利用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定瘤胃液中幾種水溶性維生素

趙蕓君 孟慶翔

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院肉牛研究中心，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193;2.新疆畜牧科學(xué)院飼料研究所，烏魯木齊 830000)

水溶性維生素對(duì)反芻動(dòng)物及其瘤胃微生物的正常生命活動(dòng)具有重要作用，測(cè)定瘤胃液中水溶性維生素含量可為反芻動(dòng)物瘤胃中水溶性維生素合成、代謝及營(yíng)養(yǎng)相關(guān)研究提供參考。由于水溶性維生素的易被破壞性和瘤胃液中水溶性物質(zhì)成分的復(fù)雜性，因而使同時(shí)測(cè)定瘤胃液中水溶性維生素成為一項(xiàng)難題。目前國(guó)內(nèi)外反芻動(dòng)物瘤胃營(yíng)養(yǎng)研究中水溶性維生素的測(cè)定主要采用微生物法或針對(duì)一種維生素的高效液相色譜(HPLC)法，上述方法均具有繁瑣、耗時(shí)且僅針對(duì)一種維生素測(cè)定等缺點(diǎn)。目前，在奶粉［1］、食品［2］和藥物［3］等方面已開展了利用HPLC同時(shí)測(cè)定幾種水溶性維生素方法的研究，而關(guān)于瘤胃液中幾種水溶性維生素的同時(shí)測(cè)定僅見Aruna等［4］的報(bào)道，并且該方法存在回收率相對(duì)較低且使用了對(duì)液相色譜柱柱效及泵損害較大的離子對(duì)試劑的問題。鑒于此，在參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)和了解瘤胃液成分的基礎(chǔ)上，擬對(duì)采用HPLC同時(shí)測(cè)定瘤胃液中幾種水溶性維生素的方法進(jìn)行摸索，旨在建立一種較為準(zhǔn)確、實(shí)用的同時(shí)測(cè)定瘤胃液中幾種水溶性維生素的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent1100型HPLC儀(美國(guó)Agilent公司);紫外檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司);色譜柱:SBC8色譜柱，粒徑 5 μm，4.6 mm ×150 mm(美國(guó) Agilent公司);氮吹儀(天津奧特賽恩斯儀器公司);超純水器(美國(guó)Millpore公司);超聲波破碎儀(寧波新芝生物科技股份有限公司);AL－01溶劑過濾器(天津奧特賽恩斯儀器公司);低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司);pH酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)。

硫胺素(標(biāo)準(zhǔn)品，99.9%)、維生素C(標(biāo)準(zhǔn)品，99.9%)、煙酸(標(biāo)準(zhǔn)品，99.9%)、煙酰胺(標(biāo)準(zhǔn)品，99.7%)、氰鈷胺素(標(biāo)準(zhǔn)品，98.5%)、核黃素(標(biāo)準(zhǔn)品，99.0%)、吡哆醇(標(biāo)準(zhǔn)品，99.9%)、葉酸(標(biāo)準(zhǔn)品，98.0%)，均為美國(guó)Supelco公司產(chǎn)品;甲醇(色譜純)，為美國(guó)Fisher公司產(chǎn)品;磷酸三鈉(分析純)，為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;正己烷(色譜純)、鹽酸(優(yōu)級(jí)純)、碳酸鈉(分析純)和偏磷酸(分析純)，均購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司;超純水為Millpore超純水機(jī)自制，電阻率18.2 MΩ。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)液及流動(dòng)相的配制

標(biāo)準(zhǔn)貯備液:準(zhǔn)確稱取維生素C、吡哆醇、煙酸、煙酰胺、氰鈷胺素各10 mg于10 mL容量瓶中，用0.01 mol/L鹽酸溶解并定容至刻度。準(zhǔn)確稱取5 mg核黃素于100 mL容量瓶中，用0.01 mol/L鹽酸溶解并定容至刻度;準(zhǔn)確稱取5 mg葉酸于50 mL容量瓶中，用0.1 mol/L碳酸鈉溶液溶解，調(diào)pH至7.0并定容至刻度。將上述標(biāo)準(zhǔn)貯備液于4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。維生素C標(biāo)準(zhǔn)貯備液現(xiàn)用現(xiàn)配。

標(biāo)準(zhǔn)工作液:將標(biāo)準(zhǔn)貯備液用超純水稀釋成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液，冰箱4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

