上海市某結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院結(jié)核病房空氣樣本中分枝桿菌的檢測(cè)

江淵 劉輊彬 桂曉虹 沈鑫 張忠順 肖和平 梅建

肺結(jié)核是嚴(yán)重危害公眾健康的呼吸系統(tǒng)傳染病之一，結(jié)核病定點(diǎn)醫(yī)院是結(jié)核病患者集中診斷、治療和康復(fù)的場(chǎng)所，其空氣質(zhì)量關(guān)系著患者及醫(yī)務(wù)人員的身心健康［1］。為了解痰涂片抗酸桿菌陽(yáng)性患者病房空氣中是否存在結(jié)核分枝桿菌，筆者對(duì)上海市某結(jié)核病患者定點(diǎn)收治醫(yī)院結(jié)核病房中的空氣樣本進(jìn)行了分枝桿菌的檢測(cè)和鑒定，為預(yù)防醫(yī)院內(nèi)感染、控制和管理提供客觀的事實(shí)依據(jù)，以減少醫(yī)院感染的發(fā)生。

材料和方法

一、材料和試劑

1．空氣樣本來(lái)源：采集2009年6—10月間上海市某結(jié)核病患者定點(diǎn)收治醫(yī)院22間結(jié)核病房中空氣樣本134份，均在痰涂片抗酸桿菌陽(yáng)性（＋～＋＋＋＋）患者床邊采集。每間病房均有4張床位，每間病房的空間布局相同但患者組成情況不完全相同。床邊采樣患者入院時(shí)的臨床診斷均為痰菌陽(yáng)性的肺結(jié)核，入院后根據(jù)痰培養(yǎng)及菌種鑒定結(jié)果診斷為：肺結(jié)核或者非結(jié)核分枝桿菌病。這22間病房同期收住的其他患者分別為肺結(jié)核（50%左右）、結(jié)核性胸膜炎（20%左右）、肺癌（10%左右）、肺炎（10%左右），其余為非結(jié)核分枝桿菌病、陳舊性肺結(jié)核和結(jié)核性腦膜炎患者。診斷依據(jù)參照中華醫(yī)學(xué)會(huì)《臨床診療指南：結(jié)核病分冊(cè)》［2］及其他呼吸系統(tǒng)疾病的臨床診療指南（中華醫(yī)學(xué)會(huì)叢書）。采樣時(shí)間為患者入院當(dāng)天或第二天（患者入院后24h內(nèi)），在醫(yī)院對(duì)患者進(jìn)行抗結(jié)核治療前進(jìn)行采樣，采樣時(shí)門窗關(guān)閉。

2．主要儀器和試劑：液體撞擊式微生物氣溶膠采樣器（FA－1型撞擊式空氣微生物采樣器）為遼陽(yáng)市康潔儀器研究所產(chǎn)品，BacT／ALERT 3D全自動(dòng)快速培養(yǎng)儀及液體培養(yǎng)基為法國(guó)生物梅里埃（中國(guó)）股份有限公司產(chǎn)品，3130基因分析儀及相應(yīng)試劑為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)（Applied Biosystems）公司產(chǎn)品，抗酸染色液為珠海貝索生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，羅氏培養(yǎng)基由上海市疾病預(yù)防控制中心培養(yǎng)基室提供，氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀等為中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品（分析純）。

二、方法

（一）空氣樣本的采集方法

采用液體撞擊式微生物氣溶膠采樣器（FA－1型撞擊式空氣微生物采樣器），在采樣瓶中加入無(wú)菌生理鹽水10ml作為采樣介質(zhì)，進(jìn)行空氣采樣。采樣時(shí)，采樣器進(jìn)氣口放置距離地面1．2m處，同時(shí)將進(jìn)氣口對(duì)著采樣患者（距離小于1m），流量控制在9L／min左右，采樣時(shí)間為30min，每位患者床邊采樣1份。每份空氣樣本采集后，在生物安全柜中將10ml采樣液收集至無(wú)菌50ml離心管中，送至我實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分枝桿菌分離培養(yǎng)。

