β－磷酸三鈣／聚乳酸－聚羥基乙酸／異煙肼緩釋材料制備與分析

李大偉 馬遠征 楊飛 崔旭 李力韜 安晉宇 張嘉利

脊柱結(jié)核是一個古老但仍困擾人類健康的疾病，藥物治療是治療脊柱結(jié)核的基石，但長期的全身給予抗結(jié)核藥物，會因藥物在各臟器組織的集聚造成一些不良反應(yīng)。脊柱結(jié)核患者中，硬化骨型約占70%，硬化骨在局部形成天然屏障，使得抗結(jié)核藥物難以進入病灶內(nèi)［1］。發(fā)展局部給藥途徑的緩釋抗結(jié)核藥物材料體系，在手術(shù)中植入清除的脊柱結(jié)核病灶區(qū)缺損內(nèi)，在修復(fù)骨缺損的同時釋放抗結(jié)核藥物，具有現(xiàn)實意義。聚乳酸－聚羥基乙酸［poly（DL－lactic－glycolicacid），PLGA］是目前最常用的緩釋材料載體，其存在親水性差、代謝后影響微環(huán)境酸堿平衡等不足。而β－磷酸三鈣β－Ca3（PO4）2（β－tricalcium phosphate，β－TCP）與人體骨骼無機成分相似，是一種新型的骨修復(fù)材料，具有良好的理化性能，生物相容性和生物可降解性，它們在生理環(huán)境中可被逐步分解或吸收，誘發(fā)骨的生長，并隨之被新骨組織所代替，已被國內(nèi)外諸多研究證實為一種很好的骨移植替代材料［2－3］。β－TCP的降解能為新骨的形成提供更豐富的Ca、P離子，且其自身的弱堿性可以中和聚乳酸類降解產(chǎn)物的酸性產(chǎn)物，減少無菌性炎癥，可彌補PLGA的不足。本實驗采用β－TCP聯(lián)合PLGA負(fù)載異煙肼（isoniazid，INH）制備抗結(jié)核藥物緩釋－代骨材料，并觀察其在動物體內(nèi)外的性能。

材料和方法

一、實驗動物和試劑來源

1．實驗動物：2011年9月至2011年12月，解放軍第三O九醫(yī)院實驗動物中心提供的健康成年新西蘭大白兔36只，雌雄不限，體質(zhì)量（2．5±0．5）kg，3～4個月齡，清潔級動物）。將動物標(biāo)號，用數(shù)字表法隨機分配到3個實驗組，每組12只。實驗過程符合國家科學(xué)技術(shù)部2006年發(fā)布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

2．儀器和試劑：SCIENT Z－ⅡD 超聲細(xì)胞粉碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；LGJ冷凍干燥機（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗儀器廠）；醫(yī)用離心機（北京儀器廠）；IX70倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；超速離心機（美國Beckman公司）；Malvern激光粒度分析儀（Mastersizer 2000型，英國馬爾文儀器有限公司）；掃描電鏡（JSM－5600，日本JEOL公司）；島津UV160分光光度計（島津歐洲有限公司）；DMEM 培養(yǎng)液（美國GIBCO公司）；胎牛血清（蘭州民海生物工程有限公司）；β－TCP（上海瑞邦生物材料有限公司）；INH原藥（美國Sigma公司）；異煙肼標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院）；二氯甲烷、乙腈、聚乙烯醇、去離子水、異丙醇等。

二、實驗方法

1．β－TCP／PLGA／INH 和 β－TCP／PLGA 材料制備：在 Dillen等［4］報道的水／油／水（w／o／w）復(fù)乳法基礎(chǔ)上制備材料。（1）β－TCP／PLGA／INH 的制作：將PLGA溶解于適量1，4－二氧六環(huán)中，配制成溶液。根據(jù)預(yù)定的PLGA／TCP含量（1／1）稱取相應(yīng)的TCP粉末、INH 粉末［載藥量10%（w／w）］。將2種粉末直接混入PLGA溶液中，超聲混合均勻。將懸濁液置入模具中。在－80℃冷凍2h。將模具置入凍干機中冷凍干燥72h。材料環(huán)氧乙烷消毒，4℃保存?zhèn)溆?。?）β－TCP／PLGA 的制作：制作步驟同上，僅β－TCP／PLGA不混入INH粉末。

