以J亞型禽白血病病毒LTR為啟動(dòng)子的真核表達(dá)載體構(gòu)建

王 蓓，陳宗艷，李傳峰，孟春春，王桂軍，劉光清*

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230036；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

J亞型禽白血病病毒（Subgroup J avian leukosis virus，ALV-J）屬于甲型反轉(zhuǎn)錄病毒屬，其中，長末端重復(fù)序列（LTR）位于ALV-J前病毒基因組的兩側(cè)，其結(jié)構(gòu)由U3、R和U5 3部分組成[1]。LTR包含了一些與轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的順式作用元件，例如，5'LTR具有類似RNA聚合酶II啟動(dòng)子的作用元件，而5'LTR中的U3區(qū)具有增強(qiáng)子和一些轉(zhuǎn)錄調(diào)控信號(hào)功能[2]，R序列起始端約25 bp為RNA聚合酶II結(jié)合的序列[3]。3'LTR雖然具有與5'LTR一樣的序列結(jié)構(gòu)，但僅具有終止轉(zhuǎn)錄和聚腺苷酸化功能，不能作為啟動(dòng)子和增強(qiáng)子[4-5]；3'LTR的R區(qū)與逆轉(zhuǎn)錄病毒RNA的加工成熟有關(guān)[2]。反轉(zhuǎn)錄病毒的LTRs已被證實(shí)能夠選擇性啟動(dòng)鄰近基因的表達(dá)[6]，趙文明等利用禽網(wǎng)狀內(nèi)皮組織增生病病毒（Reticuliendotheliosis virus，REV）的LTR元件構(gòu)建了表達(dá)外源基因的表達(dá)質(zhì)粒[7]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上[1]，以ALV-J的LTR為啟動(dòng)子元件構(gòu)建可以在多種細(xì)胞中表達(dá)外源基因的真核表達(dá)載體，為研發(fā)基因輸送或DNA疫苗載體提供有價(jià)值的參考信息。

1 材料和方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 含有ALV-J全基因組的重組質(zhì)粒pSK-ALV[8]由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存；pBluescript IISK（+）載體、pEGFP-C3質(zhì)粒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞，293T細(xì)胞、BHK細(xì)胞和NDV NP單克隆抗體（MAb）由本實(shí)驗(yàn)保存；SPF雞胚購自北京勃林格殷格翰公司；雞胚成纖維細(xì)胞（CEF）：取9日齡～11日齡SPF雞胚，常規(guī)操作制備CEF；限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa公司；轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購自英俊公司；兔抗GFP多克隆抗體、辣根過氧化物酶（HRP）及FITC標(biāo)記山羊抗兔lgG、HRP標(biāo)記山羊抗鼠lgG購自北京康為生物科技有限公司；鼠抗β-actin多克隆抗體購自上海西美生物科技有限公司；去內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒為OMEGA產(chǎn)品；DNA回收試劑盒和質(zhì)粒抽提與純化試劑盒購自AxyGen公司；DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì) 參照pEGFP-C3（U57607.1）、NDV Lasota株（AF077761）和ALV-J經(jīng)典株SD07LK1（FJ216405.1）序列設(shè)計(jì)引物，由上海杰李生物技術(shù)有限公司合成（表1）。

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 利用PCR的方法，以pSK-ALV為模板，擴(kuò)增5'LTR和3'LTR序列；以pEGFP-C3為模板擴(kuò)增eGFP基因；使用表1中的限制性內(nèi)切酶將3'LTR、5'LTR和eGFP基因依次插入pBluescript II SK（+）載體中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSKLTR-eGFP。

以NDV Lasota株的基因組為模板，使用PCR方法擴(kuò)增出NP基因；利用SalⅠ和ClaⅠ酶切位點(diǎn)，將NP基因置換pSK-LTR-eGFP中的eGFP基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pSK-LTR-NP。所構(gòu)建的重組質(zhì)粒均經(jīng)酶切和序列測(cè)定進(jìn)行鑒定。

表1 PCR擴(kuò)增引物Table 1 PCR primers used in this studies

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 使用OMEGA質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行重組質(zhì)粒的提取，按LiptofectaminTM2000說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將pSK-LTR-eGFP、pSK-LTR-NP、pEGFPC3分別轉(zhuǎn)導(dǎo)入長滿90%的293T細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞和CEF細(xì)胞，5 h后更換完全培養(yǎng)基，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)和觀察。

