我國(guó)東北地區(qū)野生鳥(niǎo)類A亞群禽白血病病毒分子流行病學(xué)調(diào)查及env基因序列分析

楊 波，高玉龍，高宏雷，秦立廷，劉婉思，李德龍，高 奇，曾祥偉，王笑梅*

（1.東北林業(yè)大學(xué)野生動(dòng)物資源學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/禽傳染病研究室，黑龍江哈爾濱 150001；3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東泰安 271000）

禽白血病是由禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的以造血細(xì)胞惡性增生為主的一類C型反轉(zhuǎn)錄病毒群（或腫瘤病毒群），包括淋巴細(xì)胞性白血病、成紅細(xì)胞性白血病、成髓細(xì)胞白血病和髓細(xì)胞樣白血病[1]。根據(jù)病毒的宿主范圍及交叉中和試驗(yàn)等將ALV分為A～J 10個(gè)亞群，其中A亞群ALV（ALV-A）是禽白血病的主要病原體，以引發(fā)淋巴細(xì)胞瘤為主[2-3]。國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者在不同時(shí)間段分別鑒定了雞群中ALV-A感染的存在，并且測(cè)定了雞群中ALV-A分離株基因組序列。然而，以往的流行病學(xué)調(diào)查主要針對(duì)家禽和水禽，關(guān)于野鳥(niǎo)感染ALV-A的研究甚少，為了對(duì)野生鳥(niǎo)類ALV的流行情況和病毒分子特征進(jìn)行研究，我們先后對(duì)在我國(guó)東北地區(qū)采集的野生鳥(niǎo)類樣品進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)野鳥(niǎo)中ALV-A陽(yáng)性樣品進(jìn)行env基因的序列分析。

1 材料和方法

1.1 病毒株與被檢樣品 被檢樣品采集自東北地區(qū)300只死亡野生鳥(niǎo)類，其中絕大部分來(lái)自各鳥(niǎo)類環(huán)志站保存的網(wǎng)捕過(guò)程中意外死亡的野鳥(niǎo)，一部分是林業(yè)主管部門處罰沒(méi)收的非法獵殺的鳥(niǎo)類，一部分來(lái)自各疫源疫病監(jiān)測(cè)站在巡查過(guò)程中發(fā)現(xiàn)已死亡的鳥(niǎo)類。野鳥(niǎo)的種類主要為雁形目中的野鴨和雀形目中的各種小型鳥(niǎo)類。在生物安全實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行野生鳥(niǎo)類剖檢，采集肝、脾等組織臟器。

1.2 主要試劑TaqDNA聚合酶、dNTP、ALV-p27抗原檢測(cè)試劑盒購(gòu)自IDEXX公司；T4 DNA連接酶、pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司；DNA提取試劑盒、Plasm id Miniprep Kit和 DNA Gel Extraction Kit購(gòu)自AxyGen公司；抗ALV群特異抗原p27的兔血清由哈爾濱獸醫(yī)研究所惠贈(zèng)；FITC標(biāo)記的羊抗兔 IgG（IgG-FITC）購(gòu)自Sigma公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)文獻(xiàn)由北京六合華大基因科技股份有限公司合成4對(duì)引物ALV-AF/ALV-AR[4]、 ALV-BF/ALV-BR[5]、 ALV-JF/ALV-JR[6]和ALVAENVF/ALVAENVR[7]。

1.4 病毒分離與檢測(cè)

1.4.1 病毒分離培養(yǎng)野生鳥(niǎo)類組織研磨液病料處理具體步驟參照文獻(xiàn)[6]。

1.4.2 ALV-p27 ELISA抗體檢測(cè)按照試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，以間接ELISA方法檢測(cè)采集的樣本的ALV-Ab抗體

1.4.3 間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）采用第3代病毒細(xì)胞培養(yǎng)物接種于DF1細(xì)胞中培養(yǎng)5 d，參照文獻(xiàn)[6]的方法以ALV群特異抗原p27的兔血清作為一抗，以羊抗兔IgG-FITC為二抗（1∶150），進(jìn)行IFA鑒定。

1.4.4 樣品PCR鑒定以第3代病毒細(xì)胞培養(yǎng)物提取的總DNA為模板，按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｒ訟LV-AF/ALV-AR、ALV-BF/ALV-BR、ALV-JF/ALV-JR 3對(duì)引物分別對(duì)樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，進(jìn)行ALV的亞群鑒定。