流動(dòng)相:0.05 mol/L 磷酸三鈉(pH=2.5)經(jīng)溶劑過濾器抽濾后備用。流動(dòng)相A為體積比為7∶93的甲醇與 0.05 mol/L 磷酸三鈉(pH=2.5)混合液，流動(dòng)相 B為體積比為90∶10的甲醇與0.05 mol/L磷酸三鈉(pH=2.5)混合液。

1.3 瘤胃液樣品的前處理

瘤胃液采用4層紗布過濾后經(jīng)5 400 r/min(4℃)離心15 min，取上清液5 mL置于冰水浴中采用150 W超聲破碎4 min(鏡檢無完整細(xì)胞)，然后加入2 mL正己烷混勻后靜置分層，棄去上層取下層瘤胃液加入質(zhì)量濃度為25%的偏磷酸0.6 mL，在渦旋震蕩器上混勻后在冰水浴中放置30 min。經(jīng)10 000 r/min(4℃)離心10 min，取上清液在40℃水浴下用氮?dú)獯蹈?，?.8 mL流動(dòng)相A溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾上機(jī)分析測(cè)定。在操作過程中盡量避光。

1.4 色譜條件

SBC8色譜柱:粒徑 5 μm，4.6 mm ×150 mm;檢測(cè)波長(zhǎng):245 nm;20 μL定量環(huán);柱溫:室溫;流速:1.0 mL/min。梯度洗脫條件:流動(dòng)相 A從0 min的100%減至22 min的40%，流動(dòng)相B從0 min的0升至22 min的60%。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)采用SAS 8.2進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，顯著性水平為P＜0.05。數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的篩選

2.1.1 超聲破碎

瘤胃液超聲破碎條件采用功率150 W，工作5 s，間隔5 s，冰水浴超聲4 min后鏡檢無完整細(xì)胞。采用3種不同梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)混合工作液分別進(jìn)行超聲和未超聲處理后進(jìn)樣，經(jīng)t檢驗(yàn)可知，該超聲破碎條件對(duì)幾種水溶性維生素的含量無顯著影響(P ＞0.05)，詳見表1。

2.1.2 凈化和脂肪、蛋白質(zhì)的去除

由于生物發(fā)酵液成分非常復(fù)雜，有許多物質(zhì)會(huì)干擾維生素的測(cè)定，試驗(yàn)采用黃曉蘭［5］報(bào)道的自制酸性氧化鋁小柱。取70～100目的酸性氧化鋁，濕法裝填成長(zhǎng)3～4 cm的小柱，分別用10 mL水及10 mL甲醇沖洗后，取一定量樣品溶液過柱，用5%的乙酸洗脫，合并流出液和洗脫液定容后過膜測(cè)定。測(cè)定結(jié)果發(fā)現(xiàn)硫胺素、維生素C的分離效果不好，吡哆醇、煙酰胺、煙酸的回收率不理想，且需濃縮的體積大。用C18小柱處理［6］，可除去部分蛋白質(zhì)、色素及脂類物質(zhì)，但測(cè)定效果也不是很好?？紤]到自制酸性氧化鋁小柱和用C18小柱處理較麻煩，后參考Rizzolo等［7］的方法采用正己烷去除瘤胃液中脂肪。由于偏磷酸具有沉淀蛋白質(zhì)、保護(hù)水溶性維生素和絡(luò)合瘤胃液中微量金屬離子的作用［8］，同時(shí)借鑒瘤胃液通常去除蛋白質(zhì)的方法(加入25%的偏磷酸)［9］。試驗(yàn)結(jié)果表明偏磷酸對(duì)硫胺素的測(cè)定有干擾，但對(duì)其他水溶性維生素的測(cè)定無干擾，最終選偏磷酸作為蛋白質(zhì)沉淀劑。

采集飼喂5種不同飼糧［高蛋白質(zhì)水平全混合日糧(TMR)、中蛋白質(zhì)水平TMR、低蛋白質(zhì)水平TMR、青綠飼料飼糧、粗飼料飼糧］的肉牛瘤胃液，分別取5 mL(n=4)瘤胃液經(jīng)超聲破碎和去脂后分別添加 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 25%的偏磷酸，混勻后在冰水浴中放置30 min，然后4℃離心去除蛋白質(zhì)。結(jié)果表明:添加0.6 mL 25%的偏磷酸已完全能使上述5組瘤胃液中的蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，對(duì)硫胺素的測(cè)定有干擾，但對(duì)維生素C、吡哆醇、煙酰胺、煙酸、葉酸、核黃素、氰鈷胺素的測(cè)定沒有干擾。

