桿菌肽ELISA檢測試劑盒的研制

劉宏軍 ，馮才偉 ，王瑟如 ，韓京朋 ，丁小梅 ，錢宏光

（1.江蘇省泰州市姜堰區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇泰州225500；2.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206）

桿菌肽，又稱枯草菌肽，是由地衣芽孢桿菌或枯草桿菌變種的培養(yǎng)液分離而得[1]。對革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)的抑制作用，抗菌譜與青霉素G相似，被廣泛用于治療家禽、豬、牛等腸道、呼吸道、泌尿系統(tǒng)感染，作為獸藥和飼料添加劑，具有抑菌、殺菌和明顯的促生長作用，是目前國內(nèi)外廣泛用于飼料中的一種新型抗生素[2]。

桿菌肽屬于多肽類抗生素，具有腎和神經(jīng)毒性，其在動物組織中的殘留會通過食物鏈傳遞給人類，其產(chǎn)生的毒副作用會對人體產(chǎn)生直接的危害，為此其安全問題已經(jīng)日益引起人們的關(guān)注。我國農(nóng)業(yè)部235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》中對桿菌肽藥物最高殘留限量（MRL）作出了規(guī)定：牛奶中桿菌肽最高殘留限量為500μg/kg，在牛、豬、禽的可食用組織中為500μg/kg[3]。

目前，國外對于動物性食品中桿菌肽藥物殘留檢測方法的報(bào)道為微生物法、薄層色譜法、免疫學(xué)法、毛細(xì)管電游泳法、高效液相色譜法等，國內(nèi)報(bào)道的方法主要是微生物法，但其操作繁瑣、靈敏度低、重現(xiàn)性差[4]。以免疫學(xué)檢測技術(shù)為基礎(chǔ)，建立起來的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒可為建立監(jiān)控動物性食品中桿菌肽殘留提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料和試劑

甲醇（分析純）、濃硫酸（分析純）、1，5-戊二醛、正己烷（分析純）、NaBH4、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等生化試劑上海華美公司；96孔微孔測定板、桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品sigma公司。

1.1.2 儀器

酶標(biāo)儀MK3、微量移液器美國Thermo；氮吹儀KL512美國Organomation；低速離心機(jī)AnkeTDL-40B上海安亭科學(xué)儀器；電子天平2000SBL美國Setra；8010S勻漿機(jī)上海斯伯明儀器設(shè)備有限公司；生化培養(yǎng)箱DHP-600天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐；QL-901漩渦混合器海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液系統(tǒng)

各溶液參考王玉平方法配制[5]。

1.2.2 桿菌肽抗原的合成

取桿菌肽4 5mg，用1.5mL水溶解；取5 0%的1，5-戊二醛（GA）10μL加入桿菌肽溶解液中，室溫下攪拌反應(yīng)18h；稱取載體蛋白（BSA或OVA）60mg用1.5 m L水稀釋后加入桿菌肽溶解液中，反應(yīng)24小時(shí)；加入24mgNaBH4反應(yīng)3h；用三蒸水透析48小時(shí)，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)；分裝，于-20℃保存?zhèn)溆?。以桿菌肽-B S A作為免疫抗原，桿菌肽-O V A作為包被抗原。

1.2.3 抗體制備

參照沈泓方法并加以改進(jìn)，制備抗桿菌肽單克隆抗體（McAb），測定效價(jià)，并凍存?zhèn)溆肹6]。

1.2.4 微孔板包被

用0.01mol/LpH7.2的PBS將桿菌肽-OVA稀釋到適當(dāng)濃度，按100μL/孔加入酶標(biāo)板微孔中，置于37℃恒溫箱溫育2h，甩干余液并洗滌一次；加入封閉液150μL/孔，置于37℃恒溫箱溫育2 h，甩干余液后拍干，置于鋁箔袋中，抽真空干燥并密封，保存于4℃冰箱。

