湘中地區(qū)大腸桿菌自家滅活苗的研制與應用

龔澤修

（湖南婁底職業(yè)技術(shù)學院農(nóng)林工程系，湖南婁底 417000）

豬大腸桿菌病是由豬源性致病性大腸桿菌感染引起的以腹瀉為主的消化道傳染病，臨床表現(xiàn)主要為仔豬黃痢、仔豬白痢和水腫病[1]。據(jù)報道，由致病性大腸桿菌引起仔豬腹瀉發(fā)病率達3 5%[2]，死亡率達11.5%～29.5%[3]，尤其是1周齡以內(nèi)的新生仔豬發(fā)病率和死亡率更高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了極大的經(jīng)濟損失。

目前很多豬場通過化學藥物和菌苗接種對豬大腸桿菌病進行防治。由于長期使用大量抗菌藥物，導致產(chǎn)生了許多耐藥性菌株，對本病的治療效果也越來越差。不同豬場的大腸桿菌血清型不同，對藥物的敏感性也不一樣，并導致藥物治療效果并不理想。因此，采用菌苗接種預防本病的發(fā)生十分重要。但由于大腸桿菌血清型多，各地血清型不相同[5]，對本病的預防效果差異非常大。

近年來，湘中某中型豬場持續(xù)暴發(fā)仔豬黃白痢病，用外購疫苗預防和藥物治療效果不佳，給豬場帶來嚴重經(jīng)濟損失。為此，本研究從該豬場分離篩選出地方優(yōu)勢致病性大腸桿菌菌株制成鋁膠滅活苗，經(jīng)臨床應用后，該豬場仔豬黃白痢得到了有效的控制。本研究為中小規(guī)模豬場大腸桿菌病進行生物防治技術(shù)研究具有十分積極的現(xiàn)實指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 分離菌株

分離菌株取自湖南婁底某豬場患黃(白)痢表現(xiàn)嚴重腹瀉癥狀的哺乳仔豬直腸中致病性大腸桿菌，用于菌苗的制造。

1.1.2 試驗動物

45頭妊娠母豬和458頭哺乳仔豬（26日齡左右斷奶），由婁底某大型養(yǎng)豬場提供；體重為20g左右的15只小白鼠由本校實驗室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

本試驗采用麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、血液瓊脂培養(yǎng)基等，配方參照《分子克?。ǖ谌妫?。

1.2 方法

1.2.1 菌株采集

對表現(xiàn)嚴重腹瀉癥狀的哺乳仔豬在直腸內(nèi)用滅菌棉簽采集病料，接種于普通瓊脂糖培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后，挑取表面隆起、圓形、濕潤的粉紅色菌落接種到血液瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h后觀察菌落形態(tài)及溶血等特征，挑取較好的菌落涂片后用革蘭氏染色鏡檢，初步確認為大腸桿菌，再接種于胰蛋白酶黃豆瓊脂斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)2 4 h，作為制苗用菌種。4℃冰箱保存。

1.2.2 自家滅活苗的制備

將制苗用菌種接種于肉湯培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)24h，在培養(yǎng)4h以后每間隔2h測定一次pH值，并不斷調(diào)整pH至7.6，24h后按培養(yǎng)液的0.5%加入無菌葡萄糖液。邊輕輕振蕩邊滴加福爾馬林，使其終濃度為0.3%，37℃滅活。然后進行無菌檢驗，觀察有無細菌生長。無任何細菌生長才是合格菌。將安全合格的菌液按10mg/mL先加入滅菌氫氧化鋁膠，再加入0.1g/L的柳硫汞，充分搖勻后用已滅菌的玻璃瓶分裝，即制成豬大腸桿菌自家滅活苗，可用于實驗，或4℃冰箱保存。

1.2.3 自家滅活苗安全性檢驗

10只小白鼠作為實驗組，每5只為一組，每只腹腔注射滅活苗0.2mL；5只健康小白鼠作為對照組。連續(xù)觀察7d～14d，如3組小白鼠均無異常反應，則證明疫苗安全性檢驗合格。