表1 超聲破碎對(duì)幾種水溶性維生素含量的影響Table 1 Effects of ultrasonicdisruption on contents of several water-soluble vitamins(n=3) ng/mL

2.1.3 濃縮

通常，水溶性維生素在瘤胃液中的含量很低，且受飼喂飼糧的影響其變化幅度很大，因此瘤胃液中水溶性維生素未經(jīng)濃縮時(shí)，常因含量較低而檢測(cè)不到，所以本試驗(yàn)采用40℃水浴氮?dú)獯蹈傻姆椒饪s瘤胃液，以便提高該方法的適用性。

2.2 色譜條件

文獻(xiàn)報(bào)道的 HPLC 同時(shí)測(cè)定奶粉［1］、食品［2］和藥物［3］中水溶性維生素的方法常采用離子對(duì)試劑，但考慮到其對(duì)色譜柱柱效及泵的損害較大，因而從實(shí)用性角度考慮應(yīng)避免使用離子對(duì)試劑。測(cè)定水溶性維生素常用反相柱C18、C8，酸性的色譜條件有利于大多數(shù)水溶性維生素的穩(wěn)定，且SBC8色譜柱的pH適宜范圍為2～8，因此本試驗(yàn)選用反相 SBC8色譜柱(粒徑 5 μm，4.6 mm ×150 mm)，流動(dòng)相為甲醇和0.05 mol/L磷酸三鈉(pH=2.5)的緩沖體系。

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化和測(cè)定水溶性維生素的種類

由于瘤胃液基體較復(fù)雜，保留時(shí)間的推遲將有利于各水溶性維生素組分的分離。流動(dòng)相中甲醇含量逐漸降低，可使各水溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)峰的保留時(shí)間逐漸推遲且各物質(zhì)的分離度增加。經(jīng)測(cè)定，瘤胃液樣品流動(dòng)相配比確定為:流動(dòng)相A，甲醇與0.05 mol/L磷酸三鈉(pH=2.5)的體積比為7∶93;流動(dòng)相 B，甲醇與 0.05 mol/L 磷酸三鈉(pH=2.5)的 體 積 比 為 90∶10;流 速 為1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為245 nm。梯度洗脫條件確定為:流動(dòng)相A從0 min的100%降至22 min的40%，流動(dòng)相B從0 min的0升至22 min的60%。采用上述色譜條件，硫胺素、維生素C、吡哆醇、煙酰胺、煙酸、葉酸、核黃素、氰鈷胺素這8種水溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖見圖1。

圖1 水溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.1 Chromatogram of water-soluble vitamin standard samples

2.3 標(biāo)準(zhǔn)液的穩(wěn)定性試驗(yàn)

由于維生素穩(wěn)定性差，對(duì)光、熱、氧、酸、堿和酶等比較敏感，易于氧化分解破壞，為此在操作過程應(yīng)盡量避光，樣品保存在低溫冰箱中盡快分析。參考文獻(xiàn)［2］對(duì)水溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)液穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn):除葉酸用0.01 mol/L鹽酸配制的標(biāo)準(zhǔn)液穩(wěn)定性稍差外，其他維生素的穩(wěn)定性均較好。而葉酸采用0.1 mol/L碳酸鈉溶液溶解并調(diào)pH至7.0作為貯備液時(shí)，效果較好。研究發(fā)現(xiàn)，本試驗(yàn)所配制的水溶性維生素(除維生素C外)貯備液至少可穩(wěn)定30d，而標(biāo)準(zhǔn)工作液除維生素C能至少穩(wěn)定8 h外，其余都至少可穩(wěn)定72 h。

2.4 方法考察及性能指標(biāo)