2．兔股骨髁缺損模型制備：兔取仰臥位，戊巴比妥鈉（3%，30mg／kg）耳緣靜脈注射麻醉。常規(guī)備皮、消毒鋪單。取膝關(guān)節(jié)外側(cè)切口，長2cm，切開皮膚、皮下組織、關(guān)節(jié)外側(cè)支持帶，顯露股骨遠端，于側(cè)副韌帶與兔腓側(cè)韌帶之間中點處，平行膝關(guān)節(jié)橫軸鉆1個直徑5mm、長10mm的圓柱形骨缺損。生理鹽水沖洗創(chuàng)面，清除骨屑和凝血塊，干紗布填塞，使骨面保持干燥，實驗Ⅰ組、Ⅱ組分別植入β－TCP／PLGA、β－TCP／PLGA／INH（圖1），實驗Ⅲ組為空白對照組，不植入任何材料?？p合深筋膜，最后縫合皮膚。術(shù)后放回籠內(nèi)分組飼養(yǎng)。術(shù)后常規(guī)消毒切口，每天20萬U盤尼西林一次性肌內(nèi)注射，連續(xù)3d。

圖1 緩釋材料外觀、兔股骨髁骨缺損模型及植入后圖片

3．β－TCP／PLGA／INH 緩釋材料體外釋藥觀察：浸水法測定孔隙率，用掃描電子顯微鏡觀察材料，觀察兩種β－TCP／PLGA／INH 緩釋材料不同放大倍數(shù)下的形態(tài)和表面狀況。將β－TCP／PLGA／INH浸泡于37℃的20%（V／V）血清培養(yǎng)基 （pH調(diào)整為7．4），并于浸泡后1、2、3d檢測1次，1周以上每周檢測1次，分別從浸泡液中取出10ml液體，用高效液相色譜法［5］檢測上述樣本中異煙肼含量。并以時間為橫坐標(biāo)，累積釋放率為縱坐標(biāo)繪圖［累積釋放率＝（各個時間點取樣測定的濃度×體積＋已釋放的量）／支架中全部藥物的含量×100%］。

4．緩釋材料組織及影像學(xué)觀察：（1）影像學(xué)觀察：行X線檢查觀察術(shù)后即刻材料的放置情況，觀察術(shù)后4、8、12周骨缺損區(qū)處骨修復(fù)情況。（2）組織學(xué)觀察：分別于術(shù)后4、8和12周處死動物取兔股骨髁標(biāo)本，以甲醛固定，常規(guī)脫鈣、包埋、切片，HE染色，顯微鏡下觀察成骨及材料降解情況，按Lane－Sandhu組織學(xué)評分方法行組織學(xué)評分［6］（骨形成情況：0～4分，骨連接情況：0～2分，骨塑形情況：0～4分）。（3）形態(tài)計量定量觀察：用數(shù)碼相機將植入物信息輸入電腦中，描出植入物區(qū)域及骨長入?yún)^(qū)域，然后計算機測量系統(tǒng)測出植入物區(qū)域及骨長入?yún)^(qū)域的面積。根據(jù)以下公式計算出骨長入率：骨長入率（%）＝骨長入?yún)^(qū)域／植入物區(qū)域×100%。

5．臨床觀察：術(shù)后觀察動物飲食及傷口變化。并于術(shù)后4、8、12周，每組處死4只動物，取材并觀察材料與骨缺損的連接程度及成骨情況。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

1．大體觀察：術(shù)后兔第1天進食量較少，術(shù)后第3天恢復(fù)正常的飲食量，質(zhì)量增長正常，切口局部無紅腫滲出，一期甲級愈合，手術(shù)側(cè)肢體跛行，平均1周能正常行走。術(shù)后4周觀察，實驗Ⅰ、Ⅱ組動物的骨缺損處均被軟組織覆蓋，材料與周圍骨組織的界面模糊，材料與周圍骨結(jié)合部位的成骨部分觸之稍硬；實驗Ⅲ組動物的骨缺損可以看到，周圍有少量骨質(zhì)生長，表面有纖維組織覆蓋，去掉表面的軟組織后可以看到明顯的缺損。術(shù)后8周，實驗Ⅰ、Ⅱ組動物的骨缺損部位有新生骨長入，材料大部分降解；實驗Ⅲ組動物的骨缺損處明顯被軟組織覆蓋。術(shù)后12周，實驗Ⅰ、Ⅱ組動物的骨缺損完全被新生骨替代，材料被降解，材料與骨界面消失，實驗Ⅰ、Ⅱ組間無明顯差別；實驗Ⅲ組仍被軟組織覆蓋，缺損清晰可見。

