芥菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究

顧祥昆 李 菲 張淑江 章時(shí)蕃 張 慧 孫日飛

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

小孢子培養(yǎng)技術(shù)是利用植物的未成熟花粉在一定誘導(dǎo)條件下改變正常的花粉發(fā)育途徑，即由配子體發(fā)育途徑轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育途徑，進(jìn)而形成胚狀體的過程。通過小孢子培養(yǎng)可獲得大量單倍體或雙單倍體植株（DH系），在純化親本、突變體篩選、遺傳研究等方面應(yīng)用廣泛。目前，該技術(shù)已經(jīng)成為育種的重要手段之一。Lichter（1982）首次報(bào)道了甘藍(lán)型油菜小孢子培養(yǎng)獲得了胚狀體再生植株；日本學(xué)者Sato等（1989）首次利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)從1個(gè)大白菜品種中得到了小孢子胚和再生植株。隨后，小孢子培養(yǎng)技術(shù)在蕓薹屬蔬菜中得到廣泛應(yīng)用，目前已經(jīng)涉及蕓薹屬的3個(gè)基本種和3個(gè)復(fù)合種（牛永超 等，2010）。

芥菜〔Brassica juncea（L.）Czern. et Coss.〕是十字花科蕓薹屬一年或二年生植物，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物。隨著消費(fèi)水平的提高，人們對(duì)芥菜品質(zhì)、產(chǎn)量等提出了更高的要求。利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)可以快速獲得純合的DH材料，大大縮短育種周期，提高育種效率，為芥菜高效優(yōu)質(zhì)育種獲得純合目標(biāo)材料提供了新的途徑。但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)芥菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)的研究較少，且主要集中在油用芥菜上，對(duì)鮮食或加工用芥菜的研究甚少，芥菜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系尚不完善。本試驗(yàn)擬通過研究基因型、熱激誘導(dǎo)條件、供體植株生長(zhǎng)條件對(duì)芥菜小孢子培養(yǎng)的影響，探討適宜芥菜小孢子培養(yǎng)的主要條件，為完善芥菜小孢子培養(yǎng)技術(shù)體系、提高胚胎誘導(dǎo)率奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取12份不同基因型的芥菜栽培種為試驗(yàn)材料（表1），分屬于葉用芥菜、莖用芥菜、根用芥菜3個(gè)變種，均由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供。2011年1月播種于本所玻璃溫室內(nèi)，常規(guī)管理，3月初定植于日光溫室，4～6月初取蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)。

表1 供試芥菜品種名稱及類型

1.2 方法

1.2.1 芥菜游離小孢子提取和培養(yǎng) 早上8：00～9：00取材，在顯微鏡下對(duì)不同基因型不同長(zhǎng)度的芥菜花蕾進(jìn)行鏡檢，確定大部分小孢子處于單核靠邊期時(shí)所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度，進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)。

用75%的酒精消毒花蕾30 s，再用8%次氯酸鈉溶液消毒15 min，無(wú)菌水沖洗3次，每次1 min。將無(wú)菌花蕾置于消毒研缽中，并加入一定量的B5洗滌培養(yǎng)液，擠壓花蕾，分離小孢子，用300目消毒濾網(wǎng)過濾，收集濾液于10 mL離心管中，離心3次，轉(zhuǎn)速為1 200 r·min-1，每次4 min，之后棄上清液，用NLN-13培養(yǎng)基制成小孢子懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)節(jié)小孢子密度為8×104～1×105個(gè)·mL-1。將其分裝于直徑為60 mm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿中倒入約4 mL，用封口膜封口。

根據(jù)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將分裝好的小孢子懸浮液置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行熱激誘導(dǎo)后，轉(zhuǎn)入25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)暗培養(yǎng)，至胚狀體出現(xiàn)。培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計(jì)小孢子出胚數(shù)目。

1.2.2 花粉發(fā)育時(shí)期的熒光顯微觀察 以A12959、V03B0097、V03C0021為試材，在生長(zhǎng)健壯的植株花序上選取不同長(zhǎng)度的花蕾進(jìn)行DAPI染色觀察，染色液的配制參照李菲（2006）的方法。將不同長(zhǎng)度花蕾中的花藥剝離出來，取2～3個(gè)花藥置于載玻片上，并滴1～2滴DAPI染液，用鑷子擠壓花藥，使小孢子分離出來，剔除花藥殘片，蓋上蓋玻片并烤片。室溫下暗處理15 min后置于熒光顯微鏡下觀察、照相，并記錄處于不同發(fā)育時(shí)期的小孢子外部形態(tài)。