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍及最低檢出限

8種水溶性維生素的線性范圍和峰面積(X)對(duì)質(zhì)量濃度(Y，ng/mL)的回歸方程分別為硫胺素0.5 ～ 50.0 μg/mL，Y=1.613X － 0.901 4(r=0.992 1);維生素 C 0.25 ～ 90.00 μg/mL，Y=2.132X －2.901 4(r=0.999 1);吡哆醇 0.6 ～30.0 μg/mL，Y=0.275X －0.487 6(r=0.999 9);煙酰胺0.5 ～50.0 μg/mL，Y=0.940 7X+2.839 8(r=0.999 9);煙 酸 0.5 ～ 50.0 μg/mL，Y=1.631X －7.848 1(r=0.999 3);葉 酸 0.6 ～30.0 μg/mL，Y=0.186 4X － 1.574 4(r=0.990 3); 核 黃 素 0.6 ～ 30.0 μg/mL，Y=0.685 5X －1.023 7(r=0.999 0);氰鈷胺素0.2 ～50.0 μg/mL，Y=2.120 7X － 1.214 9(r=0.999 5)。按信噪比(S/N=3)計(jì)算，得出硫胺素、維生素 C、吡哆醇、煙酰胺、煙酸、葉酸、核黃素、氰鈷胺素的最小檢出質(zhì)量濃度分別為18.21、4.81、39.40、12.90、12.00、74.11、24.00、9.57 ng/mL。

2.4.2 方法的回收率、精密度

取肉牛瘤胃液按1.3和1.4操作進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)本試驗(yàn)方法對(duì)瘤胃液中硫胺素、維生素C、吡哆醇未實(shí)現(xiàn)基線分離，因此僅對(duì)煙酰胺、煙酸、葉酸、核黃素、氰鈷胺素進(jìn)行瘤胃液樣品加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)。

取3頭肉牛的瘤胃液混勻分成多份備用，其將用于瘤胃液的本底測(cè)定、精確度試驗(yàn)和回收率加標(biāo)試驗(yàn)。取其中5份分別用于測(cè)定瘤胃液中水溶性維生素的本底值，計(jì)算煙酰胺、煙酸、葉酸、核黃素、氰鈷胺素的保留時(shí)間和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。由表2可知，煙酰胺、煙酸、葉酸、核黃素、氰鈷胺素測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.1% 、2.3% 、8.1% 、6.5% 、3.9% ，保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 0.24%、0.27%、0.41%、0.33%、0.36%。瘤胃液樣品中水溶性維生素的色譜圖見圖2。

圖2 瘤胃液樣品中水溶性維生素的色譜圖Fig.2 Chromatogram of water-soluble vitamins in rumen fluid sample

表2 精密度測(cè)定結(jié)果Table 2 Measured results of precision(n=5)

取上述3頭肉牛的瘤胃液混合樣品3份，分別按表3所述添加各水溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制成高、中、低3個(gè)水平的瘤胃液樣品，然后將制成的高、中、低水平的瘤胃液樣品再分別分成3份，每份分別按1.3和1.4操作進(jìn)行測(cè)定，扣除瘤胃液樣品中空白水溶性維生素含量(即瘤胃液水溶性維生素的本底值，見表2)，計(jì)算瘤胃液樣品中加標(biāo)水溶性維生素的回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。由表3可知，瘤胃液樣品中加標(biāo)煙酰胺、煙酸、葉酸、核黃素和氰鈷胺素的平均回收率分別為97.5%、96.8%、73.2%、84.4%、89.1% ，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為 2.9% 、3.0% 、15.6% 、7.8% 、5.0% 。鑒于在本研究色譜條件下，測(cè)定瘤胃液中葉酸、核黃素和氰鈷胺素時(shí)出現(xiàn)了基線漂移，同時(shí)參考我國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)許多檢測(cè)方法中規(guī)定在重復(fù)條件下2次測(cè)定結(jié)果要求相對(duì)偏差小于5%，因此，確定本研究的方法僅用于測(cè)定瘤胃液中煙酰胺和煙酸的含量。

2.5 肉牛飼喂不同飼糧時(shí)瘤胃液樣品的測(cè)定

選9頭肉牛，分為3組，分別飼喂高精料飼糧、青綠飼料飼糧、粗飼料飼糧，采集每頭肉牛的瘤胃液，分別按1.3和1.4所述測(cè)定瘤胃液中煙酰胺和煙酸含量。由表4可知，高精料飼糧組和青綠飼料飼糧組瘤胃液中煙酰胺的含量顯著高于粗飼料飼糧組(P＜0.05);瘤胃液中煙酸的含量各組間差異不顯著(P＞0.05)。

