硒和維生素E對西門塔爾牛瘤胃發(fā)酵和尿嘌呤衍生物含量的影響

張拴林 袁 霞 徐亞光 程建國 武晉孝 聶玉梅 黃應(yīng)祥 楊致玲

(1.山西農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，太谷 030801;2.山西省飼料獸藥監(jiān)察所，太原 030027)

硒是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的組成成分，可通過消除脂質(zhì)過氧化物而保護細胞膜免受損害，參與輔酶A和輔酶Q的生物合成。維生素E是細胞內(nèi)的抗氧化劑，防止生物膜上不飽和脂肪酸被氧化破壞，調(diào)節(jié)性腺發(fā)育，促進促甲狀腺素和促腎上腺皮質(zhì)激素的產(chǎn)生等，硒和維生素E都是動物必需的營養(yǎng)素。山西省屬于全國從東北到西南缺硒帶中的中心區(qū)域，全省有71.7%的縣(市)飼草料中硒含量低于 0.05 mg/kg［1］，因此，在動物飼糧中補充硒對于山西省畜牧業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有重要的意義。Ceballos-Manquez等［2－3］研究發(fā)現(xiàn)給青年母牛補充硒有降低乳腺內(nèi)感染和奶中體細胞數(shù)的趨勢。Dobbelaar等［4］給產(chǎn)前青年母牛每日每頭補充3 000 IU維生素E，顯著提高了血液、肝臟和卵泡液中維生素E的含量。Bouwstra等［5－6］發(fā)現(xiàn)奶牛機體的生理狀況，特別是機體的總抗氧化能力會明顯影響維生素E的功效，處于較高水平氧化應(yīng)激的奶牛，即使補充高劑量維生素E(3 000 IU/d)也會增加臨床型和亞臨床型乳房炎的發(fā)生幾率。在奶牛飼糧中同時添加硒和維生素E，Gupta等［7］證實可防止胎衣不下;董衛(wèi)星等［8］研究認為可提高機體總抗氧化能力;王治華等［9］認為可顯著提高產(chǎn)奶量，但王芳等［10］認為對產(chǎn)奶量、乳脂率和乳蛋白率等均無影響。飼糧中的養(yǎng)分首先必須經(jīng)消化和吸收才能轉(zhuǎn)化為牛乳，因此，研究飼糧中添加硒和維生素E對瘤胃發(fā)酵和飼糧養(yǎng)分消化率等的影響是全面認識上述問題的前提。Shi等［11］研究添加 0.3 ～1.0 mg/kg納米硒對羊瘤胃發(fā)酵有顯著影響;Wang 等［12］和劉強等［13－15］研究了不同硒源及添加水平對牛瘤胃發(fā)酵和嘌呤衍生物的影響，均得出了可提高秸稈養(yǎng)分在瘤胃中的有效降解率的結(jié)論。由于不同硒源的生物效價是不同的，同時由于維生素E添加水平不同，使上述學者在對產(chǎn)奶量影響方面得出了不同的結(jié)論。NRC(1996和2001)肉牛和奶牛營養(yǎng)需要對硒推薦量分別為 0.1 ～ 0.3 mg/kg 和 0.3 mg/kg［16－17］，NRC(2001)奶牛營養(yǎng)需要對維生素E的需要量做了大幅度調(diào)整，對于采食貯存牧草的泌乳牛建議為20 IU/kg，干奶期母牛和青年母牛妊娠最后60d建議為80 IU/kg［17］。同時，有資料證明硒和維生素E協(xié)同在提高機體抗體水平及防止自由基對機體侵害方面所發(fā)揮的作用大于兩者分別作用之和［18－19］。增加維生素 E添加量可減少硒的需要量，因為維生素E可使含硒的氧化型谷胱甘肽變成還原型的谷胱甘肽而節(jié)約硒［20］，而GSH-Px可催化被氧化了的維生素E轉(zhuǎn)變?yōu)檫€原形式的維生素E而減少維生素E的用量［18］。當兩者添加量不適宜時，養(yǎng)分之間失衡，由于硒的需要量與中毒極限量之間差異不大［21］，易造成硒過量中毒，且引起地表水與飲用水污染而危及人類食物鏈。本試驗在飼糧中添加不同水平的硒和維生素E，探討其對西門塔爾閹牛瘤胃發(fā)酵和嘌呤衍生物含量的影響，為在養(yǎng)牛生產(chǎn)實踐中安全、有效和經(jīng)濟地利用硒和維生素E提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設(shè)計