1.2.3 單核靠邊期與花蕾長(zhǎng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系 根據(jù)DAPI染色結(jié)果，得知處于不同時(shí)期的小孢子外部形態(tài)。將12份芥菜品種不同長(zhǎng)度花蕾中的花藥剝離出來，取2～3個(gè)花藥置于載玻片上，滴1～2滴清水，用鑷子擠壓花藥，使小孢子分離出來，剔除花藥殘片，蓋上蓋玻片，置于顯微鏡下觀察小孢子的外部形態(tài)，測(cè)量大部分小孢子處于單核靠邊期時(shí)對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度并記錄。

1.2.4 小孢子發(fā)育過程的形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)小孢子，每天于倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.5 熱激誘導(dǎo)條件 設(shè)置3個(gè)熱激溫度：32、33、35 ℃，并分別處理1、2、3 d，熱激后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中靜止暗培養(yǎng)。以25 ℃暗培養(yǎng)為對(duì)照。培養(yǎng)25 d后統(tǒng)計(jì)小孢子出胚數(shù)目，計(jì)算出胚率。

1.2.6 供體植株生長(zhǎng)條件 以A12959、V03B0097、V03C0021為試材，分3個(gè)不同播期播種，常規(guī)栽培管理，使每批材料抽薹開花的日期分別為4月底～5月初、5月底～6月初、6月底～7月初。取材進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)的熱激處理?xiàng)l件為35 ℃、3 d。對(duì) 比不同生長(zhǎng)溫度下供體植株的出胚狀況，探討供體植株生長(zhǎng)條件對(duì)芥菜小孢子培養(yǎng)的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育時(shí)期花粉的DAPI染色觀察

對(duì)不同發(fā)育時(shí)期的花粉進(jìn)行DAPI染色并進(jìn)行細(xì)胞學(xué)觀察，結(jié)果見圖1。芥菜小孢子發(fā)育過程為四分體時(shí)期→單核中期→單核靠邊期→雙核期→三核期。

四分體時(shí)期（圖1-a）：小孢子母細(xì)胞經(jīng)減數(shù)分裂后會(huì)形成4個(gè)子細(xì)胞粘連在一起的時(shí)期，稱為四分體時(shí)期，經(jīng)熒光染色后有4個(gè)核出現(xiàn)。此時(shí)小孢子的外部形態(tài)呈明顯的四裂狀。單核中期（圖1-b）：小孢子的核只有1個(gè)且處于細(xì)胞中間。此時(shí)小孢子的外部形態(tài)呈近圓形，三棱形初步顯露但不是很明顯。單核靠邊期（圖1-c）：細(xì)胞核處于細(xì)胞的邊緣處，靠近細(xì)胞壁。小孢子的外部形態(tài)呈明顯的三棱形，可以看見有3條萌發(fā)溝，并且從總體上看，單核靠邊期的小孢子要比單核中期的小孢子體積要大。雙核期（圖1-d）：小孢子經(jīng)第一次有絲分裂在胞壁內(nèi)形成營(yíng)養(yǎng)核和生殖核，其中營(yíng)養(yǎng)核染色較淺，生殖核染色較深。此時(shí)小孢子的外部形態(tài)呈圓形。三核期（圖1-e）：隨著小孢子的繼續(xù)發(fā)育，生殖核分裂為2個(gè)精子，此時(shí)小孢子內(nèi)有3個(gè)核，即1個(gè)營(yíng)養(yǎng)核和2個(gè)精子核。精子核較小，營(yíng)養(yǎng)核較大。此時(shí)小孢子的外部形態(tài)呈近圓形至橢圓形。由DAPI染色結(jié)果可知：小孢子隨著不斷地生長(zhǎng)發(fā)育，細(xì)胞體積不斷增大。處于單核靠邊期的小孢子可見明顯的3條萌發(fā)溝，呈三棱形，可作為單核靠邊期的形態(tài)指標(biāo)。

