具抗病毒活性的重組牛IFN-αA的冷激誘導表達與鑒定

孫旭燕，崔子寅，高明春，王君偉

（東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，黑龍江哈爾濱 150030）

干擾素α（IFN-α）屬于Ⅰ型干擾素，是一組能夠誘導一系列細胞內(nèi)蛋白表達繼而發(fā)揮抗病毒、抗細胞增殖和調(diào)節(jié)免疫應答的細胞因子。自80年代初，人IFN-α基因被克隆報道后，鼠、狗、豬、牛和羊等哺乳動物的IFN-α基因也相繼被克隆報道，牛α干擾素（BoIFN-α）的研究始于上世紀 80年代中期，研究表明BoIFN-α可以抵抗多種病毒的增殖與復制，因此日益為人們所重視。

E.coli表達系統(tǒng)是應用最廣泛的表達系統(tǒng)之一。然而，BoIFN-α在E.coli表達系統(tǒng)中多以無生物學活性的包涵體形式存在。因此，利用E.coli表達系統(tǒng)表達出具有生物學活性的BoIFN-α更具生產(chǎn)與應用價值。本研究將BoIFN-αA亞型基因（BoIFN-αA）融合在易于表達的融合標簽NusA末端[1]；同時利用內(nèi)含肽元件（Ssp DnaB Mini-intein，SDI）介導的自我剪切反應自動去除融合標簽，純化重組蛋白[2]；應用冷激啟動子表達系統(tǒng)降低蛋白質(zhì)的合成速率，促進二硫鍵的正確裝配，提高重組蛋白的可溶性表達[3]，構(gòu)建內(nèi)含肽-冷激表達重組質(zhì)粒pColdⅢ-NusASDI-BoIFN-α，實現(xiàn)了 rBoIFN-αA的高效可溶性表達，為rBoIFN-α在我國實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)及臨床應用提供有意義的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病毒株、細胞、菌株及質(zhì)粒 牛病毒性腹瀉病毒（BVDV 1型NADL株）效價為TCID50=10-4.4/0.1m L、牛腎細胞（MDBK）細胞株、重組質(zhì)粒pWL-BoIFN-α（IFN-α基因已經(jīng)密碼子優(yōu)化，并由上海生工生物工程技術服務有限公司合成）[4]、E.coli感受態(tài)細胞TG1、DH5α、Rosetta以及 pET載體、pTW INⅠ、pColdⅢ均由東北農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院微生物教研室保存。

1.2 主要試劑BsaⅠ、T4連接酶購自NEB公司；其他酶類購自TaKaRa公司；Bradford法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；DL 2000 PlusⅡDNA marker購自北京全式金生物技術有限公司；High Affinity Ni-Charged Resin購自GenScript公司；蛋白標準分子量Marker購自Fermentas公司；兔源抗BoIFN-α多抗血清由本實驗室制備并保存；HRP標記山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 引物設計及合成 根據(jù)BoIFN-α的cDNA序列及pTW INⅠ載體上的SDI基因序列設計引物，為避免外源氨基酸干擾重組蛋白的表達和活性，在BoIFN-α基因的上游和SDI基因的下游引入BsaⅠ限制性內(nèi)切酶識別位點，從而使擴增的兩段PCR產(chǎn)物能夠融合為一個ORF。引物序列為：Sen-SDI：5'-C AGTGGTACCGCTATCTCTGGCGATAGTC-3'（KpnⅠ）；Antisen-SDI：5'-GGTCTCGTTGTGTACAATGATGTC A-3'（BsaⅠ）；Sen-Bo：5'-AGCATAGGTCTCAACAAC TGCCATCTGCCGCATACCCATA-3'（BsaⅠ ）； Antisen-Bo：5'-AGCTCTCGAGTTAATCTTTGCGACGA-3'（XhoⅠ），引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.4 SDI和Bo IFN-α 基因的擴增及串聯(lián) 以pTW INⅠ質(zhì)粒為模板，用Sen-SDI和Antisen-SDI引物進行PCR擴增。擴增條件為：94℃5min；94℃30 s、53.8℃ 30 s、72℃ 1 Min，25個循環(huán)；72℃5 Min。用KpnⅠ和EcoRⅤ雙酶切PCR回收產(chǎn)物，克隆于經(jīng)同樣酶切的pET-30a（+）載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為pET-30-SDI。

以pWL-BoIFN-α為模板，用Sen-Bo和Antisen-Bo引物進行PCR擴增。擴增條件：94℃ 5 min；94℃ 30 s、55.7℃ 30 s、72℃ 1 min，25個循環(huán)；72℃ 5 Min。用BsaⅠ和XhoⅠ雙酶切PCR回收產(chǎn)物和上步所得的pET-30-SDI，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30-SDI-BoIFN-α，由上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.5 SDI-Bo IFN-α與融合標簽NusA的串聯(lián) 以pET-30-SDI-BoIFN-α為模板，Bam-SDI（5'-CTAGG GATCCGCTATCTCTGGCGATA-3'，下劃線處為BamHⅠ位點）為上游引物，Antisen-Bo為下游引物， PCR擴增SDI-BoIFN-α串聯(lián)序列。擴增條件為：94℃5m in；94℃30 s、58.1℃30 s、72℃1m in，30個循環(huán)；72℃ 5 min。用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切PCR回收產(chǎn)物與pET-43.1a（+）載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pET-43.1-SDI-BoIFN-α。

