甘蔗胚性愈傷組織的誘導(dǎo)和抗褐化研究

吳轉(zhuǎn)娣 ，趙 俊 ，劉家勇 ，陳學(xué)寬 ，楊 昆 ，趙培方 ，李純佳 ，吳才文

（1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所，開遠(yuǎn) 616699；2.云南省甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗室，開遠(yuǎn) 616699；3.云南云蔗科技開發(fā)有限公司，開遠(yuǎn) 616600）

甘蔗是我國最主要的糖料作物，對發(fā)展國民經(jīng)濟(jì)有十分重要的意義[1－2]?？购祻?qiáng)宿根高產(chǎn)高糖甘蔗新品種的選育對甘蔗糖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展尤為重要?！笆晃濉币詠?，云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所先后選育并推出了云蔗06-407、云蔗03-194、云蔗03-258和云蔗05-51等多個強(qiáng)宿根、高產(chǎn)高糖、抗旱性強(qiáng)的甘蔗新品種。甘蔗組織培養(yǎng)是提高甘蔗繁育效率，降低繁種成本的重要手段，并被廣泛應(yīng)用于研究甘蔗生理、甘蔗快繁、甘蔗突變體育種、病毒去除以及甘蔗轉(zhuǎn)基因研究等。基于甘蔗不同基因型品種之間的組織培養(yǎng)體系存在較大的差異，本研究以云蔗06-407、云蔗03-194、云蔗03-258和云蔗05-51為研究材料開展組培快繁研究，旨在研究建立甘蔗新品種（系）的組織培養(yǎng)體系，加快甘蔗新品種的繁殖速度，為蔗區(qū)提供充足的種苗來源，加快其在蔗區(qū)的推廣應(yīng)用與成果轉(zhuǎn)化。

甘蔗組織培養(yǎng)受到諸多因素的影響。首先，基因型是影響組織培養(yǎng)重要因素之一，不同材料，其培養(yǎng)能力不同。梁計南等[3]認(rèn)為不同基因型甘蔗在同樣的培養(yǎng)條件下，外植體的褐變率、愈傷組織的誘導(dǎo)率、增殖率、分化率都表現(xiàn)出顯著的差異。黃惠芳等[4]在甘蔗組織培養(yǎng)研究中提出2，4-D是甘蔗愈傷組織誘導(dǎo)中最常用也是效果最好的激素。甘蔗愈傷組織可以在僅含2，4-D的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)形成；愈傷組織轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)可形成再生植株[5]。本研究為探索誘導(dǎo)4個不同甘蔗品種產(chǎn)生胚性愈傷組織的最佳2，4-D濃度，使之能夠誘導(dǎo)出較好胚性愈傷組織，為甘蔗的組培快繁和甘蔗轉(zhuǎn)基因研究提供科學(xué)依據(jù)。

甘蔗是一種含多元酚類物質(zhì)較高的作物，尤其是幼嫩莖和嫩葉鞘含量較高。顧之中等[6]報道在培養(yǎng)基中添加500mg/L脯氨酸能降低愈傷組織褐變死亡率；陳彪等[7]利用乙烯吡咯烷酮（PVP）做預(yù)處理或作為附加物添加到培養(yǎng)基中防止甘蔗組織培養(yǎng)褐變；秦新民[8]等在培養(yǎng)基中添加抗壞血酸等物質(zhì)，在減輕酚污染上取得了一定成效。本研究擬探討有效防止甘蔗組織褐化方法，建立高效甘蔗組織培養(yǎng)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

云蔗06-407、云蔗03-194、云蔗03-258及云蔗05-51材料采自云南省農(nóng)科院甘蔗研究所所內(nèi)基地。

1.2 方法

1.2.1 愈傷誘導(dǎo)試驗設(shè)計 從田間選取露節(jié)生長健壯、無病蟲害的甘蔗尾鞘約30cm，剝?nèi)ゲ糠掷先~，經(jīng)75%酒精表面消毒后，再剝?nèi)「收犴敹松L點(diǎn)處的幼嫩葉片組織作為外植體。將外植體切成約1mm的薄片，接種于 5個不同處理的培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基的配方為 MS+蔗糖 30g/L+2，4-D（0.5、1.0、1.5、2.0和 2.5mg/L）+卡拉膠8g/L+活性炭0.2g/L，pH5.8。