2.2 小孢子處于單核靠邊期所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度

對(duì)于芥菜，適于培養(yǎng)的小孢子發(fā)育時(shí)期一般是單核靠邊期。劉冬等（1997）以芥菜為試材進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，結(jié)果顯示單核晚期的小孢子培養(yǎng)效果最好。Prem等（2005）選取單核晚期占較大比例的花蕾進(jìn)行小孢子培養(yǎng)，培養(yǎng)效果較好。

對(duì)供試的12份芥菜材料的不同長(zhǎng)度花蕾中的小孢子進(jìn)行鏡檢，依據(jù)單核靠邊期小孢子的細(xì)胞學(xué)特征，找出大部分小孢子處于單核靠邊期所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度，即為適宜小孢子培養(yǎng)的花蕾長(zhǎng)度。從表2可以看出，除了南平大頭芥（V03B0001）小孢子單核靠邊期所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度是3.0～3.5 mm外，其余芥菜材料小孢子單核靠邊期所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度為2.0～3.0 mm。但不同基因型的芥菜材料，其小孢子單核靠邊期所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度也有所不同。如包心芥（A12959）的小孢子單核靠邊期所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度為2.5～3.0 mm，而兒菜（V03B0109）的小孢子單核靠邊期所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度為2.0～2.5 mm。在實(shí)際應(yīng)用中，應(yīng)根據(jù)基因型選擇適宜長(zhǎng)度的花蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，在分離提取小孢子之前用顯微鏡快速鏡檢，找到大部分小孢子為三棱形時(shí)所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度即為適宜的花蕾長(zhǎng)度。

圖1 不同發(fā)育時(shí)期芥菜小孢子的DAPI熒光染色結(jié)果（10×20）

表2 不同基因型芥菜小孢子單核靠邊期所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度

2.3 小孢子培養(yǎng)過程中的細(xì)胞學(xué)觀察

在小孢子培養(yǎng)過程中，用倒置顯微鏡觀察小孢子各個(gè)發(fā)育時(shí)期的形態(tài)。經(jīng)熱激處理24 h后，部分小孢子明顯膨大，細(xì)胞呈圓球形，細(xì)胞直徑增大到原來的2～3倍（圖2-a）；3 d后，部分膨大的小孢子發(fā)生第一次分裂，大部分為均等分裂（圖2-b），也有極個(gè)別的為不均等分裂（圖2-c），不均等分裂的小孢子一般不能發(fā)育成胚；5 d后，較多的小孢子發(fā)生第二次均等分裂（圖2-d）；7 d后，可觀察到分裂多次的細(xì)胞團(tuán)（圖2-e）；9 d后，可觀察到球形幼胚（圖2-f）；第10～11天時(shí)，可觀察到球形胚（圖2-g）和心形胚（圖2-h），第12～15天時(shí)，可觀察到魚雷形胚和子葉形胚（圖2-i，j，k）。

此外，還觀察到不同基因型芥菜的小孢子胚胎發(fā)生均具有不同步性，在1個(gè)培養(yǎng)皿中可以同時(shí)觀察到球形胚、心形胚、魚雷形胚和子葉形胚并存（圖2-l）。

2.4 熱激條件對(duì)芥菜小孢子出胚率的影響

圖2 芥菜小孢子離體發(fā)育過程

表3 不同熱激條件對(duì)芥菜小孢子出胚率的影響

從表3可以看出，V03B0012和B92975-201在35 ℃、2 d的熱激處理下出胚率較高，V03C0021在35 ℃、1 d的熱激處理下出胚率較高，其余6份出胚的芥菜材料均在35 ℃、3 d的熱激條件下產(chǎn)胚量最多?？傮w來說，35℃、3 d是本試驗(yàn)條件下大多數(shù)芥菜材料小孢子培養(yǎng)較為適宜的熱激誘導(dǎo)條件。

表4 不同基因型對(duì)芥菜小孢子出胚率的影響

2.5 基因型對(duì)芥菜小孢子胚產(chǎn)量的影響

由表4可見，供試的12份芥菜材料中有9份誘導(dǎo)出胚，其中V03B0097和A12959出胚率較高，達(dá)5.87胚·蕾-1和5.54胚·蕾-1；A12960、V03C0001、V03B0012、V03B0109、V03A0223、B92975-201的出胚率相對(duì)較低，均在0.5胚·蕾-1以下；而V03A0235、V03B0001、V03C0004很難誘導(dǎo)出胚。由此可見，不同基因型的芥菜小孢子胚胎發(fā)生能力有很大的差異，基因型是影響芥菜小孢子培養(yǎng)成功與否的重要因素。