選用4頭裝有永久性瘤胃瘺管、年齡5歲、體重(500±20)kg的西門塔爾閹牛，采用4×4兩因素隨機試驗設(shè)計。硒的4個添加水平分別是0、0.1、0.2 和 0.3 mg/kg，維生素 E 的 4 個添加水平分別是0、30、60和90 IU/kg。本試驗采用亞硒酸鈉(分析純)形式補充硒，所用的維生素E(生化試劑)由成都市科龍化工試劑廠生產(chǎn)，含量≥50%。試驗共分為16個組(表1)，每組為1個階段，每階段預(yù)試期10d，正試期5d。分4期實施本試驗，每期包括4個組，每期按照4×4拉丁方設(shè)計實施。第1、2、3 和 4 期分別為 1、6、11 和 16 組，4、5、10和 15 組，3、8、9 和 14 組，2、7、12 和13 組。

表1 試驗分組Table 1 Grouping of the test

1.2 試驗飼糧和飼養(yǎng)管理

根據(jù)試驗牛的維持營養(yǎng)需要設(shè)計基礎(chǔ)飼糧［21］，基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表2。日進食量為9.0 kg(干物質(zhì))，每日采食精料補充料3.0 kg，玉米青貯6.0 kg。試驗期日喂 2 次(07:00、19:00)，單槽飼養(yǎng)，采取先精后粗的飼喂順序，自由飲水。

1.3 樣品采集及測定

1.3.1 飼料樣品采集與測定

每期試驗前采集該期精料補充料樣品，試驗中逐日采集玉米青貯樣品，分別測定其硒和維生素E的含量。硒含量采用2，3－二氨基萘熒光法測定，維生素E含量采用高效液相色譜法測定。

表2 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 2 Composition and nutrient levels of the basaldiet(DM basis) %

1.3.2 瘤胃液采集與測定

每階段的第13天和第14天，分別在飼喂前(0 h)以及飼喂后3、6和9 h采集瘤胃液，每次采集200 mL，用4層紗布過濾，立即測定pH，然后將瘤胃液分為2份，一份及時測定氨態(tài)氮含量，另一份在－40℃冷凍保存以備測定揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量。氨態(tài)氮含量采用氧化鎂直接蒸餾法測定［22］，VFA含量采用GC102AF氣相色譜儀測定。

1.3.3 瘤胃外流速率的測定

取重鉻酸鈉172 g溶于溫水中，倒入1 000 g玉米秸稈或精料補充料中，不斷攪拌至棕黃色粥狀，將該飼料轉(zhuǎn)移到帶蓋搪瓷盤中，蓋上蓋，置于100℃烘箱中烘24 h取出，取出后放入底部有一細篩網(wǎng)(200目)的桶中，沖洗至水清。將飼料懸于清水中，用維生素C將其pH調(diào)至4，攪拌后靜置12 h，放在65℃電熱恒溫干燥箱中烘24 h制成鉻標記飼料。鉻標記飼料在晨飼時與粗料一起飼喂，每頭牛300 g，在飼喂后4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、60、72、84、96、108 和120 h直腸取糞，糞樣65℃下烘干，粉碎過1 mm篩，用比色法測其中鉻的含量，瘤胃外流速率的計算公式與方法參考文獻［19］，測定結(jié)果用于計算養(yǎng)分瘤胃有效降解率。

1.3.4 養(yǎng)分瘤胃降解率的測定

分別以玉米秸稈和精料補充料為待測飼料，用瘤胃尼龍袋法［19］分別測定玉米秸稈有機物質(zhì)(OM)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和精料補充料干物質(zhì)(DM)、OM、粗蛋白質(zhì)(CP)的瘤胃降解率。準確稱取3.0～4.0 g樣品，裝入尼龍袋，扎緊袋口，于晨飼后2 h投入瘤胃腹囊50 cm處，每頭牛放10個精料補充料袋、12個玉米秸稈袋，分別于 4、8、12、24、48 和 72 h(精料補充料只做到48 h)取出2個袋，立即用水沖洗至完全澄清，在電熱恒溫干燥箱中65℃烘至恒重，分別測定 DM、OM、NDF、ADF和 CP 含量［22］。待測飼料養(yǎng)分的降解常數(shù)的確定和有效降解率的計算公式與方法參考文獻［19］。

1.3.5 瘤胃液VFA含量的測定

取瘤胃液5 mL，加入1 mL 25%偏磷酸溶液，混合均勻，冰水浴中放置30 min后于10 000 r/min離心10 min，然后取上清液，用GC102AF型氣相色譜儀測定VFA含量，色譜柱為φ4(外)×2 m玻璃柱，固定相PEG－20M，涂布濃度為3%，載體為Chromsorb WAW DMCS;色譜柱溫160℃，汽化室溫度 200℃;空氣壓力 0.12 MPa，氫氣壓力0.06 MPa，氮氣(載氣)壓力 0.08 MPa;氮氣流速30 mL/min，氫 氣 流 速 60 mL/min，空 氣 流 速360 mL/min;靈敏度10－10，衰減16;進樣量1 μL。

