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    蜂膠黃酮對環(huán)磷酰胺誘導HL7702細胞損傷的保護作用

    2013-08-28 10:42:04
    實用藥物與臨床 2013年4期
    關鍵詞:蜂膠誘導小鼠

    張 良

    蜂膠是經(jīng)驗豐富的工蜂采集生命力極強的白楊、白樺、榕樹等嫩芽和花蕾及樹脂類物質(zhì),歸巢后幾番吐哺,與其舌腺分泌物混合而制成的膠粘物質(zhì)。蜂膠乙醇提取物(EPF)中含有豐富的黃酮類化合物、脂肪酸及酯類、氨基酸、維生素和多種活性酶類。研究發(fā)現(xiàn),蜂膠黃酮(EPF)對環(huán)磷酰胺(CTX)致肝正常細胞HL-7702損傷具有保護作用,為證實此觀點,筆者進行了動物實驗,旨在進一步研究并證實EPF對化療藥物損傷的保護作用,為進一步將其開發(fā)為新型高效的天然抗腫瘤藥物和細胞保護劑奠定基礎。

    1 材料和方法

    1.1 材料 EPF:由日本醫(yī)科大學生命科學中心采用乙醇提取,紫外光譜鑒定并定量檢測。人正常肝細胞(HL-7702)由日本醫(yī)科大學生命科學研究中心提供。WST-1凋亡檢測試劑盒、Annexin VFITC/PI凋亡檢測試劑盒購自Qiagen公司;氧化氫酶(CAT)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)等活性及尿素氮(BUN)試劑盒、EB/溴化乙錠、吖啶橙購自羅氏公司。BALB/C野生型小鼠,6周齡(購自日本琦玉縣KUREA株式會社)。

    1.2 方法

    1.2.1 細胞培養(yǎng) 在含10%滅活新生牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液中,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),2~3 d傳代一次。細胞生長曲線實驗:將對數(shù)生長期的HL7702細胞用0.25%胰酶消化,含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液吹打成單細胞懸液,調(diào)整細胞密度為1×104/mL,每孔100 μL,分別加入到4塊96孔培養(yǎng)板中,置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。24 h細胞貼壁后,向各孔中分別加入 CTX 4 ng/L、EPF(20、30、40 ng/L,每個濃度設5個復孔)。分別培養(yǎng)24 h,PBS沖洗3次后,各孔加入100 μL無血清培養(yǎng)基和10 μL WST-1,繼續(xù)在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。酶標儀測定各孔OD值(光密度),空白孔調(diào)零,選擇450 nm為測定波長、630 nm為參考波長,以藥物濃度為橫坐標、OD為縱坐標繪制細胞生長曲線。實驗重復3次,確定結(jié)果穩(wěn)定性。

    1.2.2 蜂膠黃酮提取 稱取蜂膠1.0 g,乙醇加至100 mL,漩渦混合,超聲波發(fā)射器超聲20 min,500 r/min離心2 min,重復超聲處理20 min,反復上述步驟2次,70%乙醇溶解并紫外光譜分析儀鑒定,陽性對照為蘆丁。

    1.2.3 吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)雙染色實驗24孔板按5×104個細胞/孔密度接種細胞懸液,培養(yǎng)24 h后向各孔中分別加CTX(4 ng/L)、EPF(20、40、60 ng/L),繼續(xù)培養(yǎng) 24 h,棄去培養(yǎng)基,PBS清洗2遍,每孔分別加200 μL AO染液(100 mg/L)及 200 μL EB 染液(100 mg/L),室溫放置5 min,在熒光顯微鏡下觀察。

    1.2.4 Annexin-V-FITC/PI流式細胞儀檢測細胞凋亡 細胞處理方法同上,PBS清洗細胞2次,0.25%胰酶消化細胞,500 r/min離心5 min收集細胞。收集1×106單細胞懸液,加入Binding buffer 100 μL和 Annexin-V-FITC(20 μg/mL)10 μL,室溫避光30 min。加入 PI(50 μg/mL)5 μL,用 Binding buffer加至400 μL,用FACS進行流式細胞術定量檢測。

    1.2.5 動物模型 健康鼠隨機均分為5組,雌雄各半。對照組灌胃生理鹽水;模型組單獨給予CTX;3個劑量試驗組每天分別灌服樣品100、200、400 mg/mL,0.5 mL/只,連續(xù)給藥 10 d,同時注射CTX 0.15 g/kg,共3 d。小鼠眼眶取血檢測外周血象,肝素抗凝,根據(jù)試劑盒操作過程分析檢測血清檢測中各項酶的指標。

    1.2.6 統(tǒng)計分析 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量數(shù)據(jù)以xˉ±s表示,兩組均數(shù)間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 EPF對CTX誘導的HL7702生長抑制影響對人肝細胞系HL7702生長增殖的影響,如圖1所示,在單獨存在CTX(4 ng/L)時,HL-7702均處于生長抑制狀態(tài);加入EPF時,實驗組細胞生長抑制明顯改善,并隨著EPF多肽濃度的增加,當EPF濃度達到40 ng/L時,促進生長作用顯著增加,各組與陰性對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果顯示,EPF對CTX誘導的HL7702生長抑制具有拮抗作用。

    圖1 EPF對CTX處理HL-7702的保護作用

    2.2 EPF對CTX誘導的HL7702細胞凋亡形態(tài)影響 見圖2。結(jié)果顯示,單獨應用CTX(4 ng/L)組,絕大部分細胞核被染成橙紅色,核皺縮或碎裂,為晚期凋亡或死亡細胞。EPF與CTX聯(lián)合應用,EPF肽強烈抑制CTX對HL7702的損傷作用。凋亡細胞明顯減少,絕大多數(shù)細胞形態(tài)飽滿,幾乎沒有死亡細胞。AO/EB染色實驗結(jié)果表明,從形態(tài)角度觀察,EPF對CTX誘導的HL7702細胞凋亡形態(tài)影響具有抑制作用。