每個培養(yǎng)皿可接入16～20片，3皿為1個重復(fù)，每個濃度設(shè)置4個重復(fù)，于25℃下恒溫暗培養(yǎng)。

1.2.2 抗褐變試驗方法 以甘蔗03-258為試驗材料，按照1.2.1的方法將甘蔗幼嫩葉切片接種于以下培養(yǎng)基中，每個培養(yǎng)皿接入16～20片，3皿甘蔗為1個重復(fù)，設(shè)4個重復(fù)。培養(yǎng)基配方見表1，其中，無添加培養(yǎng)基A作為對照，于25℃進(jìn)行恒溫暗培養(yǎng)。計算6種不同培養(yǎng)基中03-258材料的誘導(dǎo)率。

1.2.3 觀察、記錄與計算 以上每5d觀察并記錄各處理的愈傷組織誘導(dǎo)的情況。25d記錄外植體誘導(dǎo)愈傷組織生長狀況，并統(tǒng)計誘導(dǎo)率。誘導(dǎo)率計算方法：誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種數(shù)×100%。

對誘導(dǎo)出愈傷組織的質(zhì)量進(jìn)行分級，即分為-級和+級：

-級：稍有生長或長勢一般，愈傷組織較小，半透明，愈傷組織松軟、粘糊狀，這類愈傷組織分化出苗率低，不具有胚性能力，無利用價值。

+級：長勢較好，愈傷組織較大且色淡黃、質(zhì)致密，表面光滑，此類愈傷組織叫胚性愈傷組織，具有很好的利用價值。

胚性愈傷組織的獲得率=+級胚性愈傷組織數(shù)/誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)×100%。

表1 甘蔗03-258抗褐變培養(yǎng)配方

2 結(jié)果與分析

2.1 2，4-D對愈傷組織的影響

2.1.1 2，4-D對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響 以心葉作為外植體，在5個不同2，4-D濃度下誘導(dǎo)愈傷組織。接種5d左右觀察外植體圓片開始膨大，周邊開始產(chǎn)生顆粒狀的白色愈傷組織，培養(yǎng)7d后看到明顯的愈傷組織團(tuán)狀物，此時的團(tuán)狀物幾乎布滿整個外植體圓片。

試驗結(jié)果表明：平均誘導(dǎo)率較高的是云蔗03-194、云蔗05-51和云蔗06-407分別達(dá)59.2%、58.4%和57.3%，而平均誘導(dǎo)率較低的是云蔗03-258，只達(dá)到20.3%（見表2）；

表2 不同基因型、不同濃度2,4-D對愈傷組織及胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

通過雙因素方差分析結(jié)果表明：云蔗06-407、云蔗05-51和云蔗03-194三個品種的愈傷誘導(dǎo)率沒有顯著性差異，而云蔗03-258的誘導(dǎo)率顯著低于其它3個品種。云蔗06-407、云蔗03-194、云蔗05-51在不同2，4-D濃度中胚性愈傷組織生長存在差異，最適合它們生長的2，4-D濃度分別為2.0、1.0、1.5mg/L。

通過雙因素方差分析結(jié)果表明：這3個品種在2，4-D濃度為1.0、1.5和2.0 mg/L的MS培養(yǎng)基中生長沒有顯著性差異。而在2，4-D濃度為0.5和2.5 mg/L的MS培養(yǎng)基中存在顯著性差異。也就是說2，4-D濃度為0.5和2.5 mg/L的MS培養(yǎng)基不適于這4個甘蔗品種愈傷組織的生長。

2.1.2 2，4-D對愈傷組織生長狀態(tài)及質(zhì)量的影響 不同2，4-D濃度對愈傷組織發(fā)生速度有不同的影響，誘導(dǎo)形成的愈傷組織塊性狀差異也很大。從表2中可見，較高或較低兩個處理中+級胚性愈傷組織所占比例較少，當(dāng)2，4-D濃度在1.0～2.0mg/L時誘導(dǎo)率較高，+級的胚性愈傷組織較多。云蔗03-194和云蔗05-51在2，4-D濃度為1.0mg/L時，胚性愈傷組織的質(zhì)量最好，云蔗06-407則在1.5mg/L 2，4-D的培養(yǎng)基中，獲得的胚性愈傷質(zhì)量最好。云蔗05-51在2，4-D濃度為1.5mg/L時，誘導(dǎo)率最高，但是在1.0mg/L 2，4-D培養(yǎng)基中獲得質(zhì)量最好的愈傷組織。在低濃度下獲得最好質(zhì)量的愈傷組織，可以有效地減少變異，因此，我們認(rèn)為最適合云蔗05-51的誘導(dǎo)培養(yǎng)的2，4-D濃度為1.0mg/L。