1.3.6 尿樣采集與尿嘌呤衍生物含量的測定

正試期每天收集并記錄排尿量，均按總量的1%采集到裝有10%硫酸的磨口玻璃瓶中，使pH小于3，把5d的尿樣混合，用4層紗布過濾后在－40℃保存以備分析。用比色法測定尿中尿囊素和尿酸含量，尿囊素和尿酸之和即為尿嘌呤衍生物含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 10.0統(tǒng)計分析軟件的one-way ANOVA進行方差分析和LSD多重比較。試驗結(jié)果以平均值±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 飼糧中添加硒和維生素E對瘤胃pH以及氨態(tài)氮、VFA含量的影響

從表3 看出，瘤胃 pH 4、8、12 組與 1、5、9、13組差異顯著(P＜0.05)，其他組間差異不顯著(P＞0.05)。氨態(tài)氮含量1～4組顯著高于5～8組(P＜0.05)，5～8組顯著高于9～11組(P＜0.05)，1～4組之間、5～8組之間以及9～16組之間差異不顯著(P＞0.05)。乙酸、丙酸和丁酸含量8、12 組顯著高于 1 組(P ＜0.05)，8、12、14 組之間以及剩余組之間差異不顯著(P＞0.05)。總VFA含量8、12和14組顯著高于5、9和13組(P＜0.05)，其余組間差異不顯著(P ＞0.05)。乙酸/丙酸各組間差異不顯著(P＞0.05)。

2.2 飼糧中添加硒和維生素 E對養(yǎng)分瘤胃降解率的影響

從表4看出，玉米秸稈OM的瘤胃降解率4、8、12和14組極顯著高于1、2和3組(P ＜0.01)，顯著高于5、6、9 和 13 組(P ＜0.05)，與 7、10、11、15和 16 組間差異不顯著(P ＞0.05)，7、10、11、15、16組與1、2和3組之間差異顯著(P ＜0.05)，其他組間差異不顯著(P＞0.05)。玉米秸稈NDF的瘤胃降解率4、8、12和16組極顯著高于 1、3、5、9 和13 組(P ＜0.01)，2、6、7、10、11、14 和15 組與1、3、5、9 和 13 組差異顯著(P ＜0.05)，其余各組差異不顯著(P＞0.05)。玉米秸稈ADF的瘤胃降解率8 和 12 組極顯著高于 1、3、5、9、11、13、14 和15 組(P ＜0.01)，與 2、4、6、7、10 和 16 組差異不顯著(P ＞0.05)，2、4、6、7、10 和16 組顯著高于1、3、5、9、11、13、14 和15 組(P ＜0.05)，其余各組間差異不顯著(P ＞0.05)。

表3 飼糧中添加硒和維生素E對瘤胃pH以及氨態(tài)氮、VFA含量的影響Table 3 Effects of selenium and vitamin E supplementation on pH and contents of ammonia nitrogen and VFA in rumen

精料補充料OM的瘤胃降解率14組顯著高于1組(P＜0.05)，14組和1組與其余組間差異不顯著(P＞0.05)。精料補充料DM的瘤胃降解率所有試驗組組間差異不顯著(P＞0.05)。精料補充料CP的瘤胃降解率4組顯著高于10組(P＜0.05)，而與其余組間差異不顯著(P ＞0.05)。

表4 飼糧中添加硒和維生素E對養(yǎng)分瘤胃降解率的影響Table 4 Effects of selenium and vitamin E supplementation on nutrientdegradability in rumen %

2.3 飼糧中添加硒和維生素E對尿嘌呤衍生物含量的影響

從表5看出，尿囊素和尿酸含量8、12、14組顯著高于1組(P＜0.05)，其余組之間差異不顯著(P＞0.05)。尿嘌呤衍生物含量8組極顯著高于1組(P＜0.01)，12和14組顯著高于1組(P＜0.05)，其余組之間差異不顯著(P ＞0.05)。

3 討論

瘤胃pH是瘤胃發(fā)酵過程的綜合反映，其變動范圍一般為5.5～7.5，瘤胃最適宜 pH應(yīng)為6.6～7.0［23］。pH 直接影響瘤胃微生物生長、繁殖及菌體蛋白的生產(chǎn)效率。纖維分解菌對pH非常敏感，當pH低于6.2時，纖維分解菌的活動就會受到抑制［24］。本研究中各組pH均在6.50以上，屬于正常范圍，說明添加硒和維生素E對瘤胃pH無不良影響。

