神經(jīng)節(jié)系列鞘糖脂氨基半乳糖模塊的快速合成*

王 坤，張鵬濤，李春霞，管華詩

(中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室山東省糖科學(xué)與糖工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

乙酰氨基半乳糖(GalNAc)常存在于以Galβ3GalNAcβ4Gal為結(jié)構(gòu)片段的神經(jīng)節(jié)系列鞘糖脂中，如 FucoseGM1，3'-isoLM1，GM1 和 SB1a［1］。該類鞘糖脂在腫瘤細(xì)胞的異常表達(dá)引起人們的廣泛關(guān)注，其作為腫瘤標(biāo)志物可以幫助腫瘤的診斷、分類、預(yù)后判斷等。因此與鞘糖脂相關(guān)的糖疫苗的研究與開發(fā)是目前糖化學(xué)和糖生物學(xué)的研究熱點(diǎn)［2］。但神經(jīng)節(jié)系列鞘糖脂在生物體中的含量少，且分離純化較困難，因此目前主要通過化學(xué)合成法進(jìn)行制備［3］。

在鞘糖脂F(xiàn)ucoseGM1的一鍋法合成中［4］，糖鏈中乙酰氨基半乳糖單元利用4，6-O-二-乙?；?2-三氯乙氧羰酰氨基-2-脫氧-β-D-吡喃半乳糖對(duì)甲苯硫苷(5)作為糖基受體通過糖苷化反應(yīng)引入。該合成模塊的相對(duì)反應(yīng)活性(RRV)為3269，其合成方法一般是從1出發(fā)，利用芐叉保護(hù)4，6-位，再用Lev和TBDMS等可選擇性脫除的保護(hù)基保護(hù)3-位;然后水解去掉芐叉，乙?；?，6-位，脫除3-位保護(hù)基得5。該合成方法步驟繁瑣，且中間體多需硅膠柱層析純化，不適合大量制備。為了快速有效的合成具有Galβ3GalNAcβ4Gal結(jié)構(gòu)片段的神經(jīng)節(jié)系列鞘糖脂，必須發(fā)展一種簡(jiǎn)便、快捷的方法合成5。

本文以D-氨基半乳糖鹽酸鹽為原料，經(jīng)四步反應(yīng)合成了2-N-三氯乙氧羰酰氨基-半乳糖對(duì)甲苯硫苷(3);利用濃硫酸催化乙酸乙酯［5］對(duì)3的6-位選擇性乙?；宜狨ミx擇性乙?；?-位羥基，以兩步70%的總收率合成了5(Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和ESI-MS確證。

Scheme 1

該方法具有試劑廉價(jià)低毒、操作簡(jiǎn)單、收率較高、不需柱層析分離純化等優(yōu)點(diǎn)，適合大量制備，為神經(jīng)節(jié)系列鞘糖脂的合成提供了參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

JNM-ECP600型和DD2 500-MR型核磁共振儀(CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo));Micromass QTOF Ultima Global型質(zhì)譜儀。

所用試劑均為分析純;甲醇和CH2Cl2使用前經(jīng)無水處理。

1.2 合成

(1)1的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入氨基半乳糖鹽酸鹽5 g(23 mmol)和蒸餾水120 mL，攪拌至完全溶解;緩慢加入 NaHCO35.52 g(65 mmol)，攪拌使其溶解;冰浴下滴加 TrocCl5.45 mL(39.5 mmol)，滴畢，于-5℃反應(yīng)24 h。趁冷過濾，濾餅用冰水(20 mL)洗滌，真空干燥得白色粉末。加入吡啶20 mL，攪拌使其溶解;加入乙酸酐10 mL，于室溫反應(yīng)5 h(TLC檢測(cè))。加入乙醇5 mL淬滅反應(yīng)，減壓蒸除吡啶，加入EtOAc 250 mL，依次用0.5 mol·L-1HCl(3×100 mL)、飽和碳酸氫鈉(3×100 mL)和飽和NaCl溶液(3×100 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，減壓濃縮得白色無定形固體1 10.6 g，收率87%;TOF-ESI-MS m/z:Calcd for C17H22NO11Cl3Na{［M+Na］+}544.0，found 544.0。

