治療乙肝相關(guān)性腎炎新藥大黃甘草膠囊提取工藝優(yōu)選

崔佳麗， 山麗梅， 趙艷玲， 張 萍， 王伽伯， 李寶才， 肖小河

(1.解放軍302醫(yī)院全軍中醫(yī)藥研究所，北京 100039;2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650224;3.解放軍302醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)學(xué)中心，北京 100039)

自1971年 Combes等［1］首次描述了第一例具有持續(xù)HBsAg血癥的患者發(fā)生了膜性腎病至今，腎小球腎炎已被公認(rèn)為是乙型肝炎病毒 (HBV)感染引起的最常見肝外病變，又稱HBV相關(guān)性腎炎。在我國，HBV相關(guān)性腎炎發(fā)病率很高，約為乙肝患者的16.6%～32%，此病發(fā)病機(jī)制尚不明確，臨床治療需要兼顧肝病和腎病，既需要抑制腎臟的免疫反應(yīng)，又不能因免疫抑制使乙型肝炎病毒復(fù)制增強(qiáng)，用藥矛盾突出，臨床上治療難度大，尚缺乏有效治療藥物。

解放軍302醫(yī)院是全國最大的三級甲等傳染病醫(yī)院。在長期臨床應(yīng)用中總結(jié)出應(yīng)用大黃甘草方治療HBV相關(guān)性腎炎的協(xié)定處方，臨床效果顯著。大黃甘草湯是臨床常用經(jīng)典方 (張仲景《金匱要略》)，由大黃、甘草兩味藥組成。其有效治療HBV相關(guān)性腎炎的機(jī)制可能與大黃蒽醌和甘草酸均具有明確的抗乙肝病毒和免疫調(diào)節(jié)［2-6］雙重作用相關(guān)。大黃甘草湯臨床應(yīng)用劑型主要為湯劑、散劑，而其臨床治療HBV相關(guān)性腎炎的劑型為湯劑、水煎服，不便于患者應(yīng)用，故在大黃甘草湯治療HBV相關(guān)性腎炎臨床療效肯定的基礎(chǔ)上，將其開發(fā)為首個治療HBV相關(guān)性腎炎的中藥制劑-大黃甘草膠囊，具有一定社會及經(jīng)濟(jì)意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合2010年版《中國藥典》［7］中有關(guān)大黃、甘草含量測定相關(guān)規(guī)定，將大黃酸等5種蒽醌、甘草酸作為優(yōu)選大黃甘草湯最優(yōu)提取方式的指標(biāo)成分，應(yīng)用正交試驗(yàn)法優(yōu)選大黃甘草膠囊的提取工藝，以浸膏得率、總蒽醌 (大黃酸等5種蒽醌單體之和)、甘草酸含量為指標(biāo)采用綜合評分法［8］來進(jìn)行工藝條件優(yōu)化。

1 儀器與試藥

Agilent 1200 HPLC高效液相色譜儀 (Agilent，四元梯度泵，自動進(jìn)樣，Angilent工作站)，AL204電子天平 (瑞士梅特勒-托利多公司)。

大黃、甘草飲片由解放軍第302醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)肖小河研究員鑒定為蓼科植物藥用大黃Rheum officinaleBaill.、光果甘草Glycyrriza glabraL.的干燥根和根莖。對照品大黃素 (批號:110795-200505)、大黃酚 (批號:110796-200716)、大黃酸 (批號:110757-200206)、大黃素甲醚 (批號:110758-200610)、蘆薈大黃素 (批號:110799-200806)、甘草酸單銨鹽 (批號:110799-200615)購自中國藥品生物制品檢定所，甲醇、乙腈 (色譜純，Sigma公司)。其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 5種蒽醌單體及甘草酸測定

2.1.1 色譜條件 蒽醌類成分:Kromasil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相為甲醇－0.1%磷酸水溶液(85∶15)，體積流量1.0 mL/min;檢測波長254 nm;進(jìn)樣量 10 μL;柱溫25 ℃［9］。