（二）空氣樣本前處理

每份空氣樣本中加入等量氫氧化鈉－N－乙酰－L－半胱氨 酸 （N－acetyl－L－cysteine－sodium hydroxide，NALC－NaOH）前處理液［3］消化15～20min后，再加入PBS緩沖液（pH值為6．8）至終體積45ml，4℃條件下3000×g離心15min，棄上清。沉淀加入0．7ml PBS緩沖液（pH 值為6．8），吹打混勻后，用于后續(xù)分離培養(yǎng)試驗(yàn)。

（三）樣本中分枝桿菌分離培養(yǎng)

經(jīng)過(guò)前處理的樣本接種于BacT／ALERT 3D液體培養(yǎng)管和中性羅氏培養(yǎng)基，分別置于BacT／ALERT 3D全自動(dòng)快速培養(yǎng)儀和37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。BacT／ALERT 3D快速液體培養(yǎng)按照法國(guó)生物梅里埃（中國(guó)）股份有限公司提供的“BacT／ALERT 3D系統(tǒng)操作手冊(cè)”（Version B．01版）進(jìn)行，樣本接種羅氏培養(yǎng)基按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行［3］。

（四）培養(yǎng)陽(yáng)性樣本的確認(rèn)及菌型鑒定

1．陽(yáng)性培養(yǎng)物涂片抗酸染色確認(rèn)：BacT／ALERT 3D液體培養(yǎng)和羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性后需經(jīng)涂片抗酸染色確認(rèn)為抗酸桿菌?？顾崛旧R檢及其結(jié)果的判定按《結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程》進(jìn)行［3］。

2．培養(yǎng)陽(yáng)性的分枝桿菌經(jīng)DNA序列分析進(jìn)行菌型鑒定：DNA模板的制備按照煮沸裂解法進(jìn)行提取。從羅氏培養(yǎng)基上刮取1～2接種環(huán)陽(yáng)性培養(yǎng)物，重懸于200μl TE溶液中，80℃滅活30min（BacT／ALERT 3D培養(yǎng)陽(yáng)性樣本，轉(zhuǎn)種至中性羅氏培養(yǎng)基，待菌落生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后進(jìn)行上述操作）。滅活后的菌株DNA 100℃水浴10min煮沸裂解，立即置冰上2min，13 000×g離心15min后，取上清置于另一無(wú)菌1．5ml EP（eppendorf tubes）管中，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)16SrRNA編碼基因保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物：P1：5′－TGGAGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′；P2：5′－ACCGCGGCTGCTGGCAC－3′。PCR 擴(kuò) 增模板DNA，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5min，94℃30s，55℃30s，72℃45s，經(jīng)過(guò)35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序分析（實(shí)驗(yàn)室自測(cè)，PCR產(chǎn)物同時(shí)送上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序，復(fù)核測(cè)序結(jié)果），測(cè)序完成后，利用序列分析軟件Sequencing Analysis 5．3，得到電泳圖譜及基因序列。最后將16SrRNA結(jié)果與GenBank上標(biāo)準(zhǔn)序列包括結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)序列M．tuberculosis（ATCC 27294）、胞內(nèi)分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)序列M．intracellulare（DSM 43223）、戈登分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)序列M．gordonae（Borste 9411／99）比對(duì)，分析鑒定該菌種。

（五）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 15．0軟件對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析：以傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)方法培養(yǎng)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，BacT／ALERT 3D液體培養(yǎng)方法與羅氏培養(yǎng)方法對(duì)醫(yī)院空氣樣本中分枝桿菌分離率的比較采用配對(duì)卡方檢驗(yàn)，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

（六）質(zhì)量控制

每批試驗(yàn)均設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv（ATCC 27294）作為陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)控菌株，以滅菌PBS緩沖液（pH值為6．8）為陰性對(duì)照。在兩種分離培養(yǎng)方法操作規(guī)程規(guī)定的報(bào)告時(shí)間內(nèi)，接種H37Rv的培養(yǎng)基中應(yīng)有結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)，接種滅菌PBS緩沖液的培養(yǎng)基中不應(yīng)有細(xì)菌生長(zhǎng)。

結(jié) 果

1．分枝桿菌分離培養(yǎng)：在結(jié)核病房痰涂片抗酸桿菌陽(yáng)性患者床邊采集到的134份空氣樣本中，有3份樣本分枝桿菌分離培養(yǎng)陽(yáng)性。

