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病癥狀的番茄上分離病原細(xì)菌，通過致病性測定、形態(tài)特征和16S rDNA序列測定對菌株進(jìn)行鑒定，并利用特異性引物對已鑒定菌株及植物發(fā)病組織進(jìn)行目標(biāo)細(xì)菌的PCR擴(kuò)增，旨在對番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病病原菌分子檢測方法進(jìn)行驗(yàn)證，達(dá)到對病害進(jìn)行快速檢測的目的。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)樣采集和病害癥狀描述

2011年7～8月在甘肅省河西地區(qū)采集細(xì)菌性斑點(diǎn)病癥狀明顯的番茄果實(shí)，分裝在潔凈塑料袋中，保存于4 ℃冰箱5～7 d。同一個(gè)樣品一部分用于分離病原細(xì)菌，另一部分用于提取發(fā)病組織總DNA進(jìn)行PCR檢測。

依據(jù)田間自然發(fā)病癥狀進(jìn)行病害癥狀描述。

1.2 培養(yǎng)基、引物及試劑

金氏B培養(yǎng)基（KB）：蛋白胨20.0 g，甘油10.0 mL，K2HPO41.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，瓊脂 17.0 g，蒸餾水1 000 mL。

LB培養(yǎng)液：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL。

磷酸鹽緩沖液（PBS）：NaCl 8.0 g， Na2HPO4·2H2O 1.15 g，KH2PO40.2 g，KCl 0.2 g， 蒸餾水 1 000 mL， pH 7.2～7.4。

引物：①細(xì)菌 16S rDNA 通用引物 PF：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，PR：5′-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′；②擴(kuò)增Pseudomonas syringaepv.tomato hrpZPst基因片段的特異性引物 MM5F/MM5R（Zaccardelli et al.，2005），MM5F：5′-GAACGAGCTGAAGGAAGACA-3′，MM5R：5′-CAGCCTGGTTAGTCTGGTTA-3′。PCR引物委托寶生物工程（大連）有限公司合成。

試劑：TaqDNA聚合酶、dNTP、100 bp ladder DNA marker、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、Escherichia coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T載體和植物基因組提取試劑盒為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 病原細(xì)菌的分離和純化培養(yǎng)

采用平板劃線分離法（方中達(dá)，1998）。用無菌解剖刀切取番茄果實(shí)病健交界部位組織，75%酒精消毒1 min，經(jīng)無菌水沖洗3～5次后置于無菌培養(yǎng)皿中切碎，加無菌水浸泡20 min左右，然后用接種環(huán)蘸取該組織液在KB培養(yǎng)基上劃線，28 ℃恒溫培養(yǎng)。長出明顯可見單菌落后，挑取少許菌膿在KB培養(yǎng)基上再次劃線，做純化培養(yǎng)。純化菌株在KB培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌形態(tài)及培養(yǎng)性狀，并在紫外燈下觀察是否產(chǎn)生熒光。

1.4 分離細(xì)菌的鑒定和特異性分子檢測

16S rDNA 基因序列測定：挑取KB平板上生長24 h的新鮮單菌落至LB培養(yǎng)液中，28 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng) 24 h，取 800 μL 菌液，8 000 r·min-1離心 5 min，收集菌體，用 1.5 mL 0.01 mol·L-1pH7.4 的PBS緩沖液重懸，離心洗滌3次后用800 μL 滅菌雙蒸水重懸。所得菌體98℃處理5 min，于冰上放置5 min，4 ℃存放備用。擴(kuò)增引物為細(xì)菌16S rDNA通用引物PF/PR。PCR 反應(yīng)體系：10×PCR 緩沖液 5.0 μL，25 mmol·L-1MgCl25.0 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2.0 μL，10 μmol·L-1PF、PR 各 1.0μL，TaqDNA 聚合酶（5 U·μL-1） 0.3 μL，模板（細(xì)菌裂解液） 2.0 μL，ddH2O 補(bǔ)足體積至 50 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 2 min，30 個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。

分離細(xì)菌的特異性分子檢測：用引物MM5F/MM5R擴(kuò)增hrpZPst基因片段，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小532 bp。以雙蒸水為陰性對照。PCR反應(yīng)體系：10×PCR緩沖液 2.5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 1 μL，10 μmol·L-1MM5F、MM5R 各 1 μL，TaqDNA 聚 合 酶（5 U·μL-1） 0.3μL， 模 板（細(xì)菌裂解液） 2.0 μL，ddH2O補(bǔ)足體積至25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