3 討論

3.1 瘤胃液中水溶性維生素的測(cè)定方法

關(guān)于瘤胃液中水溶性維生素的測(cè)定方法，主要集中在針對(duì)一種水溶性維生素采用一種檢測(cè)方法［10］，雖然 Aruna 等［4］對(duì)瘤胃液中煙酸、吡哆醇、硫胺素和核黃素4種水溶性維生素的同時(shí)測(cè)定方法進(jìn)行了研究，但該方法使用了對(duì)液相色譜柱柱效及泵損害較大的離子對(duì)試劑且回收率較低，煙酸、吡哆醇、硫胺素和核黃素的回收率分別為84.7% ～94.4%，86.5% ～ 94.3%，84.2% ～93.8%和 80.3% ～ 90.9%。與上述方法［4］相比，本試驗(yàn)建立的方法采用了一種色譜條件同時(shí)完成瘤胃液中煙酰胺和煙酸的測(cè)定，且具有回收率(煙酰胺97.5%、煙酸96.8%)相對(duì)較高和未使用離子對(duì)試劑的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，本試驗(yàn)建立的檢測(cè)方法也適用于飼糧中外源添加煙酰胺和煙酸后瘤胃液中煙酰胺、煙酸的檢測(cè)。

表3 回收率測(cè)定結(jié)果Table 3 Measured results of recovery(n=3)

表4 瘤胃液中煙酰胺和煙酸的含量Table 4 Contents of niacinamide and nicotinic acid in rumen fluid(n=3) ng/mL

此外，本試驗(yàn)采用的色譜條件可使水溶性維生素混合標(biāo)準(zhǔn)液中的維生素C、吡哆醇、煙酰胺、煙酸、葉酸、核黃素和氰鈷胺素實(shí)現(xiàn)較好的基線分離，由于多維添加劑成分相對(duì)簡(jiǎn)單，因此本試驗(yàn)采用的色譜條件可為多維添加劑中同時(shí)測(cè)定多種水溶性維生素方法的開發(fā)提供參考。

3.2 瘤胃液的前處理方法及影響瘤胃液水溶性維生素測(cè)定結(jié)果的因素分析

本試驗(yàn)選用偏磷酸對(duì)瘤胃液進(jìn)行去蛋白質(zhì)前處理干擾了硫胺素的測(cè)定，據(jù)王希希等［11］報(bào)道，甲醇可沉淀蛋白質(zhì)用于測(cè)定水溶性維生素，因此今后可采用甲醇對(duì)瘤胃液進(jìn)行去蛋白質(zhì)處理，并考察在本試驗(yàn)色譜條件下對(duì)水溶性維生素測(cè)定結(jié)果的影響。本試驗(yàn)采用的色譜條件流速為1 mL/min時(shí)，瘤胃液中的吡哆醇未完全實(shí)現(xiàn)基線分離，當(dāng)流速為0.9 mL/min時(shí)，也未完全實(shí)現(xiàn)基線分離。今后可采取降低流速或優(yōu)化色譜的其他條件，使瘤胃液中的吡哆醇最終實(shí)現(xiàn)基線完全分離。而對(duì)于硫胺素、維生素C，需繼續(xù)研究瘤胃液前處理方法以進(jìn)一步凈化瘤胃液，以及降低流速或優(yōu)化色譜的其他條件，使瘤胃液中硫胺素、維生素C最終實(shí)現(xiàn)基線完全分離。

本試驗(yàn)采用的色譜條件測(cè)定瘤胃液中葉酸、核黃素和氰鈷胺素出現(xiàn)了基線漂移，原因可能與流動(dòng)相是梯度洗脫以及瘤胃液樣品本底在檢測(cè)波長(zhǎng)有吸收有關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，葉酸雖然實(shí)現(xiàn)了基線分離，但回收率偏低和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，原因可能與葉酸在酸性條件下易被破壞有關(guān)，也即在本試驗(yàn)中瘤胃液經(jīng)25%的偏磷酸沉淀蛋白質(zhì)后以及被溶解在pH=2.5的酸性流動(dòng)相A中均受到破壞，所以本試驗(yàn)建立的瘤胃液前處理方法和色譜條件更適用于在酸性溶液中能穩(wěn)定存在的水溶性維生素，如煙酸和煙酰胺。本試驗(yàn)中核黃素、氰鈷胺素的回收率偏低和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，原因可能與核黃素、氰鈷胺素出現(xiàn)了基線漂移有關(guān)，并可能與核黃素易見光分解有關(guān)。在整個(gè)檢測(cè)過程中作者用錫箔紙保護(hù)盡量避光，但依舊出現(xiàn)核黃素回收率較低和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，更具體原因有待進(jìn)一步分析。因此，為實(shí)現(xiàn)同時(shí)測(cè)定瘤胃液中多種水溶性維生素，需在本試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件，解決基線漂移的問題，同時(shí)沉淀蛋白質(zhì)時(shí)采用冷乙醇或甲醇，以避免酸性環(huán)境對(duì)葉酸的破壞以及個(gè)別水溶性維生素測(cè)定的干擾。另也可針對(duì)需要研究的某種特定水溶性維生素進(jìn)行色譜條件優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)基線分離。