2.6 供體植株生長(zhǎng)條件對(duì)芥菜小孢子培養(yǎng)的影響

為探討不同溫度條件下生長(zhǎng)的供體植株對(duì)芥菜小孢子培養(yǎng)的影響，本試驗(yàn)以A12959、V03B0097、V03C0021為試材，分3批播種，常規(guī)栽培管理，每批材料抽薹開花的日期分別為4月底～5月初、5月底～6月初、6月底～7月初，取材進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，并統(tǒng)計(jì)同種材料在不同抽薹開花日期的出胚情況。4月底～5月初平均氣溫為25.7 ℃/14.25 ℃（平均最高氣溫/平均最低氣溫，下同），5月底～6月初為29.8 ℃/17.95 ℃，6月底～7月初為30.25 ℃/21.95 ℃。結(jié)果顯示：只有4月底～5月初抽薹開花的材料進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)后可誘導(dǎo)出胚，其余兩批材料均沒有誘導(dǎo)成胚?？梢?，供體植株的生長(zhǎng)溫度對(duì)芥菜小孢子培養(yǎng)有較大的影響。在運(yùn)用小孢子培養(yǎng)技術(shù)時(shí)，應(yīng)盡量確保供體植株處于較低的溫度環(huán)境中生長(zhǎng)。但由于本試驗(yàn)沒有進(jìn)行多年多點(diǎn)重復(fù)試驗(yàn)，還需進(jìn)一步設(shè)計(jì)詳細(xì)的試驗(yàn)進(jìn)行研究。

2.7 芥菜小孢子胚狀體的繼代培養(yǎng)

將培養(yǎng)25 d后的胚狀體（圖3-a）轉(zhuǎn)接到B5固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，待胚狀體萌發(fā)分化后轉(zhuǎn)接到MS培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)（圖3-b），大部分的子葉形胚均能正常發(fā)育、分化，并形成健全的植株（圖3-c），而球形胚、心形胚和魚雷形胚均褐化死亡。表明幼期胚狀體不容易成活，子葉形胚易于進(jìn)行繼代培養(yǎng)。為了使更多的胚狀體得以應(yīng)用，還需要進(jìn)一步探究繼代培養(yǎng)中各種條件對(duì)胚狀體發(fā)育的影響，以優(yōu)化芥菜繼代培養(yǎng)體系。

圖3 芥菜小孢子胚狀體的萌發(fā)與植株再生

3 結(jié)論與討論

在游離小孢子培養(yǎng)中，小孢子發(fā)育時(shí)期與誘導(dǎo)胚胎發(fā)生能力密切相關(guān)，選擇合適發(fā)育時(shí)期的小孢子至關(guān)重要。對(duì)于芥菜，單核靠邊期的小孢子易于誘導(dǎo)啟動(dòng)胚狀體發(fā)生途徑（劉冬 等，1997；Prem et al.，2005）。本試驗(yàn)采用DAPI染色法確定了單核靠邊期小孢子的細(xì)胞形態(tài)，對(duì)12份芥菜材料不同長(zhǎng)度花蕾的小孢子進(jìn)行顯微觀察，找到了單核靠邊期的小孢子所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度。三棱形是單核靠邊期小孢子最為明顯的細(xì)胞學(xué)形態(tài)特征，可以作為此發(fā)育時(shí)期的形態(tài)學(xué)標(biāo)志。本試驗(yàn)選取的12份芥菜小孢子處于單核靠邊期所對(duì)應(yīng)的花蕾長(zhǎng)度主要在2～3 mm的范圍內(nèi)，但適宜的花蕾長(zhǎng)度隨基因型的不同而有差異，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)根據(jù)基因型確定適宜長(zhǎng)度的花蕾進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)。

