蒼耳子炒制對(duì)羧基蒼術(shù)苷和蒼術(shù)苷的影響

朵 睿， 陳 燕， 劉玉紅， 黃志芳， 劉云華， 易進(jìn)海*

(1.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川成都 610041;2.瀘州醫(yī)學(xué)院，四川瀘州 6460001)

蒼耳子 (Xanthii Fructucs)為菊科植物蒼耳Xanthium sibiricumPart et Widd的干燥成熟帶種皮的果實(shí)，具有散風(fēng)除濕、通鼻開(kāi)竅的功效［1］。蒼耳子有毒，《南方主要有毒植物》記載“蒼耳，有毒部位，全株;以果實(shí)為最毒;鮮葉比干葉毒，嫩葉比老葉毒”。蒼耳子使用不當(dāng)或長(zhǎng)期使用會(huì)出現(xiàn)腎臟、肝臟、心臟損傷或是腹痛、惡心、嘔吐等不良反應(yīng)［2］。蒼耳子所含化學(xué)成分復(fù)雜，現(xiàn)代研究表明蒼耳子中的主要毒性成分為水溶性苷類:羧基蒼術(shù)苷與蒼術(shù)苷，以及其衍生物［3-4］。這些水溶性苷類可抑制人的正常肝細(xì)胞株L-02和正常大鼠肝細(xì)胞BRL增殖，且隨著濃度升高，抑制作用增強(qiáng)，這與蒼耳子中毒表現(xiàn)一致，因此被公認(rèn)為是蒼耳子的主要毒性成分［3］。

蒼耳子必需通過(guò)炮制，減輕毒性，才能入藥［5］，如《本草綱目》有云 “入藥炒熟，去刺用”，宋· 《重修政和經(jīng)史證類備用本草》曰“炒”，隨后相繼出現(xiàn)了“微炒”、“炒令香”、“炒熟”、“培干”等記載?！吨袊?guó)藥典》規(guī)定蒼耳子應(yīng)炒至黃褐色，去刺后應(yīng)用［1］。

蒼耳子來(lái)源廣泛，價(jià)格低廉，市售蒼耳子藥材質(zhì)量參差不齊，因此有必要規(guī)范蒼耳子的炮制方法。本實(shí)驗(yàn)以主要毒性成分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究炒制對(duì)蒼耳子中羧基蒼術(shù)苷和蒼術(shù)苷的影響，揭示蒼耳子炒制的科學(xué)內(nèi)涵及其合理性，對(duì)蒼耳子加工炮制具有重要參考價(jià)值。

1 材料與儀器

1.1 樣品制備 3批蒼耳子購(gòu)于成都荷花池藥材市場(chǎng)，產(chǎn)地均為四川成都。經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院舒光明研究員鑒定為菊科植物蒼耳的干燥成熟果實(shí)。

凈制:取蒼耳子，除去雜質(zhì)，即得。炒黃:取凈蒼耳子100 g，文火炒至表面淺黃色時(shí) (約4 min)取出放涼。炒焦:取凈蒼耳子100 g，中火炒至表面黃褐至焦褐色，斷面焦黃色時(shí) (約8 min)取出放涼。炒炭:取凈蒼耳子100 g，武火炒至表面焦黑色時(shí) (約12 min)取出放涼。

1.2 材料 Agilent 1200型高效液相色譜儀 (包括四元泵，DAD檢測(cè)器，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器，工作站);HU10300/40B超聲波清洗儀;島津AUW220D型十萬(wàn)分之一天平;Sigma3K15高速冷凍離心機(jī);Millipore Milli-Q Integral 3超純水機(jī)。乙腈為美國(guó)Fisher色譜純;其余試劑均為分析純。羧基蒼術(shù)苷、蒼術(shù)苷對(duì)照品自制，純度大于98.0%，經(jīng)理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)分析，鑒定其結(jié)構(gòu)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-phenyl色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)柱;流動(dòng)相 A相為乙腈，B相為0.01 mol/L磷酸二氫鈉溶液 (pH=6)，梯度洗脫，0～8 min(12%A)，8～25 min(12%～25%A);體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm;柱溫35℃。對(duì)照品溶液及供試品溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品及蒼耳子樣品的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograns of reference substances and Xanthii Fructus sample

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取羧基蒼術(shù)苷9.72 mg、蒼術(shù)苷10.30 mg，置10 mL量瓶中，加超純水溶解并稀釋至刻度，搖勻。再精密量取上述對(duì)照品溶液各1 mL，置10 mL量瓶中，加超純水稀釋至刻度，搖勻，制成每1 mL中含羧基蒼術(shù)苷0.097 2 mg，蒼術(shù)苷0.103 0 mg的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取蒼耳子粉末(過(guò)三號(hào)篩)約1.0 g，置具塞錐形瓶中，加水20 mL，精密稱定質(zhì)量，超聲 (功率250 W，頻率40 kHz)處理40 min，取出，離心 (12 000 r/min，5 min)，取上清液作為供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取2.2項(xiàng)下羧基蒼術(shù)苷和蒼術(shù)苷對(duì)照品溶液各 0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、2.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加超純水溶解，并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取10 μL注入液相色譜儀中，以對(duì)照品質(zhì)量濃度 (μg/μL)為橫坐標(biāo)，峰面積 (A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果羧基蒼術(shù)苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=421.4X－0.346 0(r=0.999 9)，線性范圍為0.097 2～1.944 μg;蒼術(shù)苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=461.6X－3.984(r=0.999 9)，線性范圍為 0.103 0～2.060 μg。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液 (02炒黃)10 μL，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，按上述色譜條件測(cè)定，記錄峰面積。羧基蒼術(shù)苷的RSD為0.57%(n=5);蒼術(shù)苷的RSD為0.34%(n=5)。表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液 (02炒黃)，于室溫0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，羧基蒼術(shù)苷的RSD為0.52%(n=5);蒼術(shù)苷的RSD為0.83%(n=5)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性 取同一批蒼耳子粉末 (02炒黃)約1.0 g，共5份，精密稱定，按照2.3項(xiàng)制備供試品溶液，記錄峰面積并計(jì)算。羧基蒼術(shù)苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.17 mg/g(RSD=0.7%);蒼術(shù)苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.41 mg/g(RSD=0.6%)。