2．β－TCP／PLGA／INH 材料掃描電鏡觀察及體外釋藥性能分析：材料孔徑在40～400μm，孔隙率為92．0%（孔隙率即材料內(nèi)部孔隙體積占其總體積的百分率）（圖2）。高效液相色譜檢測了10%載藥量的β－TCP／PLGA／INH材料藥物釋放情況，無突釋現(xiàn)象，緩釋時間明顯延長，6周時累計釋放90．0%，釋放曲線較平緩，釋放穩(wěn)定；6周以后釋放減慢，曲線趨于平緩，至12周時累及釋放100．0%（圖3）。

3．影像學(xué)觀察結(jié)果：術(shù)后4周實驗Ⅰ、Ⅱ組X線攝影均可見股骨髁處低密度影，并可見少量骨質(zhì)生成；實驗Ⅲ組的骨缺損處呈明顯的低密度影；術(shù)后8周實驗Ⅰ、Ⅱ組均顯示股骨髁處模糊、大量骨質(zhì)生成，實驗Ⅲ組的骨缺損處仍呈明顯低密度影；術(shù)后12周實驗Ⅰ、Ⅱ組均發(fā)現(xiàn)骨缺損完全修復(fù)，2個組間無明顯差別，而實驗Ⅲ組未自行修復(fù)（圖4～6）。

4．組織學(xué)結(jié)果：組織學(xué)檢查：術(shù)后4周，實驗Ⅰ、Ⅱ組骨缺損處均可見活躍的成骨細(xì)胞及小血管長入，并且有少量淋巴細(xì)胞長入，材料得到部分降解；實驗Ⅲ組骨缺損處周圍可見少量成骨細(xì)胞，中心有成纖維細(xì)胞和脂肪組織長入；術(shù)后8周，實驗Ⅰ、Ⅱ組骨缺損處有類似骨組織結(jié)構(gòu)形成，與周圍骨質(zhì)相連接，骨組織結(jié)構(gòu)間殘留部分材料；實驗Ⅲ組骨缺損處周圍有少量類骨組織形成，大量成纖維細(xì)胞和脂肪組織長入；術(shù)后12周，實驗Ⅰ、Ⅱ組骨缺損完全愈合，骨小梁間殘留少量材料，材料表面可見增生的成骨細(xì)胞和淋巴細(xì)胞；實驗Ⅲ組骨缺損處見少量骨組織從缺損邊緣向內(nèi)長入，大部分被成纖維細(xì)胞和脂肪組織填充（表1）。

圖4～6 12周后實驗Ⅰ、Ⅱ組與Ⅲ組（對照組）兔股骨髁缺損修復(fù)情況。圖4為實驗Ⅲ組側(cè)位X線片，圖5為實驗Ⅰ組側(cè)位X線片，圖6為實驗Ⅱ組側(cè)位X線片

表1 術(shù)后各組Lane－Sandhu組織學(xué)評分（±s，分）

表1 術(shù)后各組Lane－Sandhu組織學(xué)評分（±s，分）

注 實驗Ⅰ組為β－TCP／PLGA 組，實驗Ⅱ組為β－TCP／PLGA／INH組，實驗Ⅲ組為空白對照組；a：實驗Ⅰ組與實驗Ⅲ組比較，從左到右t值分別為8．427、7．203、14．700，實驗Ⅱ組與實驗Ⅲ組比較，從左到右t值分別為7．379、6．559、11．404，P 值均＜0．01；b：與實驗Ⅰ組比較，從左到右t值分別為0．166、－0．256、0．400，P值均＞0．05

組別 4周（4只） 8周（4只） 12周（4只）實驗Ⅲ組1．1±0．3 1．5±0．6 2．0±0．4實驗Ⅰ組 4．7±0．8a 5．7±1．0a 7．3±0．6a實驗Ⅱ組 4．6±0．9a，b 5．9±1．2a，b 7．1±0．8a，b