1.6 內(nèi)含肽-冷激表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定用NdeⅠ和XhoⅠ雙酶切 pET-43.1-SDI-BoIFN-α和pColdⅢ載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pColdⅢ-NusA-SDIBoIFN-α，由上海生工生物工程技術服務有限公司進行測序。

1.7 重組蛋白的誘導表達及表達形式分析 將pColdⅢ-NusA-SDI-BoIFN-α轉(zhuǎn)化入Rosetta中，將重組菌接種在LB培養(yǎng)液中（含Amp 100μg/mL），37℃培養(yǎng)至OD600nm達0.6～0.8時加入IPTG至終濃度為1mmol/L，16℃誘導24 h。分別取誘導菌離心后的沉淀和上清進行SDS-PAGE檢測表達產(chǎn)物。

1.8 重組蛋白的的western blot鑒定 將菌體超聲后上清按常規(guī)方法進行SDS-PAGE、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗為兔源抗BoIFN-α多抗血清，二抗為HRP標記羊抗兔IgG，對重組蛋白進行western blot分析，將鑒定正確的重組蛋白命名為NS-BoIFN-α。

1.9 NS-Bo IFN-α的純化及定量 誘導后菌體，根據(jù)High Affinity Ni-Charged Resin蛋白純化說明在非變性條件下純化可溶性蛋白；進行SDS-PAGE，檢測NS-BoIFN-α純化結(jié)果。經(jīng)Bradford法定量純化的NS-BoIFN-α的蛋白濃度。

1.10 NS-Bo IFN-α抗病毒活性測定 將4倍倍比稀釋的NS-BoIFN-α100μL，分別加入96孔板培養(yǎng)MDBK單層中，37℃孵育24 h后分別加入100TCID50的BVDV 100μL，同時設空白細胞對照組、病毒對照組，待病毒對照組完全病變時觀察NS-BoIFN-α處理的細胞病變（CPE）情況。以抑制50%CPE的最高干擾素稀釋度為1U[5]計算其抗病毒活性。

2 結(jié) 果

2.1 SDI和Bo IFN-α 基因的擴增及串聯(lián) 以pTW INⅠ質(zhì)粒為模板，PCR擴增出約500 bp的基因片段（圖1A），大小與SDI基因相符。擴增產(chǎn)物酶切后連接到 pET-30a（+）載體。以 pWL-BoIFN-α為模板，PCR擴增出約500 bp的特異條帶（圖1B），與預期的目的片段大小相符。擴增產(chǎn)物酶切后連接pET-30-SDI。pET-30-SDI-BoIFN-α經(jīng)酶切和測序鑒定正確（圖 1C）。

2.2 內(nèi)含肽-冷激表達重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定以pET-30-SDI-BoIFN-α為模板，經(jīng)PCR擴增出約1 000 bp的SDI-BoIFN-α基因片段（圖2A），與預期SDI-BoIFN-α串聯(lián)基因大小相符。擴增產(chǎn)物酶切后連接pET-43.1a（+）載體，重組質(zhì)粒 pET-43.1-SDIBoIFN-α經(jīng)酶切鑒定（圖2B），所得目的片段與SDIBoIFN-α串聯(lián)基因大小相符。pET-43.1-SDI-BoIFN-α通過NdeⅠ和XhoⅠ酶切后，獲得連接有Nus和6His等標簽的基因片段NusA-SDI-BoIFN-α，將其連入pColdⅢ載體，經(jīng)酶切鑒定（圖2C）和測序分析，證明載體構(gòu)建正確。

圖2 重組質(zhì)粒pColdⅢ-NusA-SDI-BoIFN-α的構(gòu)建及鑒定Fig.2 Construction and identification of recombinant plasmid pColdⅢ-NusA-SDI-BoIFN-α

2.3 重組蛋白的表達、鑒定及純化 SDS-PAGE檢測，對照菌Rosetta（pColdⅢ-NusA-SDI）表達出約70 ku大小的條帶，構(gòu)建的重組菌表達了約為90 ku的重組蛋白，與理論值相符，并且表達的重組蛋白主要以可溶形式存在（圖3A）。

Western blot結(jié)果顯示，菌體超聲后上清可以與BoIFN-α多抗血清在目的條帶處發(fā)生特異性反應，表明表達蛋白為BoIFN-α（圖3B）。