2.8 加樣回收率 取已知含有量的蒼耳子樣品(02炒黃)0.5 g，共6份，精密稱定，準(zhǔn)確加入適量的對(duì)照品，照2.1項(xiàng)下操作，測(cè)定，計(jì)算回收率。羧基蒼術(shù)苷的平均回收率為96.4%(RSD=0.5%);蒼術(shù)苷的平均回收率為97.8%(RSD=1.3%)(n=6)。

2.9 檢測(cè)限與定量限 將2.1項(xiàng)下的對(duì)照品溶液，用甲醇逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣測(cè)定，按3倍和10倍信噪比計(jì)算出羧基蒼術(shù)苷和蒼術(shù)苷的檢測(cè)限和定量限分別為1.2 ng、1.5 ng和4.1 ng、4.7 ng。

2.10 樣品測(cè)定 照2.3項(xiàng)下方法制備蒼耳子樣品的供試品溶液，分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀測(cè)定，在2.1項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算各樣品中羧基蒼術(shù)苷與蒼術(shù)苷，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 蒼耳子中羧基蒼術(shù)苷與蒼術(shù)苷的測(cè)定結(jié)果Tab.1 Results of contents determinaton of carboxyatractyloside and atractyloside in Xanthii Fructus

3 討論與結(jié)論

蒼耳子為有毒中藥，近年來(lái)由于食用、過(guò)量使用蒼耳子或使用炮制不當(dāng)?shù)纳n耳子導(dǎo)致中毒、甚至死亡的病例時(shí)有報(bào)道。蒼耳子中主要毒性成分為羧基蒼術(shù)苷和蒼術(shù)苷，其重要的毒性機(jī)制是對(duì)線粒體膜外氧化磷酸化的抑制作用［2］，其中羧基蒼術(shù)苷是蒼術(shù)苷的十倍［6-7］。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)3批生品蒼耳子 (01、02、03)進(jìn)行凈制、炒黃、炒焦、炒炭加工炮制，并檢測(cè)其毒性成分羧基蒼術(shù)苷與蒼術(shù)苷。結(jié)果顯示，生品蒼耳子中羧基蒼術(shù)苷含有量較高，不含蒼術(shù)苷;而炒黃后羧基蒼術(shù)苷的含有量降低約90%，轉(zhuǎn)化為蒼術(shù)苷。炒焦蒼耳子中基本不含羧基蒼術(shù)苷，蒼術(shù)苷有小幅下降;炒炭后蒼術(shù)苷顯著降低或檢不出。炒制使羧基蒼術(shù)苷轉(zhuǎn)化為蒼術(shù)苷，再進(jìn)一步降低蒼術(shù)苷的量，可顯著降低蒼耳子的毒性，故認(rèn)為蒼耳子應(yīng)炒制入藥。這與文獻(xiàn)［8］報(bào)道蒼耳子生用有毒，必須炮制后使用相一致。

本實(shí)驗(yàn)首次研究炒制對(duì)蒼耳子中羧基蒼術(shù)苷和蒼術(shù)苷含有量的影響，結(jié)果表明炒黃或炒焦可顯著降低毒性成分的量，故認(rèn)為蒼耳子入藥時(shí)，應(yīng)按藥典方法炒至黃褐色，方可起到減毒存效的作用。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:115.

［2］王 璟，莫傳麗，卻 翎.蒼耳子不良反應(yīng)的研究進(jìn)展［J］.中草藥，2011，42(3):613-616.

［3］汪 洋.蒼耳子的毒性物質(zhì)基礎(chǔ)及中毒機(jī)制研究［D］.上海:第二軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)院，2010.

［4］Obatomi D K，Bach P H.Biochemistry and toxicology of the diterpenoid glycoside atractyloside［J］.Food Chem Toxicol，1998，36(4):335-346.

［5］熊 穎，劉啟德，宓穗卿.蒼耳子化學(xué)研究進(jìn)展［J］.廣東藥學(xué)，2005，15(6):63-65.

［6］Luciani S，Martini N，Santi R.Effects of carboxyatractyloside a structual analogue of atractyloside on mitochondrial oxidative phosphorylation［J］.Life Science，1971，10(2):961-968.

［7］Kephalas T，Ailkaridis F，Pantelia K.Production of carboxyatractyloside and atractyloside by cell suspension cultures ofAtractylis gummifera［J］.Phytochemistry，1999，51(6):53-54.

［8］曹麗萍，臧志和，廖洪利，等.蒼耳子毒性成分及炮制工藝研究進(jìn)展［J］.研究進(jìn)展，2008，9(5):23.