銀屑靈中芍藥苷在大鼠組織中分布研究

史長燦， 趙瑞芝，2， 盧傳堅，2*

(1.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東廣州 510405;2.廣東省中醫(yī)藥科學院，廣東廣州 510006)

銀屑靈片為廣東省中醫(yī)院制劑，此方多用于治療血虛風燥型銀屑病，在臨床以及實驗研究證實，療效確切［1-8］。目前是我院治療銀屑病的常規(guī)用藥，其主要由赤芍、土茯苓、莪術等成分組成。銀屑靈復方中含有的成分芍藥苷，具有抗炎、抗過敏，調節(jié)免疫、抑制角質顆粒細胞增生等與銀屑病治療相關的藥理活性［9-14］，是銀屑靈的主要活性成分之一。藥物體內分布與藥效和毒性息息相關，為了給銀屑靈的后期開發(fā)奠定基礎，本實驗建立了芍藥苷體內分布研究方法，并進行了其體內分布的研究。

1 材料與儀器

1.1 動物 SD雄性大鼠，SPF級，體質量 (300±40)g，廣東省醫(yī)學實驗動物中心 ［合格證號:0081750］，自由飲水進食。

1.2 儀器 Agilent1200HPLC，VWD檢測器 (Agilent);勻漿儀 (IKA，T10);渦旋器 (IKA型號GENIUS3);單道移液器 ACURA 825(20 ～200 μL，100 ～1 000 μL，瑞士);電子分析天平 (BT—125D);waters HLB spe柱;超低溫冰箱 (U-570，NEW BRUNSWICK);高速離心機 (G20);Waters20固相萃取儀 (Waters);超純水機 (Milli-Q，Millipore)。

1.3 試劑與藥品 銀屑靈藥材 (康美藥業(yè))，藥物提取液(廣東省中醫(yī)院中藥制劑實驗室制備);芍藥苷 (純度96.5%，南京澤郎醫(yī)藥科技有限公司);甲醇 (色譜級，天津四友);乙腈 (色譜級，迪馬);乙酸 (色譜純，天津富宇精細化工試劑公司)，其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 分離條件 色譜柱Kinetex C18，(2.6 μm，4.6 mm×100 mm)，檢測器 VWD，柱溫 30℃，體積流量 1.2 mL/min，檢測波長275 nm。甲醇-乙腈-0.5%冰乙酸梯度洗脫，見表1。

表1 流動相條件

2.2 標準品溶液配制 精密稱取適量芍藥苷，用70%甲醇溶解制成質量濃度為1.6 mg/mL對照品貯備液，放置4℃冰箱中保存。

2.3 給藥與樣品采集 12只SD雄性大鼠隨機分為兩組。一組按照8.3 g/kg灌胃給予銀屑靈連續(xù)灌胃6 d，最后一次灌胃2 h后麻醉處死，取出心、肝、脾、肺、腎、腦各組織，另一組按照110 g/kg劑量一次給予大鼠銀屑靈，給藥后2 h處死動物，同上述操作取材，分別將心、肝、脾、肺、腎、腦用生理鹽水清洗，用濾紙吸去表面水分，放置在－80℃冰箱中備用。

2.4 樣品處理

2.4.1 樣品準備 將置－80℃冰箱中保存的組織放至室溫并用濾紙吸干水分，取1 g左右并精密稱定質量，加入10倍體積 (w/v)生理鹽水，在冰浴中進行勻漿。

2.4.2 處理方法 加入1.0 mL甲醇將spe萃取柱進行活化，再加入1.0 mL純水洗去甲醇，將組織液高速離心后取200 mL加入到spe柱，靜置流出組織液后，加1.0 mL的水，靜置流出并抽去水分，加1.0 mL甲醇洗脫spe柱并用EP管收集，置氮吹儀下吹干，再用200 μL的70%甲醇溶解，過 0.22 μL 濾膜，進樣 10 μL。

3 結果

3.1 方法專屬性 取空白組織液和加入對照品的組織液按照2.4.2項方法處理后分別進樣測定，以肝臟組織為例，色譜圖見圖1。結果表明，芍藥苷的保留時間是3.20 min，組織中的內源性物質對測定結果沒有影響，專屬性較好。其他組織專屬性圖與肝臟相近。

圖1 大鼠肝臟樣品色譜圖

3.2 標準曲線與線性范圍 將大鼠空白組織液，加入系列芍藥苷對照品儲備溶液，配制成質量濃度為1.6、3.2、8.0、16、40、80、160 μg/mL系列標準組織溶液，按照2.4.2項方法處理樣品，以芍藥苷質量濃度 (X)為橫坐標，以待測圖譜峰面積 (Y)為縱坐標，采用加權 (1/x2)最小二乘法進行回歸，得回歸方程。各組織標準曲線和相關系數(shù)見表2。

3.3 精密度與準確度 根據(jù)不同組織的標準曲線范圍，取三份組織勻漿液加入不同質量濃度的芍藥苷對照品溶液，制備成3.2、16、80 μg/mL的低、中、高3個質量濃度的QC樣品，并將3個質量濃度分別制備5份，按2.4.2項下處理后，連續(xù)測定3 d，分別計算日內精密度、日間精密度及準確度。見表3。