1.5env基因序列的擴(kuò)增、克隆和序列分析 對(duì)檢測(cè)ALV-A陽(yáng)性的樣品以ALVAENV F/ALVAENV R引物PCR擴(kuò)增env基因，條件為：95℃5m in；95℃30 s、56℃ 30 s、72℃ 3 Min，30個(gè)循環(huán)；72℃10m in。PCR產(chǎn)物克隆入pMD18-T載體中，由北京六合華大基因科技股份有限公司測(cè)序。用DNAStar、Clustal X和MEGA 4.0軟件進(jìn)行序列分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 病料樣品中ALV的分離和檢測(cè) 采用ALV-p27 ELISA對(duì)收集的300份野鳥(niǎo)肝或脾組織研磨液樣品檢測(cè)，其中有兩份樣品呈陽(yáng)性反應(yīng)。

2.2 IFA檢測(cè)結(jié)果 用ALV群特異抗原p27的兔血清做IFA結(jié)果顯示，上述ALV-p27 ELISA陽(yáng)性反應(yīng)的兩份樣品在IFA檢測(cè)中也均呈陽(yáng)性?？梢?jiàn)胞質(zhì)中有色熒光、胞核無(wú)熒光的典型感染細(xì)胞（圖1）。

圖1 陽(yáng)性樣品感染DF1細(xì)胞的IFA結(jié)果（100×）Fig.1 The result of IFA of DF1 cellw ith positive samples（100×）

2.3 樣品PCR檢測(cè)結(jié)果 用擴(kuò)增ALV-A、ALV-B和ALV-J 3對(duì)特異性引物進(jìn)行PCR鑒定。結(jié)果表明，用ALV-A引物擴(kuò)增的兩份樣品的片段與陽(yáng)性對(duì)照大小一致（圖2），ALV-B和ALV-J兩對(duì)引物擴(kuò)增沒(méi)有特異性片段，進(jìn)一步證明分離的病毒為ALV-A。分別命名為WB11031株和WB11149株。

圖2 樣品PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 PCR result of the samples

2.4 序列分析 經(jīng)DNAStar軟件分析，分離株WB11031和WB11149的gp85基因開(kāi)放閱讀框大小均為1 020 bp，編碼340個(gè)氨基酸殘基。與雞的不同亞群ALV的參考株同源性比較表明，兩株分離株的氨基酸序列與ALV-A的氨基酸序列同源性最高，為 91.1%～100%。而與 B、C、D、E、J亞群ALV的gp85編碼序列的同源性僅為28.0%～80.3%。同時(shí)，gp85基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，兩株分離株均屬于ALV-A（圖3）。兩株分離株的gp85基因與其他代表株比較存在點(diǎn)突變，其中分離株WB11031為C194T和T927C；分離株WB11149為T764C和A1002T，但均為沉默突變。兩株分離株與美國(guó)MQNCSU株氨基酸序列相近。gp37基因較為保守，各病毒株氨基酸同源性為91.1%～92.1%，無(wú)缺失或插入突變。

現(xiàn)已知全世界有8條主要候鳥(niǎo)遷徙路線，中國(guó)濕地水鳥(niǎo)的遷徙路線主要分為東部、中部和西部3條路線[8]。經(jīng)證明：分離株WB11031為來(lái)自赤頸鴨（Eurasian W igeon），分離株WB11149為來(lái)自綠翅鴨（Green-w inged Teal），赤頸鴨和綠翅鴨均屬于雁形目（Anseri-formes）。據(jù)報(bào)道ALV主要通過(guò)垂直傳播感染雛雞，表現(xiàn)為持久的病毒血癥，造成免疫抑制[9]，所以該病毒可能對(duì)野生鳥(niǎo)類也存在類似危害。另外，候鳥(niǎo)種類和數(shù)量繁多，遷徙覆蓋面積廣泛，更有可能加劇家禽感染和傳播禽白血病的危險(xiǎn)性。

本文首次對(duì)野生鳥(niǎo)類感染ALV-A的情況進(jìn)行檢測(cè)和調(diào)查，結(jié)果顯示我國(guó)東北地區(qū)野生鳥(niǎo)類存在ALV感染。雖然野生鳥(niǎo)類ALV檢出率比較低（0.06%），但野鳥(niǎo)ALV的檢測(cè)分析是一項(xiàng)重要的基礎(chǔ)工作，積極開(kāi)展這一研究，有助于對(duì)ALV的生態(tài)分布、傳播擴(kuò)散規(guī)律以及遺傳進(jìn)化等問(wèn)題的深入研究。另外野生鳥(niǎo)類在越冬遷徙時(shí)是否作為該病毒的攜帶傳播媒介，傳染給遷徙途徑地及最終目的地的家禽，或與家禽之間進(jìn)行相互傳播還有待進(jìn)一步研究。

圖3 WB11031和WB11149與雞的不同亞群ALV參考株間gp85遺傳進(jìn)化樹(shù)關(guān)系Fig.3 Phylogenetic tree based on gp85 gene for ofWB11031,WB11149 and chicken ALV reference strains of different subgroups

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