3.3 飼喂不同飼糧時(shí)肉牛瘤胃液中煙酰胺和煙酸含量的變化

研究表明，瘤胃中煙酸能轉(zhuǎn)化成煙酰胺［12］，因此，了解瘤胃液中煙酸和煙酰胺的含量對(duì)于深入研究瘤胃的煙酸營(yíng)養(yǎng)以及從煙酸營(yíng)養(yǎng)的角度調(diào)控反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)代謝具有意義。本試驗(yàn)測(cè)定了飼喂3種不同飼糧對(duì)肉牛瘤胃液中煙酰胺和煙酸含量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，高精料飼糧組和青綠飼料飼糧組瘤胃液中煙酰胺的含量顯著高于粗飼料飼糧組;瘤胃液中煙酸的含量各組間差異不顯著。該檢測(cè)結(jié)果與Santschi等［13］報(bào)道的瘤胃液中煙酰胺和煙酸含量的數(shù)值較接近。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)建立的方法相對(duì)簡(jiǎn)單，適用于同時(shí)測(cè)定瘤胃液中煙酰胺和煙酸的含量。

［1］ ALBALA H S，VECIANA N M T，IZQUIERDO P M，et al.Determination of water-soluble vitamins in infant milk by high-performance liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography A，1997，778(1/2):247－253.

［2］ 成志強(qiáng)，孫成均，黎源倩.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定食品和多維片中8種水溶性維生素［J］.分析化學(xué)，2001，29(9):1068 －1071.

［3］ IVANOIC D，POPOVIC A，RADULOVIC D，et al.Reversed-phase ion-pair HPLCdetermination of some water-soluble vitamins in pharmaceuticals［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，1999，18:999－1004.

［4］ ARUNA C，ANUJA D.Simultaneousdetermination of ruminal niacin，pyridoxine，thiamin and riboflavin levels by high performance liquid chromatography［J］.Indian Journal of Animal Sciences，1999，69(8):567－569.

［5］ 黃曉蘭，陳云華.液相色譜法測(cè)定生物發(fā)酵液中水溶性維生素的研究［J］.分析測(cè)試學(xué)報(bào)，1997，16(3):83－85.

［6］ MORENO P，SALVADO V.Determination of eight water-and fat-soluble vitamins in multi-vitamin pharmaceutical formulations by high-performance liquid chromatography［J］.Journal ofChromatography，2000，870(2):207 －215.

［7］ RIZZOLO A，BALDO C，POLESELLO A.Application of high-performance liquid chromatography to the analysis of niacin and biotin in Italian almond cultivars［J］.Journal of Chromatography，1991，553:187 －192.

［8］ 陳驍熠.甜玉米中水溶性維生素含量的HPLC測(cè)定法及其動(dòng)態(tài)變化研究［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001(6):31－32.

［9］ ERWIN E S，MARCO J，EMERY E M.Volatile fatty acid analyses of blood and rumen fluid by gas chroma-tography［J］.Journal of Dairy Science，1961，44:1768－1771.

［10］ AOAC.Official methods of analysis of the association of official analytical chemists［S］.13th ed.Washington，D.C.:Association of Official Analytical Chemists，1980.

［11］ 王希希，胡燕，孫軼卓，等.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定血清中5種水溶性維生素［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，41(1):158 －161.

［12］ MCDOWELL L R.Vitamins in animal and human nutrition［M］.Ames，I.A.:Iowa State University Press，2000:793.

［13］ SANTSCHI D E，CHIQUETTE J，BERTHIAUME R，et al.Effect of the forage to concentrate ratio on B-vitamin concentrations indifferent ruminal fractions ofdairy cows［J］.Canadian Journal of Animal Science，2005，85:389－399.