    圖2 EPF對CTX處理的HL7702AO/EB雙染結(jié)果

    2.3 EPF對CTX誘導的HL7702細胞凋亡影響Annexin-V-FITC/PI染色,流式細胞術分析細胞凋亡實驗結(jié)果見圖3。CTX單獨處理的HL7702細胞組24 h晚期凋亡細胞占30.2%,CTX與EPF共處理細胞組凋亡細胞分別占19.2%、13.1%和7.1%,隨著EPF濃度增加,凋亡細胞逐漸減少,活細胞和早期凋亡細胞明顯增多。CTX單獨處理的HL7702細胞組24 h早期凋亡細胞占57.2%,CTX與EPF共處理細胞組凋亡細胞分別占29.7%、17.1%和9.5%,隨著EPF濃度增加,早期凋亡細胞逐漸減少,活細胞明顯增多。

    2.4 EPF對小鼠血清酶活性和尿素氮含量的影響 如圖4所示,模型組小鼠血清CAT、LDH、CK、GOT和GPT等酶活性以及血清BUN含量與對照組差異有統(tǒng)計學意義,然而此類CTX介導的毒性反應均在一定程度上被EPF緩解。

    圖3 EPF對CTX處理的HL7702細胞凋亡率影響

    圖4 EPF對小鼠血清酶活性和尿素氮含量的影響

    3 討論

    惡性腫瘤的治療手段有多種,化療仍是目前極為重要的基本手段之一[1-2],且存在靶向性差異。多數(shù)抗腫瘤藥物均可在殺死腫瘤細胞的同時,無選擇地破壞正常組織,造成廣泛與嚴重的急/慢性蓄積毒性,導致化療藥物的劑量限制而引起治療指數(shù)狹小的不良反應,限制了癌癥治療的最佳用藥[3]。同時,化療藥物作用可引起機體衰弱、消化障礙、骨髓抑制等不良反應也是終止腫瘤治療的主要原因,因此,在抗腫瘤治療時,能最大程度地殺傷腫瘤細胞且對正常組織破壞最小已經(jīng)成為化療藥物臨床應用的目標。其相關研究也是當今抗腫瘤藥物研究與開發(fā)領域的一大熱點[4]。

    蜂膠是蜜蜂從植物的幼芽和枝條上采集的樹脂類物質(zhì),蜂膠提取物無明顯肝腎功能損害。其在不同地區(qū)化學成分各異,生理活性亦不同。筆者采用乙醇純化方法提取的蜂膠主要成分為黃酮類。黃酮化合物有抗菌、抑制腫瘤細胞生長、降壓、預防紫外線損傷等作用。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)EPF具有較好的化療保護功能,并通過細胞實驗和動物實驗結(jié)果證實。為探求EPF對于CTX損傷HL7702細胞的保護作用,本研究采用WST-1細胞增殖試驗。WST-1是一種類似于MTT的化合物,是MTT的升級替代產(chǎn)品,WST-1和MTT、XTT等相比,線性范圍更寬,靈敏度更高。故實驗結(jié)果更加精確可信。

    在本研究中,在HL7702細胞培養(yǎng)液中分別加入CTX和不同濃度的EPF(20~40 ng/L),培養(yǎng)24 h,細胞的增殖抑制在EPF濃度達到20 ng/L后得到改善,EPF濃度到40 ng/L后具有明顯的保護作用,同樣 AO/EB雙染實驗和 Annexin-V-FITC/PI流式細胞實驗也支持這一實驗結(jié)果。

    動物實驗結(jié)果進一步確定EPF對CTX化療損傷的保護作用,這可能與EPF具有抗氧作用有關。EPF可以清除體內(nèi)過多的自由基,減少自由基對機體正常細胞的損傷,維持體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的平衡,有效抑制CTX造成的機體自由基損傷[5-6],表現(xiàn)為血清CAT下降,同時對CTX導致的肝損傷具有明顯的保護作用,表現(xiàn)為GOT與GPT下降。本研究顯示,CPF具有對CTX引起的化療損傷較明顯的保護作用,為進一步研究和應用提供理論依據(jù)。

    :

    [1]Carini F,Saggese V,Porcaro G,et al.Surgical protocol in patients at risk for bisphosphonate osteonecrosis of the jaws:clinical use of serum telopetide CTX in preventive monitoring of surgical risk[J].Ann Stomatol(Roma),2012,3(1):31-36.

    [2]Min Wu,Mark R,Kelley W,et al.Reduction of BCNU toxicity to lung cells by high-level expression of O6-methylguanine-DNA methyltransferase[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol,2001,280(4):755-761.

    [3]Ragg S,Xu-Welliver M,Bailey J,et al.Direct reversal of DNA damage by mutant methyltransferase protein protects mice against dose-intensified chemotherapy and leads to in vivo selection of hematopoietic stem cells[J].Cancer Res,2000,60(18):5187-5195.

    [4]馬培奇.細胞保護劑氨磷汀及其臨床應用及展望[J].中國腫瘤,2001,10(8):471.

    [5]Arap W,Pasqulini R,Ruoslahti E.Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model[J].Science,1998,279(5349):377-380.

    [6]Stollman TH,Ruers TJ,Oyen WJ,et al.New targeted probes for radioimaging of angiogenesis[J].Methods,2009,48(2):188-192.

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