甘草酸:Kromasil C18色譜柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)。流動相為乙腈-0.1% 磷酸水溶液 (乙腈:0～5 min，19%～25%;5～19 min，25%～50%;19～20 min，50%～100%)，體積流量1.0 mL/min;檢測波長250 nm;進(jìn)樣量10 μL;柱溫 25 ℃［7］。

色譜圖見圖1。

圖1 大黃甘草湯中5種蒽醌單體、甘草酸HPLC圖

2.1.2 對照品溶液的配制 精密稱取大黃素等5種對照品適量，置于同一量瓶中，甲醇溶解，稀釋至刻度。作為含大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚各50 μg/mL的混合對照品溶液貯備液。對照品溶液為此貯備液按一定比例稀釋，含各成分10 μg/mL。

精密稱取甘草酸銨對照品適量，置于量瓶中，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。得到含甘草酸銨100 μg/mL的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取過60目大黃甘草湯浸膏粉末約0.2 g，精密稱定。

用于蒽醌單體測定的樣品溶液:加入25 mL甲醇加熱回流1 h，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液5 mL，揮去甲醇，加8%鹽酸溶液10 mL，超聲2 min，再加入CHCl310 mL，加熱回流處理1 h，放冷，置分液漏斗中，分取CHCl3層，酸液再用CHCl3萃取3次，每次10 mL，合并CHCl3液，減壓回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，過0.22 μm濾膜，即得。

用于甘草酸測定的樣品溶液:置于10 mL量瓶中，以甲醇溶解，超聲處理 (功率250 W，頻率40 kHz)60 min，甲醇定容至刻度，搖勻，過0.22 μm濾膜，即得。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密量取蒽醌類、甘草酸單銨鹽對照品溶液 0.02、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇定容，10 μL進(jìn)樣測定。以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度X對色譜峰面積Y進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，結(jié)果見表1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.5 精密度試驗(yàn) 取同一質(zhì)量濃度的對照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，計算得6對照品RSD值范圍為0.22%～0.81%。表明該方法精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗(yàn) 將同一樣品，按2.1.3項(xiàng)下樣品制備方法平行制備6份樣品溶液，測定峰面積，計算得6組分RSD值范圍為0.20%～1.70%。表明本法重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一樣品溶液于室溫下0、2、4、6、8、12 h分別進(jìn)樣，測定峰面積，計算得6組分RSD值范圍為0.24%～1.87%。表明樣品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8 回收率試驗(yàn) 精密稱定已知量的同一提取物樣品3份，分別精確加入6種對照品溶液，各份均按2.1.3項(xiàng)下方法制備樣品，測定峰面積，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 回收率實(shí)驗(yàn)

2.2 提取方法 根據(jù)L9(34)正交試驗(yàn)因素水平表，分9組實(shí)驗(yàn)，每組取日處方量13.5 g(大黃9 g、甘草4.5 g)，精密稱定。置250 mL圓底燒瓶中，按安排表中實(shí)驗(yàn)條件，加熱回流提取，各提取液60℃旋蒸并干燥至恒定質(zhì)量。

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計 依據(jù)L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計，綜合考慮總蒽醌、甘草酸、浸膏提取率三項(xiàng)指標(biāo)，考察溶劑量、提取時間、提取次數(shù)對上述指標(biāo)的影響，結(jié)合臨床實(shí)際應(yīng)用，選取各水平，見表3。