1.2.4 自家滅活苗效力臨床檢驗

選用同一飼養(yǎng)條件下孕期60d前未接種仔豬黃白痢菌苗的臨床健康母豬45頭進行預防試驗，隨機分為三組，每組15頭，兩組分別用自家滅活苗和外購大腸桿菌苗進行預防，另一組為未免疫空白對照組。自家滅活苗預防組分別于產(chǎn)前28d和14d肌肉注射自家滅活苗5mL，仔豬在7日齡每頭腹腔注射自家滅活苗2mL；外購苗預防組同樣在產(chǎn)前28d和14d各肌肉注射外購苗5mL，所產(chǎn)仔豬7日齡每頭腹腔注射外購苗2mL。對照組不進行免疫接種。

2 結(jié)果

2.1 細菌形態(tài)和培養(yǎng)特性

從發(fā)病仔豬分離出的大腸桿菌菌株，在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長出邊緣整齊、表面光滑濕潤、稍隆起、直徑在1.5～2mm之間的粉紅色的圓形菌落；且在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上形成表面光滑濕潤、半透明的灰白色圓形菌落，證明可能是大腸桿菌。

通過分離菌株、涂片、革蘭氏染色，鏡檢后見有粗短、兩端鈍圓的桿菌，其長約1～3μm，寬約0.4～0.7μm，且呈單個散開，個別成雙排列。鏡檢中未發(fā)現(xiàn)芽孢和革蘭氏陰性菌，符合大腸桿菌的典型形態(tài)特征。

2.2 自家滅活苗安全性檢驗結(jié)果

用自制的大腸桿菌滅活苗接種小白鼠，連續(xù)觀察10～14d，小白鼠均無異常反應和死亡。

2.3 自家滅活苗效力的臨床試驗結(jié)果

通過菌苗效力臨床試驗觀察哺乳仔豬腹瀉發(fā)病率和死亡率，記錄每組母豬產(chǎn)下的哺乳仔豬腹瀉發(fā)病率和死亡率。見表1。

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從表中可知，自家滅活苗預防組仔豬腹瀉發(fā)病率為5.80%，外購菌苗預防組為23.02%，對照組為46.71%，表明大腸桿菌自家滅活苗對仔豬腹瀉有明顯的預防效果。從死亡情況上看，自家滅活苗預防組致死率為11.11%，外購菌苗預防組致病率為17.14%、對照組致死率為21.1 3%。由此可見，使用大腸桿菌自家滅活苗可以顯著降低仔豬大腸桿菌性腹瀉發(fā)病率，提高仔豬成活率，顯著降低治療費用。

3 討論

3.1 我國各地分離的致病性大腸桿菌優(yōu)勢血清型種類差異較大，不同養(yǎng)豬場的血清型差異也很大，在不同血清型之間的抗原交叉保護性較弱，用標準菌株制造的菌苗得不到預期理想的預防效果。因此，用湘中丘陵區(qū)本地豬場分離的菌株，制備相應的佐劑滅活菌苗，菌苗針對性強，安全性好，預防豬大腸桿菌病效果好。

3.2 大腸桿菌是條件性致病菌，防制該病的關(guān)鍵是要以預防為主，平時要加強母豬飼養(yǎng)管理，搞好環(huán)境衛(wèi)生，提高仔豬抗病能力，定期消毒，消除各種發(fā)病誘因。 □

[1]斯特勞.豬病學(第八版)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)大學出版社，2009:445～483.

[2]王多福,魏玉明,馮國廷.仔豬大腸肝菌滅活苗的研制及效果觀察[J].中國動物檢疫，2000,17(5)：29～30.

[3]施啟順.豬腸毒素大腸桿菌病抗性基因及抗病育種[A].第11次全國動物遺傳育種學術(shù)會議論文集（中國動物遺傳育種研究進展）[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科技出版社,2001,329～333.

[4]禹濱,楊麗君,高英啟,等.綜合應用疫苗和抗血清防治仔豬大腸桿菌病試驗[J].河北畜牧獸醫(yī),2002,18(8):17.