134份空氣樣本經(jīng)BacT／ALERT 3D液體培養(yǎng)方法培養(yǎng)陽(yáng)性3份，陽(yáng)性檢出率為2．3%（3／132），污染2份，污染率為1．5%；經(jīng)羅氏培養(yǎng)方法培養(yǎng)陽(yáng)性2份，陽(yáng)性檢出率為1．5%（2／133），污染1份，污染率為0．7%；兩種培養(yǎng)方法共同培養(yǎng)陽(yáng)性2份。經(jīng)配對(duì)卡方檢驗(yàn)，兩種培養(yǎng)方法對(duì)醫(yī)院空氣樣本中分枝桿菌分離率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），詳見(jiàn)表1。

表1 BacT／ALERT 3D液體培養(yǎng)法與羅氏培養(yǎng)法對(duì)醫(yī)院空氣樣本中分枝桿菌檢出情況（份）

2．分枝桿菌菌型鑒定：3份培養(yǎng)陽(yáng)性樣本，分別進(jìn)行涂片抗酸染色確認(rèn)為抗酸分枝桿菌后，進(jìn)行菌型鑒定。經(jīng)DNA序列分析比對(duì)，分別為結(jié)核分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和戈登分枝桿菌。

圖1 分枝桿菌16SrRNA基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

3．培養(yǎng)陽(yáng)性的3份樣本其來(lái)源病房的患者情況：具體見(jiàn)表2。其中戈登分枝桿菌陽(yáng)性標(biāo)本患者入院時(shí)已于外院抗結(jié)核治療2個(gè)月，外院痰涂片＋。而胞內(nèi)分枝桿菌來(lái)源患者入院時(shí)已于外院抗結(jié)核治療1年余，外院痰涂片＋。結(jié)核分枝桿菌陽(yáng)性標(biāo)本來(lái)源患者入院時(shí)已于外院抗結(jié)核治療2個(gè)月，外院痰涂片＋。

討 論

在結(jié)核病定點(diǎn)收治醫(yī)院的特定環(huán)境中，空氣中分枝桿菌的污染可能是導(dǎo)致結(jié)核病院內(nèi)感染的重要媒介［4－5］。肺結(jié)核通過(guò)空氣中的帶菌氣溶膠傳播，結(jié)核分枝桿菌氣溶膠主要來(lái)自患者咳嗽、打噴嚏等直接噴出的帶菌飛沫，其次由落在物體表面的結(jié)核分枝桿菌隨塵土漂浮到空氣中形成的再生菌塵氣溶膠［6］。

1．對(duì)134份采自結(jié)核病房痰涂片抗酸桿菌陽(yáng)性住院患者床邊空氣樣本分離培養(yǎng)結(jié)果的分析：本研究中，檢測(cè)的134份空氣樣本分別采自不同結(jié)核病房痰涂片抗酸桿菌陽(yáng)性（＋～＋＋＋＋）患者病床邊。其中有3份空氣樣本分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性，結(jié)合DNA測(cè)序結(jié)果分析，分別為：結(jié)核分枝桿菌、致病性的胞內(nèi)分枝桿菌、戈登分枝桿菌。1例胞內(nèi)分枝桿菌來(lái)自于痰菌陽(yáng)性的非結(jié)核分枝桿菌肺病患者的床邊采集樣本，同病房其他3位患者的臨床診斷分別為：結(jié)核性腦膜炎、陳舊性肺結(jié)核；結(jié)核性腦膜炎、血行播散性肺結(jié)核；左肺鱗癌。這3位患者痰樣本中均未分離培養(yǎng)出分枝桿菌。但是醫(yī)院對(duì)該采樣病床患者的痰標(biāo)本臨床分離菌株僅鑒定到非結(jié)核分枝桿菌，筆者沒(méi)有獲得該患者的臨床菌株，無(wú)法進(jìn)一步鑒定是否為胞內(nèi)分枝桿菌，亦無(wú)法進(jìn)行菌株基因型的比對(duì)分析，對(duì)于空氣中分離到的菌株是否為該患者呼吸道排出缺乏實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的支持。1例結(jié)核分枝桿菌來(lái)自于菌陽(yáng)肺結(jié)核患者的床邊采集樣本，同病房其他3位患者均為菌陽(yáng)肺結(jié)核患者。但是由于沒(méi)有獲得這4位患者的痰標(biāo)本臨床分離菌株，未進(jìn)行菌株基因型的比較分析，因此無(wú)法判斷空氣中分離到的菌株與患者感染的菌株是否存在同源性。另外1例空氣樣本中分離培養(yǎng)出戈登分枝桿菌，采樣病床患者在該醫(yī)院入院后檢查痰菌陰性，同病房其他3位患者中2位為痰菌陽(yáng)性的肺結(jié)核患者，1位為痰菌陰性的肺結(jié)核患者。由于自然界中本身就存在戈登分枝桿菌，結(jié)合空氣樣本采集時(shí)病房收住患者情況分析，病房收住的患者中沒(méi)有感染戈登分枝桿菌的非結(jié)核分枝桿菌病患者，該例戈登分枝桿菌可能是由住院患者及其家屬?gòu)沫h(huán)境中帶入病房。另外，在課題最初設(shè)計(jì)的時(shí)候，課題研究目的僅想了解收住菌陽(yáng)肺結(jié)核患者的結(jié)核病房空氣中是否存在分枝桿菌，及收住菌陽(yáng)肺結(jié)核患者的結(jié)核病房空氣中是否有傳播結(jié)核病的風(fēng)險(xiǎn)，所以各病房患者病情輕重及各病房收住患者情況并不完全相同，患者的病情輕重不完全相同，所以沒(méi)法判斷這些因素對(duì)病房空氣中菌含量是否有影響。