很多作物小孢子培養(yǎng)過程中，高溫?zé)峒な钦T導(dǎo)小孢子胚胎發(fā)生的關(guān)鍵步驟。其作用機(jī)理是通過脅迫改變小孢子的發(fā)育途徑，阻止小孢子向成熟花粉粒方向發(fā)展，促進(jìn)其沿胚胎發(fā)育途徑發(fā)展，最后形成小孢子胚（栗根義 等，1993a，1993b）。目前高溫?zé)峒ぬ幚硪呀?jīng)廣泛地運(yùn)用于十字花科作物小孢子培養(yǎng)中。芥菜小孢子培養(yǎng)同樣需要熱激誘導(dǎo)，但目前所采用的熱激條件各有不同，難以統(tǒng)一。劉冬等（1997）的研究中只有在33 ℃、3 d熱激處理下有芥菜小孢子胚形成；牛永超等（2010）認(rèn)為32 ℃、5 d熱激處理對(duì)大多數(shù)芥菜小孢子再生成胚狀體較為有效；Hiramatsu等（1995）對(duì)24份葉用芥菜材料進(jìn)行游離小孢子培養(yǎng)，采用的熱激條件為32.5 ℃、1～3 d，只有7份材料出胚，對(duì)于出胚情況最好的Hsueh Li Hung來說，最佳的熱激條件是32.5 ℃、2 d；Pradeep等（2006）的研究表明35 ℃、2 d的熱激條件最好，比32、33 ℃處理2 d后的產(chǎn)胚量高10～15倍。本試驗(yàn)探究了熱激溫度和熱激天數(shù)對(duì)12份芥菜小孢子培養(yǎng)的影響，35 ℃、3 d是大多數(shù)材料較為適宜的熱激條件。這與Pradeep等（2006）的研究結(jié)果較為一致。為了進(jìn)一步確定適于芥菜小孢子培養(yǎng)的熱激條件，今后還需要增加芥菜基因型的種類和數(shù)量進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證。

目前，小孢子培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于蕓薹屬的很多作物中，在探究大白菜（曹鳴慶 等，1993；栗根義 等，1993a；趙俊 等，2008）、甘藍(lán)型油菜（余鳳群和劉后利，1995；王漢中 等，2004）、花椰菜（張曉芬 等，2005；趙前程 等，2007）、蘿卜（張麗，2004）等小孢子培養(yǎng)的影響因素試驗(yàn)中，基因型仍是決定小孢子培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素。在本試驗(yàn)中，基因型亦是影響芥菜小孢子培養(yǎng)的關(guān)鍵因素，這與前人的研究結(jié)果相同（Hiramatsu et al.，1995；Agnihotri et al.，1996；Lionneton et al.，2001；Prem et al.，2005；Deepak et al.，2008；牛永超 等，2010），不同基因型芥菜的小孢子胚胎發(fā)生能力有很大的差異。

在探討基因型對(duì)芥菜小孢子胚產(chǎn)量的影響時(shí)，本試驗(yàn)綜合了所有條件下的出胚情況進(jìn)行探討。因?yàn)榻娌说倪z傳背景較為復(fù)雜，可能存在較多的內(nèi)在因素影響芥菜小孢子胚胎發(fā)生能力，沒有較為統(tǒng)一的熱激條件。本試驗(yàn)中，雖然35 ℃、3 d的熱激條件對(duì)大多數(shù)芥菜材料而言是較為適宜的誘導(dǎo)條件，但并不是對(duì)所有的基因型都適用，有的在其他熱激條件下出胚的材料在35 ℃、3 d熱激后并不出胚。如V03B0097和A12959在任何熱激條件下均能誘導(dǎo)出胚，是易出胚材料；而B92975-201只有在35 ℃熱激2 d后有胚狀體發(fā)生，V03C0004、V03B0001和V03A0235在任何熱激條件下均不能誘導(dǎo)出胚，由此表現(xiàn)出基因型差異。此外，本試驗(yàn)所用的基因型較少，很可能隨著基因型的增加，會(huì)表現(xiàn)出依賴于基因型的熱激條件多樣性，因此需要考慮在一定熱激條件范圍內(nèi)的出胚總體情況進(jìn)行基因型影響的探討。今后也應(yīng)當(dāng)增加芥菜的種類和數(shù)量作進(jìn)一步的研究。

本試驗(yàn)也初步探究了供體植株生長(zhǎng)條件尤其是溫度條件對(duì)芥菜小孢子培養(yǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)4月底～5月初抽薹開花的材料小孢子易于誘導(dǎo)出胚，說明供體植株在較低的溫度環(huán)境下生長(zhǎng)有利于小孢子培養(yǎng)。在常規(guī)栽培管理中，應(yīng)盡量使芥菜抽薹開花時(shí)的氣溫相對(duì)較低。

曹鳴慶，李巖，劉凡．1993．基因型和供體植株生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)大白菜游離小孢子胚胎發(fā)生的影響．華北農(nóng)學(xué)報(bào)，8（4）：1-6．

栗根義，高睦槍，趙秀山．1993a．大白菜游離小孢子培養(yǎng)．園藝學(xué)報(bào)，20（2）：167-170.