1.5 RT-PCR檢測(cè) 收集pSK-LTR-eGFP轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的293T細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞和CEF細(xì)胞，提取細(xì)胞中總RNA。以特異性引物對(duì)eGFP-F/R，進(jìn)行RT-PCR，擴(kuò)增報(bào)告基因eGFP。

1.6 Western blot檢測(cè) 將pSK-LTR-eGFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞和CEF細(xì)胞，培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，以兔抗GFP多克隆抗體1∶1 000稀釋為一抗，山羊抗兔HRP-lgG 1∶1 000稀釋為二抗，進(jìn)行western blot檢測(cè)。

pSK-LTR-NP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，以NP MAb 1∶500稀釋做為一抗，山羊抗鼠HRP-lgG 1∶1 000稀釋為二抗，進(jìn)行western blot檢測(cè)。

1.7 流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè) pSK-LTR-eGFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，取轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)12 h、24 h、36 h、48 h和72 h的293T細(xì)胞，分散細(xì)胞至密度為1×106個(gè)/mL，采用流式細(xì)胞儀分析，以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，設(shè)定eGFP陽性細(xì)胞區(qū)（M 1區(qū)）使陰性對(duì)照M 1區(qū)細(xì)胞數(shù)不超過0.1%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用轉(zhuǎn)染率和熒光指數(shù)（FI）表示。轉(zhuǎn)染率即eGFP陽性細(xì)胞陽性率，F(xiàn)I主要反映了目的基因的表達(dá)效率，分別用下列公式計(jì)算：

轉(zhuǎn)染率=樣品M 1區(qū)細(xì)胞百分率-陰性對(duì)照M 1區(qū)細(xì)胞百分率；

FI=樣品M 1區(qū)細(xì)胞百分率×樣品M 1區(qū)平均熒光強(qiáng)度-陰性對(duì)照M 1區(qū)細(xì)胞百分率×陰性對(duì)照M 1區(qū)平均熒光強(qiáng)度。由于減數(shù)很小，一般情況下可忽略不計(jì)。

2 結(jié) 果

2.1 eGFP轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞鑒定 將pSK-LTR-eGFP重組質(zhì)粒和pEGFP-C3質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞、BHK細(xì)胞和CEF細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h于熒光顯微鏡下觀察，兩質(zhì)粒在3種細(xì)胞均可見較強(qiáng)的綠色熒光，表明eGFP均獲得表達(dá)（圖1）。

A1:293T transfected w ith pSK-LTR-eGFP;A2:293T transfected with pGEFG-C3;B1:BHK-21 transfected with pSK-LTR-eGFP;B2:BHK-21 transfected with pGEFG-C3;C1:CEF transfected w ith pSK-LTR-eGFP;C2:CEF transfected w ith pGEFG-C3

2.2 RT-PCR鑒定 以eGFP-F、eGFP-R為引物，對(duì)pSK-LTR-eGFP和pEGFP-C3分別轉(zhuǎn)染后的293T細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞和CEF細(xì)胞中提取的總RNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段約800 bp，大小與預(yù)期相符（圖2）。

圖2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Identification of eGFP'smRNA by RT-PCR

2.3 Western blot檢測(cè) 將pSK-LTR-eGFP和pEGFPC3分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞、BHK細(xì)胞和CEF細(xì)胞，western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染不同種類細(xì)胞后，均出現(xiàn)一條約29 ku的條帶（圖3），與eGFP蛋白理論值符合，其中以β-actin作為內(nèi)參蛋白，大小為42 ku。

圖3 eGFP在293T細(xì)胞、BHK-21細(xì)胞和CEF細(xì)胞中的表達(dá)Fig.3 Expression identification of eGFP gene in the 293T cell,BHK-21 cell and CEF cell