在基礎(chǔ)飼糧相同情況下，瘤胃微生物對氨態(tài)氮的利用速度和瘤胃壁對氨態(tài)氮的吸收速度是影響氨態(tài)氮含量的因素，能反映飼糧蛋白質(zhì)在瘤胃降解和微生物蛋白質(zhì)的合成之間的一種平衡狀況。添加硒和維生素E組(除2、3、4組外)的氨態(tài)氮含量都比1組有不同程度地降低，說明添加硒和維生素E增強瘤胃微生物的活力，促進微生物蛋白質(zhì)的合成，這一點還能從尿嘌呤衍生物含量得到證明。

淀粉和NDF是瘤胃內(nèi)產(chǎn)生VFA的主要底物［20］，并影響瘤胃的 pH。本研究的 8、12組的乙酸、丙酸、丁酸含量顯著高于1組，總VFA含量8、12和14組極顯著高于1組，其中的8和12組的硒源和添加水平及結(jié)果與劉強等［13－15］的研究報道一致，其原因可能是大部分瘤胃細菌(除真菌外)屬于原核細胞，無線粒體，其呼吸作用的電子傳遞鏈和三磷酸腺苷(ATP)合成酶均位于細胞膜上［25］，具有多功能細胞膜，因此，瘤胃細菌細胞膜在能量代謝、參與DNA復(fù)制與子細菌的分離等方面具有重要作用;而瘤胃是中性偏酸的內(nèi)環(huán)境，可能對瘤胃細菌細胞膜不太有利，維生素E可以保護細胞質(zhì)膜免受自由基的攻擊，硒則阻斷自由基的致病作用，使細胞膜功能得以正常的發(fā)揮;同時維生素E可以通過嘧啶堿基參與DNA的生物合成過程［18－19］，可能促進瘤胃細菌的分裂，兩者不僅促進瘤胃細菌的生長、繁殖，而且促進瘤胃細菌分泌纖維素分解酶等其他酶類，另外，兩者可能還通過抗氧化性能保護了瘤胃細菌分泌的酶的活性，提高了對產(chǎn)生乙酸、丙酸、丁酸和總VFA底物的降解。在此也同樣可以解釋添加硒和維生素E提高了玉米秸稈ADF和NDF的瘤胃降解率的結(jié)果。

表5 飼糧中添加硒和維生素E對尿嘌呤衍生物含量的影響Table 5 Effects of selenium and vitamin E supplementation on urinary purinederivative contents mmol/d

尿嘌呤衍生物含量與動物從腸道中所吸收的嘌呤量呈正相關(guān)。由于瘤胃微生物混合群體中核酸嘌呤與蛋白質(zhì)的含量有一定的定量關(guān)系，所以，根據(jù)尿嘌呤衍生物含量就可以計算出微生物蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。瘤胃細菌在降解碳水化合物產(chǎn)生VFA的同時也產(chǎn)生ATP，ATP除用于微生物維持和生長外，特別用于微生物蛋白質(zhì)的合成［20］，因此總VFA含量較高的組，其ATP產(chǎn)量也高，因此，尿嘌呤衍生物含量也應(yīng)當相應(yīng)提高，本研究也得出了該結(jié)果。

硒和維生素E在防治自由基對機體侵害方面雖然具有互補作用，但不能互相代替，所以1～5、9和13組在各方面都不太理想。16組(硒0.3 mg/kg、維生素E 90 IU/kg)并不是最佳組合，可能是由于維生素E和硒的互作，使其效果相互抵消所引起。

4 結(jié)論

① 硒0.3 mg/kg、維生素 E 30 IU/kg組和硒0.3 mg/kg、維生素E 60 IU/kg組瘤胃pH顯著低于硒0 mg/kg、維生素E 0 IU/kg組，其瘤胃氨態(tài)氮含量分別顯著和極顯著低于硒0 mg/kg、維生素E 0 IU/kg組，而它們的乙酸、丙酸、丁酸及總VFA含量分別顯著和極顯著高于硒0 mg/kg、維生素E 0 IU/kg組。

② 硒0.3 mg/kg、維生素 E 30 IU/kg組和硒0.3 mg/kg、維生素E 60 IU/kg組玉米秸稈OM、NDF和ADF的瘤胃降解率極顯著高于硒0 mg/kg、維生素E 0 IU/kg組。

③ 硒0.3 mg/kg、維生素 E 30 IU/kg組的尿囊素和尿酸含量顯著高于硒0 mg/kg、維生素E 0 IU/kg組，其尿嘌呤衍生物含量極顯著高于硒0 mg/kg、維生素E 0 IU/kg組。

④飼糧中硒和維生素E的適宜添加水平分別為 0.3 mg/kg、30 IU/kg。

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