非變性條件下，用鎳柱親和層析純化NS-BoIFN-α，250 mmol/L的咪唑基本能夠?qū)⒛康牡鞍紫疵撓聛?，純化后的目的蛋白?jīng)SDS-PAGE檢測（圖 3C）。經(jīng) Bradford法定量純化的 NS-BoIFN-α 濃度為0.12mg/mL。

2.4 NS-Bo IFN-α的抗病毒效果分析 抗病毒活性試驗結(jié)果表明：細胞對照組生長良好（圖4A），NS-BoIFN-α處理組細胞能夠抵抗100TCID50的病毒攻擊（圖4B），而病毒對照組細胞全部死亡（圖4C）。經(jīng)過計算，純化后的NS-BoIFN-α抗BVDV活性為9.86×105U/mg（表 1）。表明純化獲得的 NS-BoIFN-α具有較好的抗病毒活性。

圖3 重組蛋白的表達及純化Fig.3 Analysis of recombination protein and purification of NS-BoIFN-α

圖4 NS-BoIFN-α對BVDV的抑制作用（200×）Fig.4 Inhibition of NS-BoIFN-αon BVDV cultivated in MDBK cells（200×）

表1 NS-BoIFN-α在MDBK細胞上的抗病毒活性檢測Table 1 Activity of NS-BoIFN-αin MDBK cells

3 討 論

目前，E.coli仍然是最簡便、廉價、應用最廣泛的表達系統(tǒng)之一，但rBoIFN-α在E.coli中極易產(chǎn)生包涵體，而后期的蛋白重新折疊工作繁瑣、重疊蛋白的生物學活性不確定，重疊和純化后蛋白的總產(chǎn)量降低。孫仰峰等采用計算機輔助軟件基因優(yōu)化BoIFN-α的方法優(yōu)化表達了具有抗病毒活性的BoIFN-α蛋白，但產(chǎn)物仍以包涵體的形式存在[4]。所以，本研究利用內(nèi)含肽-冷激誘導表達系統(tǒng)表達出了可溶性的rBoIFN-α具有重要的應用價值。

本研究中采用了一系列優(yōu)化措施使rBoIFN-α在E.coli中實現(xiàn)了高效可溶性表達：（1）選擇NusA融合標簽。Harrison通過將可溶性重組蛋白模型改良，證明了NusA蛋白是在E.coli中具有最高可溶性的3種蛋白之一[6]，NusA形成的重組蛋白不僅表達量比其他重組蛋白高，而且其助溶效果也最為顯著[7]。此外，NusA還可以間接指導分子內(nèi)二硫鍵的形成和重組蛋白的正確折疊[8]。（2）選用pColdⅢ低溫表達載體。pColdⅢDNA通過利用一種來自E.coli自身在低溫誘導時產(chǎn)生的cspA啟動子[9]，可以使E.coli在16℃低溫條件下表達重組蛋白。（3）N端融合SDI內(nèi)含肽。內(nèi)含肽可以促進重組蛋白的可溶性表達，提高目的蛋白的含量。本研究表達的蛋白中目的蛋白所占的比例為62.7%，而崔子寅等利用含有內(nèi)含肽和麥芽糖結(jié)合蛋白基因的重組質(zhì)粒pMAL-SDI-BoIFN-α表達的目的蛋白占菌體總蛋白的比重為54.1%[10]，這表明綜合應用以上3種可溶性表達優(yōu)化措施，可以明顯提高目的蛋白表達量。

SDI除了具有助溶的作用外，還具有誘導自我剪切的活性[11]，使融合標簽與目的蛋白分離。目前在本研究中已證明內(nèi)含肽具有助溶的作用，誘導內(nèi)含肽產(chǎn)生自我剪切的活性還在摸索當中，利用內(nèi)含肽的自我剪切機制表達無冗余氨基酸的人IFN-α已有先例[12]，所以通過進一步的條件優(yōu)化有望將rBoIFN-α的目的基因從內(nèi)含肽的C端切割下來，真正實現(xiàn)無冗余氨基酸BoIFN-α的可溶性表達。

Charleston等研究表明細胞病變型BVDV（cpBVDV）可以誘導Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，從而干擾cpBVDV的復制[13]，本研究利用MDBK-BVDV干擾素活性檢測系統(tǒng)證明BoIFN-α抵抗BVDV的活性為9.86×105U/mg，在細胞水平證明了BoIFN-α可以有效抵抗BVDV對MDBK的攻擊，同時也證明連接內(nèi)含肽和NusA融合標簽的表達系統(tǒng)能夠表達具有較高抗病毒活性的重組IFN-α，為今后大量生產(chǎn)具有抗病毒活性的rBoIFN-α奠定了基礎。

本研究利用pColdⅢ冷激誘導表達載體及NusA融合標簽利于可溶性表達的特點，結(jié)合內(nèi)含肽的助溶作用，獲得了高表達量、高活性的可溶性的rBoIFN-α，為開發(fā)并應用BoIFN-α資源，進而預防和控制牛病毒性疾病提供了物質(zhì)基礎。

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