表2 不同組織的標準曲線及相關系數(shù)

3.4 提取回收率 取芍藥苷對照品組織液低、中、高3個質量濃度的QC樣品，每個質量濃度5份，按2.4.2項下的方法處理，進樣測定得到相應峰面積A;另取相同低、中、高3種質量濃度的芍藥苷對照品，上樣測定得到相應峰面積B，將峰面積A與B比較，得到提取回收率，見表3。芍藥苷在不同組織中的提取回收率在78.3%～88.7%。

表3 精密度、準確度及提取回收率 (n=6)

3.5 穩(wěn)定性 分別將芍藥苷低、中、高3個質量濃度的QC樣品循環(huán)凍融3次 (－80℃)，以相同方法處理分析，結果顯示，測定值和真實值RSD均小于11%，說明樣品在考察的條件下比較穩(wěn)定;處理后的樣品在4℃放置24 h，室溫放置12 h，經分析樣品都比較穩(wěn)定。

3.6 大鼠以8.3 g/kg劑量 (臨床劑量)灌胃銀屑靈，2 h后僅血液中可檢測到芍藥苷，組織內未見芍藥苷，按常規(guī)劑量標準給藥未能測出組織分布;一次大劑量給予銀屑靈110 g/kg后，組織中芍藥苷質量濃度結果見圖2。

圖2 灌胃銀屑靈后大鼠各組織芍藥苷質量濃度

4 討論

姜清華、鄧晶晶等進行了大鼠灌胃赤丹丸芍藥苷的體內分布研究，其結果與本實驗的不同，由于灌胃的藥物處方相差比較大，配伍的成分可能會對芍藥苷組織分布內有較大的影響。

按照臨床劑量換算的動物劑量給予大鼠銀屑靈，芍藥苷僅在血液中可檢測到，說明正常劑量時芍藥苷僅分布于血液，提示后續(xù)工藝研究可直接用血液藥代動力學數(shù)據(jù)代表服用銀屑靈后芍藥苷的體內過程進行制劑工藝的優(yōu)化。

大劑量時芍藥苷主要分布于肝、腎。芍藥苷具有肝保護作用，大劑量時主要分布于肝臟，對于減少處方中其它藥物的肝損傷有積極意義。

［1］王 蕾，黃詠菁，王敏華.銀屑靈片治療尋常性銀屑病的臨床觀察［J］.廣州中醫(yī)藥大學學報，2009，11(26):520.

［2］閆玉紅，盧傳堅.銀屑靈片優(yōu)化方治療尋常型銀屑病的臨床探索性研究［J］.中藥新藥與臨床藥理，2011，22(6):695-698.

［3］盧傳堅，劉鳳年.銀屑靈片對上皮細胞有絲分裂的影響［J］.中醫(yī)藥臨床雜志，2007，19(1):25-26.

［4］盧傳堅，閆玉紅.“銀屑靈片”止癢作用的實驗研究［J］.中國藥房，2008，19(6):409-410.

［5］韓 凌，彭 燕，趙瑞芝，等.銀屑靈全方及拆方對角質細胞HacaT增殖的影響［J］.廣州中醫(yī)藥大學學報，2011，28(2):159-162，166.

［6］盧傳堅，吳小霞，劉鳳年.銀屑靈片治療尋常性銀屑病的臨床觀察［J］.廣州中醫(yī)藥大學學報，2009，11(26):520.

［7］盧傳堅，劉鳳年.“銀屑靈片”中藥提取液對腫瘤壞死因子-α刺激后角朊細胞分泌細胞因子IL-8的影響［J］.遼寧中醫(yī)雜志，2009，36(11):1862-1863.

［8］盧傳堅，閆玉紅，趙瑞芝.銀屑靈片對鼠尾鱗片表皮顆粒層形成的影響［J］.中藥新藥與臨床藥理，2010，21(3):231-233.

［9］鄭世存，李曉宇，歐陽兵，等.芍藥苷藥理作用研究新進展［J］.中國藥物警戒，2012，9(2):100-103.

［10］楊 軍，何麗娜，江 怡，等.赤芍總苷對大鼠皮層神經細胞鈣超載損傷的保護作用［J］.中藥新藥與臨床藥理，2001，12(3):212-215.

［11］王麗雯，袁 昉，魏 偉.重組人白細胞介素對人外周血淋巴細胞功能的影響及芍藥苷的作用［J］.中國臨床藥理學雜志，2009，25(2):129-133.

［12］賈 敏，張 寒，褚 靜.芍藥苷對大鼠慢性肝損傷及肝纖維化的保護作用［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結合雜志，2011，20(36):4618-4619.

［13］惠愛武，馮文革，趙 崗，等.芍藥苷對荷瘤小鼠化療的減毒增效作用研究［J］.陜西中醫(yī)，2011，32(7):925-926.

［14］張 斌，李紅梅，王 媛，等.芍藥苷減輕小鼠LPS性急性肺損傷的作用機制研究［J］.中國病理生理雜志，2011，27(10):1956-1960.