PCR反應(yīng)結(jié)束后，取8μL擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0% 瓊脂糖凝膠電泳檢測并記錄結(jié)果。擴(kuò)增產(chǎn)物由柱式瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收純化后與克隆載體pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化E. coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取白斑，進(jìn)行PCR鑒定，篩選出含有目標(biāo)外源片段的重組克隆，送金唯智生物科技（北京）有限公司進(jìn)行雙向序列測定。測序結(jié)果與GenBank中已登錄的細(xì)菌基因序列進(jìn)行BLAST比對。

1.5 致病性測定

選取2個(gè)已鑒定的代表性菌株在無菌栽培的番茄苗上噴霧接種測定致病性（任欣正，1994）。接種菌液濃度為1×106cfu·mL-1，噴霧接種到6～7葉期的番茄葉片上，以接種無菌水為對照，接種后的植物材料置保濕桶中保濕48 h，保持28 ℃。每天觀察發(fā)病情況，待植株發(fā)病后從病斑上再次分離病原細(xì)菌。

1.6 引物的特異性驗(yàn)證

檢測所用的番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病菌、番茄潰瘍病菌、成團(tuán)泛菌、假單胞桿菌、金黃桿菌、短小桿菌和不動(dòng)桿菌均分離自甘肅河西地區(qū)的番茄病果；分別制備所有供試細(xì)菌的裂解液為模板進(jìn)行特異性引物的PCR擴(kuò)增，以驗(yàn)證MM5F/MM5R引物的特異性。PCR擴(kuò)增體系及擴(kuò)增程序與1.4相同。

1.7 田間樣品的分子生物學(xué)鑒定

利用植物基因組提取試劑盒提取番茄發(fā)病組織總DNA，紫外分光光度計(jì)檢測所提取DNA的純度，并將DNA濃度調(diào)至約20 ng·μL-1。以此DNA為模板，用引物MM5F/MM5R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測病樣中的細(xì)菌。

2 結(jié)果與分析

2.1 病害癥狀

番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病的染病葉柄和莖產(chǎn)生黑色斑點(diǎn)，易連成斑塊，周圍無黃色暈圈（圖1-a）；染病葉片產(chǎn)生近圓形或不規(guī)則斑點(diǎn)，深褐色至黑色，周緣具黃色暈圈（圖1-b、c）；幼嫩綠果染病，初現(xiàn)稍隆起的黑褐色小斑點(diǎn)（圖1-d），隨著病害的發(fā)展，果實(shí)近成熟時(shí)，圍繞斑點(diǎn)的組織仍保持較長時(shí)間綠色，病斑不潰腐，病斑周圍黑色，中間色淺，呈黃棕色，并有輕微隆起，但病斑整體凹陷（圖1-e～i）；田間濕度大時(shí)，病斑周圍可見浸潤環(huán)，病斑上可產(chǎn)生灰白色菌膿（圖1-f）。

2.2 病菌形態(tài)特征及培養(yǎng)性狀

分離純化的9個(gè)細(xì)菌菌株革蘭氏染色陰性，菌體桿狀，無莢膜，無芽孢，大小為（0.5～1.0）μm×（1.5～5.0）μm。菌株在KB培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)2 d，形成圓形淡黃綠色菌落，菌落全緣，表面光滑，不透明，黏稠狀，菌落直徑2～3 mm。在 紫外燈下觀察產(chǎn)生黃綠色熒光。

2.3 基于16S rDNA 的鑒定和特異性分子生物學(xué)鑒定

以供試菌株裂解液為模板進(jìn)行16S rDNA 的PCR擴(kuò)增，得到約1.5 kb的PCR產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化連接后進(jìn)行雙向測序，測序結(jié)果表明，該片段長1 502 bp。將測定的序列（登錄號(hào)：JQ945223）在NCBI進(jìn)行BLAST比對，該序列與GenBank中已有P. syringaepv.tomato的16S rDNA序列同源性達(dá)99%。結(jié)合菌落、菌體形態(tài)特征、革蘭氏染色及致病性測定結(jié)果，將該菌株鑒定為丁香假單胞桿菌番茄致病變種（P. syringaepv.tomato）。

檢測引物MM5F/MM5R在分離純化的9個(gè)菌株（表1）中均擴(kuò)增出預(yù)期大小的特異性片段（圖2），隨機(jī)選取擴(kuò)增產(chǎn)物轉(zhuǎn)化連接后進(jìn)行雙向測序，所得序列與GenBank中P. syringaepv.tomato的特異性序列同源性達(dá)100%，表明9個(gè)菌株均為P. syringaepv.tomato。