表2 培養(yǎng)陽(yáng)性的3份樣本其來(lái)源病房的患者情況

2．空氣樣本中分枝桿菌分離培養(yǎng)方法的選擇：在空氣樣本中分枝桿菌的分離培養(yǎng)方法上，本研究采用了世界衛(wèi)生組織推薦的NALC／NaOH消化法消化－去污染后分別接種至中性羅氏培養(yǎng)基和BacT／ALERT 3D快速液體培養(yǎng)基進(jìn)行分枝桿菌的分離培養(yǎng)。134份空氣樣本經(jīng)BacT／ALERT 3D液體培養(yǎng)方法培養(yǎng)陽(yáng)性3例，經(jīng)羅氏培養(yǎng)方法培養(yǎng)陽(yáng)性2例，2種培養(yǎng)方法共同培養(yǎng)陽(yáng)性2例，2種培養(yǎng)方法對(duì)醫(yī)院空氣樣本中分枝桿菌分離率經(jīng)配對(duì)卡方檢驗(yàn)（P＞0．05），差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但BacT／ALERT 3D液體培養(yǎng)試驗(yàn)成本較高，不適宜作為空氣樣本常規(guī)檢測(cè)的首選方法，因此建議使用分枝桿菌羅氏培養(yǎng)作為醫(yī)院空氣定期監(jiān)測(cè)的常規(guī)方法，但是標(biāo)本在首次分離時(shí)建議BacT／ALERT 3D液體培養(yǎng)與傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)法聯(lián)合使用，以提高檢出率，保證空氣監(jiān)測(cè)效果。

3．對(duì)于預(yù)防院內(nèi)感染的一些建議：衛(wèi)生保健工作人員 （HCW）醫(yī)院內(nèi)結(jié)核感染問(wèn)題不容忽視。Menzies等［7］采用文獻(xiàn)調(diào)研的方法，對(duì)部分中低收入國(guó)家的HCW結(jié)核感染情況進(jìn)行了調(diào)查，結(jié)果顯示中低收入國(guó)家中HCW的結(jié)核發(fā)病率遠(yuǎn)高于一般人群。近年來(lái)，非結(jié)核分枝桿菌引起院內(nèi)感染的問(wèn)題也越來(lái)越受到專家的重視。本研究結(jié)果顯示，該結(jié)核病患者定點(diǎn)收治醫(yī)院在結(jié)核病房涂陽(yáng)患者床邊采集的空氣樣本中可分離培養(yǎng)出結(jié)核分枝桿菌，以及其他致病性非結(jié)核分枝桿菌。雖然目前無(wú)法判斷這些菌株是否由于當(dāng)時(shí)住院患者傳播所致，但是這一結(jié)果提示：（1）加強(qiáng)環(huán)境管理，結(jié)核病房定期開窗通風(fēng)和進(jìn)行紫外線消毒，從而切斷結(jié)核分枝桿菌的繼續(xù)傳播途徑；（2）對(duì)醫(yī)院空氣進(jìn)行定期檢測(cè)，及時(shí)掌握空氣質(zhì)量；（3）加強(qiáng)院內(nèi)健康教育，提高醫(yī)護(hù)人員、患者及其家屬的自我防護(hù)意識(shí)；（4）加強(qiáng)醫(yī)護(hù)人員、患者及其家屬的個(gè)人防護(hù)措施；以切實(shí)保護(hù)醫(yī)護(hù)人員、患者及其家屬的身體健康，控制院內(nèi)感染。同時(shí)本研究結(jié)果也提示，不但菌陽(yáng)結(jié)核病患者房間有病原體存在和傳播的風(fēng)險(xiǎn)，非結(jié)核分枝桿菌痰菌陽(yáng)性的患者房間也有病原體存在和傳播的風(fēng)險(xiǎn)，同樣需要引起防控機(jī)構(gòu)的重視。