表3 L9(33)正交試驗(yàn)因素水平

2.4 正交試驗(yàn)結(jié)果 按照L9(34)正交設(shè)計表的條件進(jìn)行試驗(yàn)，分別測得大黃酸等5種蒽醌單體、甘草酸的量和浸膏得率，并進(jìn)行多指標(biāo)綜合評分。評分時以各指標(biāo)的最大值為參照將數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化，再給出不同的權(quán)重。總蒽醌和甘草酸的權(quán)重系數(shù)分別設(shè)為0.4和0.4。在原大黃甘草湯方在臨床應(yīng)用中日服用量較少、效應(yīng)成分不很明確的前提下，浸出物得率越高則指標(biāo)成分提取量越高，因此設(shè)定浸出物得率的權(quán)重系數(shù)為0.2。以綜合值進(jìn)行統(tǒng)計分析，其中綜合評分M=0.4X×100/135.15+0.4Y×100/95.15+0.2Z×100/45.55。依據(jù)綜合評分結(jié)果輸入SPSS系統(tǒng)進(jìn)行分析。

結(jié)果見表4。SPSS數(shù)理統(tǒng)計軟件方差綜合分析見表5。

表4 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表5 L9(34)正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果分析 以綜合評分為標(biāo)準(zhǔn)，在所選因素水平范圍內(nèi)，由表4、5直觀分析結(jié)果顯示，各因素主次順序?yàn)镃＞A＞B，各因素的影響水平為:A因素以第三水平影響最大，B因素以第一水平影響最大，C因素中以第三水平影響最大。綜合分析表結(jié)果表明，只有C因素即提取次數(shù)對綜合分析結(jié)果有顯著性影響 (P＜0.05)，A(溶劑量)因素與B(提取時間)因素對試驗(yàn)結(jié)果無顯著性影響 (P＞0.05)?？紤]實(shí)際應(yīng)用，確定最優(yōu)提取方法為A1B1C3，即加水量8倍，每次1 h，提取3次。

2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 按處方量10倍精密稱取藥材飲片135 g，按優(yōu)選出的提取方法進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)并測定各指標(biāo)成分，結(jié)果見表6。

表6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果證明，本調(diào)配方法穩(wěn)定可靠。

3 討論

優(yōu)選提取工藝的目的是將可能發(fā)揮藥效的部位得到最大程度的提取。本實(shí)驗(yàn)采用的多指標(biāo)綜合評價分析結(jié)果較單一指標(biāo)的評價更為科學(xué)合理。用多指標(biāo)正交實(shí)驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)選時，首先要針對指標(biāo)間的重要性差異給出各指標(biāo)權(quán)重，綜合評分后再進(jìn)行統(tǒng)計分析。本實(shí)驗(yàn)中大黃和甘草在正交實(shí)驗(yàn)中所得大黃總蒽醌、甘草酸的量隨提取條件變化的趨勢相同，故將這兩者有效成分的量權(quán)重均定為0.4。在原大黃甘草湯方在臨床應(yīng)用中日服用量較少、效應(yīng)成分不是很明確的前提下，浸出物得率越高則指標(biāo)成分提取量越高，因此設(shè)定浸出物得率的權(quán)重系數(shù)為0.2。根據(jù)這一思路，本實(shí)驗(yàn)在充分尊重大黃甘草湯臨床治療HBV相關(guān)性腎炎應(yīng)用的基礎(chǔ)上，應(yīng)用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計對大黃甘草膠囊進(jìn)行提取工藝的優(yōu)選，為其開發(fā)為治療HBV相關(guān)性腎炎的首個中藥制劑做基礎(chǔ)研究。

本實(shí)驗(yàn)采用因素為溶劑量、提取時間和次數(shù)的正交設(shè)計法，以浸膏得率、總蒽醌、甘草酸的量為指標(biāo)，綜合分析得到最佳理論組合為A1B1C3，并經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)最終確定提取工藝為8倍量水提取3次，每次1 h，即A1B1C3。其中提取次數(shù)對浸膏得率、總蒽醌、甘草酸的量影響最大，有顯著性差異 (P＜0.05)。溶劑量、提取時間三項(xiàng)水平間沒有顯著性差異 (P＞0.05)，影響較小。結(jié)果表明提取工藝簡單，可靠，可作為治療HBV相關(guān)性腎炎的新中藥制劑大黃甘草膠囊的提取工藝。

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