雙因素方差分析結(jié)果表明：云蔗03-258與另外3個品種存在顯著性差異，但未達(dá)到極顯著水平。4個甘蔗品種在2，4-D為1.0、1.5、2.0mg/L三個濃度下不存在顯著性差異，但1.0 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基中4個甘蔗品種均獲得質(zhì)量較好的胚性愈傷組織。

2.2 不同處理對云蔗03-258胚性愈傷組織的影響

2.2.1 對胚性愈傷組織誘導(dǎo)率的影響 在培養(yǎng)基中添加活性炭、PVP、Vc、脯氨酸以及采用液體培養(yǎng)方式進(jìn)行甘蔗抗褐化實(shí)驗，均能降低愈傷組織褐變。效果最好的是添加了活性炭的培養(yǎng)基B，其誘導(dǎo)率達(dá)到65.3%，+級的胚性愈傷組織達(dá)到83.5%；添加PVP的培養(yǎng)基C誘導(dǎo)率為62.5%，+級的胚性愈傷組織達(dá)到82.1%。

表3結(jié)果表明：培養(yǎng)基中添加活性炭和PVP對云蔗03-258胚性愈傷組織誘導(dǎo)率效果顯著高于其它培養(yǎng)基，培養(yǎng)基添加Vc、脯氨酸和液體培養(yǎng)方式對胚性愈傷組織誘導(dǎo)率效果顯著高于不添加抗褐化劑的培養(yǎng)基；而培養(yǎng)基中添加Vc、脯氨酸和液體培養(yǎng)方式對云蔗03-258愈傷組織誘導(dǎo)率效果差異不顯著。

2.2.2 對胚性愈傷組織質(zhì)量誘導(dǎo)的影響 經(jīng)雙因素方差分析表明：培養(yǎng)基中添加活性炭和PVP對云蔗03-258愈傷組織質(zhì)量誘導(dǎo)的影響效果極顯著高于其它4種培養(yǎng)方式；培養(yǎng)基添加脯氨酸和液體培養(yǎng)方式顯著高于在培養(yǎng)基中添加Vc和無添加培養(yǎng)基。

綜上所述：在培養(yǎng)基中添加活性炭和PVP對減輕外植體的褐變較為有效。

表3 不同處理胚性愈傷組織誘導(dǎo)率

3 結(jié)論與討論

為了加快甘蔗新品種的推廣和應(yīng)用，對甘蔗新品種做高效的組織培養(yǎng)方法是很有必要的。生長素類似物2，4-D在不同濃度下對甘蔗胚性愈傷組織的誘導(dǎo)效果有明顯差異，在濃度適合的條件下，甘蔗胚性愈傷組織生長良好。不同基因型甘蔗品種對2，4-D濃度的要求均不同，因此在大量繁殖過程中，應(yīng)針對品種篩選出適宜的2，4-D濃度。在獲得相近的誘導(dǎo)效果時，以低濃度為好，這樣可以減少變異的發(fā)生。實(shí)驗結(jié)果表明：云蔗06-407宜采用1.5mg/L 2，4-D，云蔗03-194、云蔗03-258及云蔗05-51則適宜采用1.0mg/L 2，4-D。

云蔗03-258褐變比較嚴(yán)重，最高誘導(dǎo)率只達(dá)到29.1%，+級的胚性愈傷組織誘導(dǎo)率只有52.9%。試驗結(jié)果表明，添加活性炭2g/L或1mg/L PVP可以有效地提高云蔗03-258的愈傷誘導(dǎo)率。

在甘蔗組培苗生產(chǎn)過程中，大多要向培養(yǎng)基中添加抗褐化劑，而以PVP和活性炭使用最多，效果也較好。這兩種試劑成本低廉，方便操作，適用于工廠化育苗。

[1]輕工業(yè)部甘蔗糖業(yè)科學(xué)研究所，廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院.中國甘蔗栽培學(xué)[M].北京：農(nóng)業(yè)出版社，1985.

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