綜上所述，該醫(yī)院結(jié)核病房痰涂片抗酸桿菌陽(yáng)性患者床邊所采集的空氣樣本中可分離到分枝桿菌，雖然目前尚無(wú)法判斷這些菌株是否由于就診患者傳播所致，但是這一研究結(jié)果提示：定期監(jiān)測(cè)醫(yī)院內(nèi)空氣質(zhì)量是防控醫(yī)院內(nèi)感染的一項(xiàng)重要措施。同時(shí)，本研究結(jié)果也提示：不但菌陽(yáng)結(jié)核病患者的房間有病原體存在和傳播的風(fēng)險(xiǎn)，非結(jié)核分枝桿菌痰菌陽(yáng)性的患者房間也有病原體存在和傳播的風(fēng)險(xiǎn)，同樣需要引起防控機(jī)構(gòu)的重視。由于本研究沒(méi)有獲得空氣樣本采集時(shí)病房中收住患者的痰標(biāo)本臨床分離菌株，因此無(wú)法確定空氣中檢測(cè)到的分枝桿菌是來(lái)源于被檢患者、同病房其他患者還是到該醫(yī)院就診的其他患者，甚至是否來(lái)源于外環(huán)境。本研究也為今后結(jié)核病醫(yī)院內(nèi)空氣質(zhì)量監(jiān)測(cè)提供了一個(gè)借鑒：在進(jìn)行結(jié)核病房空氣監(jiān)測(cè)時(shí)，同時(shí)期病房收住患者的治療情況、采樣時(shí)是否排菌，以及臨床分離菌株的收集與保存也不容忽視，將空氣中分離得到的菌株基因型與患者的痰標(biāo)本臨床分離菌株基因型進(jìn)行比較分析，能夠更嚴(yán)謹(jǐn)?shù)貫椴》靠諝庵蟹蛛x到病原體的來(lái)源提供科學(xué)依據(jù)。

［1］王芳，易濱，劉軍，等．結(jié)核分枝桿菌醫(yī)院感染現(xiàn)狀及預(yù)防控制措施研究．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2009，19（21）：2927－2929．

［2］中華醫(yī)學(xué)會(huì)．臨床診療指南：結(jié)核病分冊(cè)．北京：人民衛(wèi)生出版社，2005．

［3］中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專業(yè)委員會(huì)．結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程．北京：中國(guó)教育文化出版社，2006：13－45．

［4］邢玉斌，魏華，索繼江，等．空氣消毒器現(xiàn)場(chǎng)消毒效果評(píng)估．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2006，16（7）：774－775．

［5］武迎宏，鄧明卓，申玉玲，等．人員流動(dòng)狀態(tài)下空氣消毒效果的觀察．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2007，17（7）：828－830．

［6］張本，王忠仁，童小玫，等．結(jié)核病房空氣中結(jié)核分支桿菌檢測(cè)方法研究．中華結(jié)核和呼吸雜志，1997，20（2）：101－103．

［7］Menzies D，Joshi R，Pai M．Risk of tuberculosis infection and disease associated with work in health care settings．Int J Tuberc Lung Dis，2007，11（6）：593－605．