(2)2的合成

在反應(yīng)瓶中依次加入1 10 g(19 mmol)和CH2Cl2100 mL，攪拌使其溶解;加入對(duì)甲苯硫酚(p-TolSH)3.54 g(28.5 mmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)，冰浴下緩緩滴加 BF3·OEt210.0 mL(38.0 mmol)，滴畢，緩慢升至室溫，反應(yīng)7 h(TLC檢測(cè))。加入飽和NaHCO3溶液終止反應(yīng)，用二氯甲烷(2×100 mL)萃取，合并萃取液，依次用飽和 NaHCO3和飽和NaCl水溶液洗滌，無水Na2SO4干燥，減壓濃縮后經(jīng)硅膠柱層析［洗脫劑:V(AcOEt)∶V(石油醚)=1 ∶3］純化得白色粉末 2 8.66 g，收率 80%;1H NMR δ:7.43(d，J=8.0 Hz，2H，ArH)，7.13(d，J=8.0 Hz，2H，ArH)，5.39(d，J=3.0 Hz，1H，4-H)，5.19(dd，J=10.8 Hz，2.9 Hz，1H，3-H)，5.11(d，J=9.1 Hz，1H，NH)，4.84(d，J=10.3 Hz，1H，1-H)，4.80(d，J=12.1 Hz，1H，CH2CCl3)，4.73(d，J=12.0 Hz，1H，CH2CCl3)，4.18(dd，J=11.3 Hz，7.0 Hz，1H，6a-H)，4.12(dd，J=11.4 Hz，6.3 Hz，1H，6b-H)，3.94～3.87(m，2H，2，5-H)，2.34(s，3H，ArCH3)，2.13(s，3H，COCH3)，2.04(s，3H，COCH3)，1.98(s，9H，COCH3);TOF-ESI-MS m/z:Calcd for C22H26NO9SCl3Na{［M+Na］+}608.1，found 608.1。

(3)3的合成

在反應(yīng)瓶中加入2 8.0 g(13.6 mmol)和甲醇150 mL，攪拌使其溶解;加入催化量的甲醇鈉，調(diào)至pH 8～9，于室溫反應(yīng)20 min(TLC檢測(cè))。用酸性陽離子樹脂調(diào)至中性，過濾，濾液減壓蒸餾得白色固體3 6.28 g，收率99%;1H NMR(氘代甲醇)δ:7.42(d，J=8.1 Hz，2H，ArH)，7.13(d，J=8.0 Hz，2H，ArH)，4.89(d，J=12.2 Hz，1H，CH2CCl3)，4.75(d，J=12.1 Hz，1H，CH2CCl3)，4.71(d，J=10.4 Hz，1H，1-H)，3.91(d，J=2.9 Hz，1H，4-H)，3.79(dd，J=11.5 Hz，6.6 Hz，1H，6a-H)，3.78(t，J=10.3 Hz，1H，2-H)，3.74(dd，J=11.5 Hz，5.4 Hz，1H，6b-H)，3.63(dd，J=10.2 Hz，3.2 Hz，1H，3-H)，3.53(t，J=6.1 Hz，1H，5-H)，2.33(s，3H，ArCH3)。

(4)4的合成

在反應(yīng)瓶中加入3 4.6 g(10 mmol)和乙酸乙酯200 mL，攪拌下緩慢滴加濃硫酸(0.82 mL，15 mmol)的乙酸乙酯(100 mL)溶液，滴畢，于45℃反應(yīng)18 h(TLC檢測(cè))。加入飽和NaHCO3溶液終止反應(yīng)，依次用飽和NaHCO3溶液(2×50 mL)和飽和NaCl溶液(2×50 mL)洗滌，無水Na2SO4干燥，濃縮得白色固體4粗品(直接進(jìn)行下步反應(yīng));1H NMR δ:7.41(t，J=6.5 Hz，2H，ArH)，7.11(t，J=6.6 Hz，2H，ArH)，5.39(d，J=6.9 Hz，1H，NH)，4.82～4.70(m，2H，CH2CCl3)，4.68(d，J=10.2 Hz，1H，1-H)，4.36(dd，J=11.6 Hz，5.7 Hz，1H，6a-H)，4.32(dd，J=11.6 Hz，7.1 Hz，1H，6b-H)，3.92(d，J=2.8 Hz，1H，4-H)，3.81(dd，J=9.8 Hz，2.5 Hz，1H，3-H)，3.71(m，1H，5-H)，3.61(m，1H，2-H)，2.33(s，3H，ArCH3)，2.08(s，3H，COCH3);TOF-ESI-MS m/z:Calcd for C18H22NO7SCl3Na{［M+Na］+}524.0，found 524.0。