1.2.5 ELISA方法建立

配制質(zhì)量濃度分別為 0、1.0、3.0、9.0、27.0、81.0μg/L的桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)液，將上述制備的抗桿菌肽McAb與酶標(biāo)二抗混合并混勻，預(yù)先平衡30min，配制為抗體-酶標(biāo)二抗工作液。參照Tijssen方法進(jìn)行競爭E LISA檢測，檢測步驟如下：向包被有桿菌肽-OVA的酶標(biāo)板微孔中加入桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品或樣品處理液50μL/孔，然后加入抗體-酶標(biāo)二抗工作液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，置于25℃恒溫箱中避光反應(yīng)30min。甩干余液，洗滌5次后拍干，加入底物A液、B液各50μL/孔，避光反應(yīng)15min后用50μL/孔的終止液終止，并用酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度值(Optical density，OD)。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

以各標(biāo)準(zhǔn)品的O D450nm值除以0濃度標(biāo)準(zhǔn)品的O D450nm值再乘以1 0 0，得出吸光百分比[(B/B0%)]。以B/B0%值為縱坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)品濃度的常用對數(shù)值(l o g10[C])為橫坐標(biāo)繪制對應(yīng)桿菌肽濃度的半對數(shù)坐標(biāo)曲線圖。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出B/B0%為5 0%時(shí)對應(yīng)的桿菌肽濃度即為I C50值。

1.2.7 樣品前處理

1.2.7.1 動物組織樣品

用均質(zhì)器將動物組織樣品均質(zhì)；稱取1.0±0.05g組織樣品至50mL離心管中，加入10mL甲醇，用渦旋儀渦動3min，以3000r/min的轉(zhuǎn)速，在室溫（20～25℃）環(huán)境下離心5min；取1mL上層液體至10mL玻璃試管中，置于50～60℃水浴鍋中用氮?dú)饬鞔蹈桑患尤?mL復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動1min充分混勻；取5 0 μL用于分析。

1.2.7.2 牛奶樣品

取1mL±0.05mL牛奶樣品至2mL離心管中；加入30μL2M硫酸，再加入300μL甲醇，渦動30s，3000r/min的轉(zhuǎn)速，在室溫（20～25℃）環(huán)境下離心5min；避開上層懸浮物，吸取30μL上清液，加入570μL復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動2min使樣品充分混勻；取50μL用于分析。

2 結(jié)果

2.1 ELISA工作曲線

圖l為ELISA檢測法工作曲線。曲線呈典型的S型，回歸方程為：y=-2.0574x+1.0956，相關(guān)系數(shù)為0.9967，IC50為3.9μg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線中各標(biāo)準(zhǔn)品濃度對應(yīng)的吸光百分比值的標(biāo)準(zhǔn)誤差 (RSD)為1.8%～3.9%，結(jié)果表明桿菌肽在1.0～81.0μg/L范圍具有良好線性。

2.2 基質(zhì)干擾測試

分析P B S緩沖液、豬肉、豬肝、牛奶樣品處理液4種基質(zhì)對繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響，將桿菌肽分別溶于 4種基質(zhì)中，配制成濃度為 0、1.0、3.0、9.0、27.0、81.0μg/L標(biāo)準(zhǔn)液，按照桿菌肽試劑盒的操作方法測定，繪制曲線進(jìn)行分析。不同基質(zhì)的桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品其OD450nm值不同，P B S緩沖液、豬肉、豬肝、牛奶處理液4種基質(zhì)測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的I C50分別為3.9μg/L、4.6μg/L、4.2μg/L、4.5 μg/L，表明盡管不同基質(zhì)對標(biāo)準(zhǔn)品的OD450nm值有一定影響，但其IC50變化差異不大，對桿菌肽試劑盒的敏感性和檢測結(jié)果影響不大，上述樣品前處理方法是可行的。