5．骨組織計量學(xué)分析：8周，實驗Ⅰ組和實驗Ⅱ組的骨長入率為47．0%±3．0%、49．0%±4．0%，而實驗Ⅲ組為5．0%±0．9%；12周，實驗Ⅰ組和實驗Ⅱ組的骨長入率為83．0%±7．0%、84．0%±6．0%，而實驗Ⅲ組為10．0%±1．1%。實驗Ⅰ組和實驗Ⅱ組間新骨形成量差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t＝－0．217，P＞0．05）；實驗Ⅰ組和實驗Ⅱ組分別與實驗Ⅲ組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（t值分別為20．604和24．262，P值均＜0．01）。

討 論

藥物治療是脊柱結(jié)核治療的基礎(chǔ)，而且藥物進入人體內(nèi)能否產(chǎn)生藥效，很大程度上取決于作用部位即病灶中的藥物濃度。脊柱結(jié)核多在局部形成病灶，其壞死灶內(nèi)的病變組織及周圍硬化骨組織血供較少，此外硬化骨雖然局限了病灶的發(fā)展，但硬化骨內(nèi)抗結(jié)核藥物測定僅為最低抑菌濃度［7］，達不到殺菌濃度并形成屏障阻礙藥物進入病灶中。因此，發(fā)展局部給藥途徑的緩釋抗結(jié)核藥物系統(tǒng)，植入結(jié)核病灶清除后的骨缺損內(nèi)，使其在病灶內(nèi)長期緩釋高濃度藥物，在局部較長時期內(nèi)形成高濃度藥物環(huán)境，有利于殺滅或抑制結(jié)核分枝桿菌的生長、繁殖。該局部緩釋藥物的載體若具有植骨替代作用，在植入病灶后載體降解、釋放藥物的同時，逐步被骨組織替代，可促進早期植骨融合，加速病灶愈合。理想的緩釋抗結(jié)核藥物系統(tǒng)應(yīng)具有良好的生物相容性，對細(xì)胞有良好的親和力，在體內(nèi)具有骨傳導(dǎo)性及骨誘導(dǎo)性，生物降解與骨修復(fù)相匹配，具有緩釋藥物的功能，材料與藥物間無不良相互影響；緩釋材料降解時間長，局部緩釋的藥物濃度穩(wěn)定。

本實驗利用PLGA在生物體內(nèi)可自然降解的特性，通過在PLGA中加入β－TCP、INH，成功的制備出載有抗結(jié)核藥物的多孔緩釋復(fù)合材料，在降解過程中不僅使INH可緩慢有效的釋放，同時還提高了材料的空隙率和大孔率，使材料的骨細(xì)胞誘導(dǎo)作用增強，便于成骨細(xì)胞及成軟骨細(xì)胞的長入，更有利于微血管的蔓延浸潤，利于新骨生成與重建及骨缺損的修復(fù)。另一方面，PLGA的降解產(chǎn)物是乳酸和羥基乙酸，其可降低生物內(nèi)環(huán)境的pH值，較低的pH值會引起機體的炎癥反應(yīng)，對機體造成損傷［8］，在材料中加入β－TCP后可調(diào)節(jié)這種pH值的變化，避免了炎癥的發(fā)生，并且β－TCP在降解時可為骨修復(fù)提供Ca、P離子。材料藥代動力學(xué)結(jié)果表明，該緩釋材料體系在局部緩慢、平穩(wěn)釋放INH，持續(xù)時間近3個月，與材料被骨替代的速度相匹配。從大體觀察和Lane－Sandhu組織學(xué)評分結(jié)果表明，該復(fù)合材料具備良好的組織相容性，負(fù)載INH后并未對復(fù)合材料體內(nèi)外性能造成影響。影像學(xué)檢查和骨組織計量學(xué)觀察，表明該抗結(jié)核藥物緩釋－代骨材料符合結(jié)核病灶清除后的植骨替代要求。骨關(guān)節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)藥物治療方案為3種或4種一線抗結(jié)核藥物聯(lián)合應(yīng)用［9］，前期合成的復(fù)合材料僅負(fù)載了單一種藥物，目前正在對聯(lián)合負(fù)載有INH、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺4種藥物的復(fù)合材料進行相關(guān)分析，以及其對動物模型的治療作用進行探討，將在后續(xù)中進行報道。

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