栗根義，高睦槍，趙秀山．1993b．高溫預(yù)處理對(duì)大白菜游離小孢子培養(yǎng)的效果（簡(jiǎn)報(bào)）．實(shí)驗(yàn)生物學(xué)報(bào)，26（2）：165-166.

李菲．2006．大白菜游離小孢子培養(yǎng)及其胚胎發(fā)生和加倍機(jī)理的研究〔碩士論文〕．北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院．

劉冬，郭平仲，劉凡，李巖，曹鳴慶．1997．芥菜（Brassica junceaL.）小孢子胚發(fā)生和植株再生．首都師范大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，18（1）：76-81.

牛永超，李加納，殷家明，林吶，徐新福，韓甫，周清元．2010．基因型和處理溫度對(duì)芥菜型油菜游離小孢子培養(yǎng)的影響．西南大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，32（8）：23-28.

王漢中，王新發(fā)，劉貴華，鄭元本，楊慶．2004．甘藍(lán)型雜交油菜親本的小孢子培養(yǎng)技術(shù)研究．中國(guó)油料作物學(xué)報(bào)，26（1）：1-4.

余鳳群，劉后利．1995．供體材料和培養(yǎng)基成份對(duì)甘藍(lán)型油菜小孢子胚狀體產(chǎn)量的影響．華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，14（4）：327-332.

張麗．2004．蘿卜游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)初探．園藝學(xué)報(bào)，34（5）：676-678.

張曉芬，王曉武，張延國(guó)，劉運(yùn)霞，王永清．2005．花椰菜游離小孢子培養(yǎng)再生植株研究．中國(guó)蔬菜，（1）：16-17.

趙俊，巫東堂，趙軍良，董曉飛，趙美華，王秀英，李改珍．2008．影響大白菜游離小孢子培養(yǎng)若干因素的研究．山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，36（8）：26-28.

趙前程，吉立柱，蔡榮旗，劉莉莉，佟志強(qiáng)，孫德嶺．2007．花椰菜游離小孢子培養(yǎng)及植株再生研究．華北農(nóng)學(xué)報(bào)，22（6）：65-68.

Agnihotri A，Seguin-Swartz G，Downey R K．1996． Microspore embryogenesis inB. juncea//Pareek L K．ed．Trends in plant tissue culture and biotechnology．Rajasthan：Agrobotanical Publishers：218-221．

Deepak P，Kadambari G，Gautam S，Abha A．2008．Activated charcoal induced high frequency microspore embryogenesis and efficient doubled haploid production inBrassica juncea．Plant Cell Tissue and Organ Culture，93（3）：269-282.

Hiramatsu M，Odahara K，Matsue Y．1995．A survey of microspore embryogenesis in leaf mustard （Brassica juncea）．Acta Hort，392：139-145.

Lichter R．1982．Induction of haploid plants from isolated pollen ofBrassica napus．Z Pflanzenphysiol，105：427-434.

Lionneton E，Beuret W，Delaitre C，Ochatt S，Rancillae M．2001．Improved microspore culture and doubled haploid plant regeneration in the brown condiment mustard（B. juncea）．Plant Cell Rep，20：126-130．

Pradeep K A，Parinita A，Jan B M C，Liu C M，Bhojwani S S．2006．PCIB an antiauxin enhances microspore embryogenesis in microspore culture ofBrassica juncea．Plant Cell Tissue and Organ Culture，86（2）：201-210.

Prem D，Gupta K，Agnihotri A．2005．Effect of various exogenous and endogenous factors on microspore embryogenesis in Indian mustard〔Brassica juncea（L.）Czern and Coss.〕．In Vitro Cell Dev Biol Plant，41：266-273．

Sato T，Nishio T，Hirai M．1989．Plant regeneration from isolated microspore cultures of Chinese cabbage （Brassica campestrisssp.pekinensis）．Plant Cell Rep，8：486-488．