2.3 桿菌肽試劑盒檢測限

根據(jù)稱取20份空白樣品依據(jù)該試劑盒提供的檢測方法進(jìn)行測定，結(jié)果均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)差，即為本試劑盒的檢測下限。分別用競爭ELISA法檢測20份陰性豬肉、豬肝、牛奶樣品，測量每個樣品OD450nm值，同時(shí)計(jì)算吸光百分比，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出每個樣品所對應(yīng)的log10[C]值，從而進(jìn)一步計(jì)算出每個樣品中桿菌肽含量。結(jié)果見表1，考慮到實(shí)際檢測工作中的需要和操作方面的誤差，確定試劑盒對豬肉、豬肝的檢測限為20μg/kg；對牛奶的檢測限為26μg/kg。

2.4 準(zhǔn)確度和精密度測試

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準(zhǔn)確度和精密度分別以回收率和變異系數(shù)表示。分別在陰性豬肉、豬肝、牛奶中添加不同濃度的桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度添加5份樣品，共用3個批次試劑盒進(jìn)行檢測，計(jì)算樣品回收率和變異系數(shù)，以評價(jià)試劑盒的準(zhǔn)確度和精密度。

結(jié)果見表2，在豬肉、豬肝、牛奶樣品中添加桿菌肽標(biāo)準(zhǔn)品回收率范圍為70.2%～99.3%，批內(nèi)變異系數(shù)范圍為3.4%～13.0%，批間變異系數(shù)范圍為7.9%～1 0.4%，批間變異系數(shù)小于對應(yīng)的批內(nèi)變異系數(shù)，且均未超過1 5%，表明桿菌肽試劑盒具有較高的準(zhǔn)確度和精密度。

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2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

將桿菌肽試劑盒存放在37℃條件下，于不同時(shí)間制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并作添加回收試驗(yàn)，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線IC50值，各線性相關(guān)系數(shù)，0濃度的OD450nm值（B0）及添加回收率，判斷桿菌肽試劑盒質(zhì)量。

結(jié)果見表3，隨著桿菌肽試劑盒保存時(shí)間的延長，R2、B0值和回收率持續(xù)減小，I C50持續(xù)增大，第9d時(shí)，IC50值和R2變化不大，B0值大于0.5，回收率大于60%，此時(shí)試劑盒仍可用于桿菌肽的檢測，第11d時(shí)，試劑盒各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo)均出現(xiàn)大幅度下降，因此桿菌肽試劑盒在37℃可保存9d，相當(dāng)于2～8℃可保存至少12個月。

3 討論

隨著國家對食品安全的逐步重視，ELISA在農(nóng)藥、獸藥殘留、生物毒素、毒品及真菌毒素等檢測領(lǐng)域的應(yīng)用越來越廣泛，這就對ELISA的準(zhǔn)確度和重復(fù)性提出了更高的要求，必須研究開發(fā)出能夠經(jīng)得起實(shí)際檢驗(yàn)的ELISA試劑盒[7]。

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基質(zhì)效應(yīng)可能抑制免疫結(jié)合反應(yīng)，使競爭效率下降，從而導(dǎo)致曲線異常，斜率減小，IC50增大，靈敏度下降[8]。本試驗(yàn)用桿菌肽試劑盒對PBS、豬肉、豬肝、牛奶樣品4種基質(zhì)所測標(biāo)準(zhǔn)曲線的IC50變化不大，說明不同樣品處理液對桿菌肽試劑盒檢測結(jié)果影響不大，樣品的處理方法是可行的。

經(jīng)調(diào)試，最終研制出用于檢測動物組織和牛奶中桿菌肽的ELISA試劑盒，該桿菌肽試劑盒的線性工作范圍為1.0～81.0μg/L，IC50為3.9μg/L，對豬肉、豬肝的檢測限為20μg/kg，對牛奶的檢測限為26μg/L；豬肉、豬肝、牛奶樣品添加回收率范圍為70.2%～99.3%，批內(nèi)變異系數(shù)范圍為3.4%～1 3.0%，批間變異系數(shù)范圍為7.9%～10.4%，可在2～8℃條件下保存12個月。 □

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