2.4 定量分析 pSK-LTR-eGFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，應(yīng)用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀，檢測(cè)出不同時(shí)間點(diǎn)eGFP報(bào)告基因的動(dòng)力學(xué)檢測(cè)（圖 4）。結(jié)果表明，pSK-LTR-eGFP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞12 h之后，eGFP在細(xì)胞中出現(xiàn)明顯的熒光信號(hào)，其表達(dá)效率為10%；隨著時(shí)間的延長，eGFP的表達(dá)量明顯增長，攜帶報(bào)告基因的293T細(xì)胞增多；根據(jù)增長曲線分析，12 h至24 h的表達(dá)量的增幅最大，24 h表達(dá)效率（26%）是12 h（9%）的兩倍以上；在培養(yǎng)36 h之后，eGFP的表達(dá)效率仍在緩慢增長，但增長幅度明顯縮小，表達(dá)效率趨于穩(wěn)定，并在48 h時(shí)，eGFP表達(dá)量達(dá)到峰值，此時(shí)細(xì)胞的狀態(tài)最佳；48 h之后，由于細(xì)胞開始變圓破損脫落，其表達(dá)量下降，熒光的亮度也發(fā)生改變。

圖4 eGFP基因在293T細(xì)胞中表達(dá)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)Fig.4 The kinetics identificaition of the expression of eGFP in 293T

2.5 NP基因在293T細(xì)胞中的表達(dá) 將pSK-LTRNP轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，48 h后收集并裂解細(xì)胞，western blot檢測(cè)NP基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，出現(xiàn)一條約53 ku的條帶（圖5），與NP蛋白理論值相符，其中以β-actin作為內(nèi)參蛋白，表明攜帶的外源基因獲得正確表達(dá)。

圖5 Western blot檢測(cè)NP基因的表達(dá)Fig.5 Expression identification of NP gene by western blot

3 討 論

ALV-JLTR包含有與轉(zhuǎn)錄起始與調(diào)控有關(guān)的順式作用元件，可以良好啟動(dòng)外源基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[1]。因此，一些逆轉(zhuǎn)錄病毒的LTR元件已被應(yīng)用于構(gòu)建真核表達(dá)載體，如REV、牛泡沫病毒（BFV）、勞斯肉瘤病毒（RSV）和人免疫缺陷病毒（HIV）等[4-6]。目前還沒有應(yīng)用ALV-J的LTR構(gòu)建真核表達(dá)載體的報(bào)道。本研究將ALV-J的5'和3'LTR插入常用轉(zhuǎn)錄載體pBluescript IISK（+）中，利用綠色熒光蛋白檢測(cè)LTR在多種細(xì)胞中啟動(dòng)基因表達(dá)的能力。研究結(jié)果表明，ALV-J的LTR可以在293T、BHK-21和CEF細(xì)胞中啟動(dòng)報(bào)告基因的表達(dá)，證明以ALV-JLTR為啟動(dòng)子構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒是可行的。對(duì)報(bào)告基因在293T細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)表達(dá)規(guī)律進(jìn)行檢測(cè)和分析，結(jié)果顯示重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞12 h時(shí)eGFP開始表達(dá)，到48 h表達(dá)量達(dá)到峰值，熒光指數(shù)達(dá)40%。

為驗(yàn)證所構(gòu)建的真核表達(dá)載體是否可以良好的表達(dá)禽源病毒的基因，本研究將NDV的NP基因插入ALV-J 5'LTR和3'LTR間，并轉(zhuǎn)染細(xì)胞。試驗(yàn)結(jié)果顯示NDV NP基因獲得良好表達(dá)，表明本文構(gòu)建的表達(dá)載體有望用于構(gòu)建禽源病毒的DNA疫苗或靶基因的輸送。

真核表達(dá)載體的啟動(dòng)子和增強(qiáng)子的強(qiáng)弱以及之間的搭配是影響外源基因表達(dá)的主要因素。有文獻(xiàn)表明，ALV-J的LTR中，U5區(qū)對(duì)基因表達(dá)存在負(fù)調(diào)控作用[1]，ALV-J為適應(yīng)體外的細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境，通過改變LTR與細(xì)胞相互作用的結(jié)合基序來提高病毒LTR的啟動(dòng)子活性，從而使病毒的復(fù)制能力增強(qiáng)[9]。因此，選擇適合的動(dòng)物細(xì)胞也可以提高外源基因的表達(dá)水平。LTR對(duì)病毒DNA整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組和控制病毒RNA合成均有重要作用，ALV-J感染宿主后，其前病毒cDNA可以整合于宿主細(xì)胞的基因組中[1]；Isfort等發(fā)現(xiàn)，ALV-J和馬立克病毒（MDV）共感染細(xì)胞后，ALV-JLTR可以整合于MDV的基因組中[10]。因此，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的表達(dá)載體更適合體外細(xì)胞系的建立和帶有報(bào)告基因的表達(dá)。

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