2.4 致病性

供試菌株噴霧接種后第5天開始出現(xiàn)癥狀，葉片上產(chǎn)生深褐色不規(guī)則斑點(diǎn)。發(fā)病后取葉部病組織再分離，獲得菌落及革蘭氏染色特征與原純培養(yǎng)一致的細(xì)菌。

圖1 番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病自然發(fā)病癥狀

2.5 引物特異性驗(yàn)證

引物MM5F/MM5R能從供試的Pseudomonas syringaepv.tomato7個(gè)菌株中特異地?cái)U(kuò)增出一條530 bp左右的條帶，而其他供試菌株及空白對照無擴(kuò)增條帶或擴(kuò)增出非特異性條帶（表1，圖3）。表明該引物具有特異性，可以將P.syringaepv.tomato與番茄可能攜帶的其他細(xì)菌區(qū)分開。

圖2 引物MM5F/MM5R的PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.6 田間樣品的分子生物學(xué)鑒定

分別從番茄發(fā)病組織提取總DNA，用引物MM5F/MM5R 進(jìn)行PCR檢測，電泳結(jié)果顯示，所有7個(gè)病樣均產(chǎn)生清晰的特異性擴(kuò)增條帶（圖4），因此該引物對為Pseudomonas syringaepv.tomato快速檢測的特異性引物。

表1 試驗(yàn)所用細(xì)菌菌株

圖3 引物MM5F/MM5R的特異性檢測

圖4 自然感病番茄PCR檢測

3 結(jié)論與討論

番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病已在我國的部分省份和地區(qū)發(fā)現(xiàn)（馮凌云 等，2000；趙廷昌 等，2001；趙子俊 等，2001；王曉輝 等，2006；楊春泉 等，2008；李志棟，2010），為局限性發(fā)生。病菌在田間通過雨水、昆蟲、農(nóng)事操作進(jìn)行傳播（趙廷昌 等，1999），播種帶菌種子，幼苗即可發(fā)病，田間只要有10%的植株發(fā)病，就可傳播至整個(gè)地塊，造成流行。

在甘肅省，鄧剛等（2008）報(bào)道2006～2007年間張掖地區(qū)番茄大面積發(fā)生番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病類似病害，發(fā)病率達(dá)40%～100%。筆者在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，2000年12月，蘭州市紅古區(qū)一農(nóng)場的3.33 hm2日光溫室番茄中，約有2.67 hm2不同程度發(fā)生番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病類似病害；2004年11月，榆中縣和平鎮(zhèn)一農(nóng)場的1 334 m2日光溫室中，正值開花期的番茄嚴(yán)重感染細(xì)菌性斑點(diǎn)病類似病害；2011年 8月，張掖市的辣椒上也有該病害的發(fā)生。鑒于目前該病害有蔓延和加重的趨勢，為防止番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病向非疫區(qū)的傳播蔓延，應(yīng)提高對病害的識(shí)別能力，嚴(yán)格執(zhí)行檢疫措施，加強(qiáng)種子檢疫。

特異性是檢測特定病原菌所必需的條件。hrpZ基因是植物病原細(xì)菌所獨(dú)有的基因，其編碼產(chǎn)物與致病性有關(guān)（James & Alan，1997），研究表明該基因是丁香假單胞菌致病變種快速鑒定的理想分子指標(biāo)（Zaccardelli et al.，2005），引物MM5F/MM5R擴(kuò)增的目的片段是P. syringaepv.tomato的hrpZ基因。利用引物MM5F/MM5R對分離自番茄病果的16種細(xì)菌菌株進(jìn)行特異性擴(kuò)增，可從P. syringaepv.tomato中擴(kuò)增得到一條530 bp左右的條帶，而其他供試菌株無擴(kuò)增條帶或僅有非特異性條帶出現(xiàn)，驗(yàn)證了該引物具有特異性，可以將P. syringaepv.tomato與番茄可能攜帶的其他細(xì)菌區(qū)分開，可作為分子檢測的特異性引物。

與常規(guī)細(xì)菌學(xué)鑒定試驗(yàn)相比，hrpZ基因的分子鑒定具有快速、易操作、結(jié)果客觀等優(yōu)勢。利用擴(kuò)增hrpZPst基因片段的引物MM5F/MM5R，可以直接從植物組織總DNA中擴(kuò)增出番茄細(xì)菌性斑點(diǎn)病病菌的特異性條帶，能快速檢測病原細(xì)菌，便于及時(shí)對病害進(jìn)行防控。

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