(5)5的合成

在反應(yīng)瓶中加入4粗品和乙腈100 mL，攪拌使其溶解;加入原乙酸三乙酯3.7 mL(20 mmol)和對(duì)甲苯磺酸170 mg(1 mmol)，于室溫反應(yīng)1.5 h;加入三乙胺終止反應(yīng)，減壓濃縮后，加入90%乙酸80 mL，室溫反應(yīng)1 h。減壓濃縮，甲苯共沸兩次后用無水乙醇重結(jié)晶得白色固體5 3.81 g，收率(3→5)70%;1H NMR δ:7.43(d，J=8.0 Hz，2H，ArH)，7.11(d，J=8.0 Hz，2H，ArH)，5.33(d，J=3.1 Hz，1H，4-H)，5.22(d，J=7.2 Hz，1H，NH)，4.80～ 4.73(m，3H，1-H，CH2CCl3)，4.16(d，J=6.4 Hz，2H，6-H)，4.04(m，1H，3-H)，3.86(t，J=6.4 Hz，1H，5-H)，3.62～3.59(m，1H，2-H)，2.84(d，J=4.5 Hz，1H，3-OH)，2.34(s，3H，ArCH3)，2.13(s，3H，CH3in Ac)，2.06(s，3H，CH3in Ac);TOF-ESIMS m/z:Calcd for C20H24NO8SCl3Na{［M+Na］+}557.0，found 557.2。

2 結(jié)果與討論

從氨基半乳糖鹽酸鹽出發(fā)，首先利用弱堿NaHCO3中和原料中的鹽酸，隨后利用Troc選擇性保護(hù)2-位氨基，3，4，6-位乙?；?1。1 與對(duì)甲苯硫酚反應(yīng)得硫苷2［6］，然后在甲醇鈉的作用下脫除乙?；频藐P(guān)鍵中間體3，四步總收率69%。

Wong等［4］以 3 為起始原料，經(jīng) 4，6-位芐叉保護(hù)，3-位 Lev保護(hù)，脫除芐叉，4，6-位乙酰化和脫Lev保護(hù)共5步反應(yīng)制得5，總收率35%。該方法步驟繁瑣，且中間體多需硅膠柱分離純化。

制備5的關(guān)鍵是4，6-位羥基的選擇性保護(hù)。Liang等［5］報(bào)道濃硫酸催化乙酸乙酯區(qū)域選擇性的保護(hù)氨基葡萄糖硫苷的6-位羥基。本文利用該方法順利實(shí)現(xiàn)了3的6-位選擇性乙?；苽?。

在4的制備過程中，n(3)∶n(濃硫酸)∶n(EtOAc)=1 ∶1.5 ∶30，溫度對(duì)反應(yīng)有一定影響。室溫下3在乙酸乙酯中的溶解度較差，轉(zhuǎn)化較慢，48 h仍不能完全轉(zhuǎn)化;回流反應(yīng)3 h 3完成轉(zhuǎn)化，但同時(shí)有大量3，6-位雙乙?；碑a(chǎn)物生成;于40℃反應(yīng)18 h 3基本轉(zhuǎn)化完全，僅有少量雙乙?；a(chǎn)物生成，無需分離，簡(jiǎn)單后處理蒸干后直接進(jìn)行下步反應(yīng)。

對(duì)4的4-位羥基進(jìn)行選擇性的保護(hù)。原乙酸三乙酯可以在對(duì)甲苯磺酸的催化下將糖環(huán)中處于順勢(shì)的相鄰羥基進(jìn)行保護(hù)，并在酸性條件下水解，在平伏鍵上留下一個(gè)乙?；?］。該方法順利完成了4-位羥基的區(qū)域選擇性乙?；?，快速高收率(兩步收率70%)地合成了神經(jīng)節(jié)系列鞘糖脂氨基半乳糖模塊5。

［1］ Fredman P，Hedberg K，Brezicka T.Gangliosides as therapeutic targets for cancer［J］.Biodrugs，2003，17(3):155-167.

［2］ Heimburg-Molinaro J，Lum M，Vijay G，et al.Cancer vaccines and carbohydrate epitopes［J］.Vaccine，2011，29(48):8802-8826.

［3］ Komori T，Imamura A，Ando H，et al.Study on systematizing the synthesis of the a-series ganglioside glycans GT1a，GD1a，and GM1 using the newly developed N-Troc-protected GM3 and GalN intermediates［J］.Carbohydrate Research，2009，344(12):1453-1463.

［4］ Mong T K K，Lee H K，Durón S G，et al.Reactivity based one-pot total synthesis of fucose GM1 oligosaccharide:A sialylated antigenic epitope of small-cell lung cancer［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2003，100(3):797-802.

［5］ Liang P H，Lu Y J，Tang T H.A green and regioselective acetylation of thioglycoside with ethyl acetate［J］.Tetrahedron Letters，2010，51(52):6928-6931.

［6］ Autar R，Khan A S，Schad M，et al.Adhesion inhibition of F1C-fimbriated Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa PAK and PAO by multivalent carbohydrate ligands［J］.ChemBioBhem，2003，4(12):1317-1325.

［7］ 蔡孟深，李中軍.糖化學(xué)——基礎(chǔ)、反應(yīng)、合成、分離及結(jié)構(gòu)［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2006.