無患子皂苷對大鼠實(shí)驗(yàn)性心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

卞 海， 居 靖， 王雅娟， 楊 帆， 陳 明， 龍子江*

(1.安徽中醫(yī)學(xué)院，安徽合肥 230038;2.安慶市立醫(yī)院，安徽安慶 246003;3.安徽省中醫(yī)院，安徽合肥 230038)

無患子Sapindus mukurossiGaerth.別名皮皂子、肥皂樹、洗手果，為無患子科無患子屬落葉喬木［1］，其植物的果皮、莖及果實(shí)中含有三萜類化合物、皂苷、脂肪酸及黃酮類化合物。其中的皂苷類成分無患子皂苷是一種天然的非離子型表面活性劑，具有多種生物活性［2-3］。前期研究發(fā)現(xiàn)無患子皂苷能有效改善實(shí)驗(yàn)大鼠左心室血流動力學(xué)，增強(qiáng)心肌收縮力，說明無患子皂苷具有改善心臟血流的功能。本課題主要就無患子皂苷是否具有減輕再灌注損傷的作用進(jìn)行探索。

1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動物:雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，許可證號:SCXK(蘇)2008-0004，由南京醫(yī)科大學(xué)動物中心提供;陽性藥物:復(fù)方丹參片 (北京醫(yī)藥集團(tuán)合肥神鹿雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，批號:20100810);實(shí)驗(yàn)藥物:無患子皂苷，純度為92.4%(合肥新新助劑公司提供，批號20111218);試劑:琥珀酸脫氫酶 (SDH)、乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒 (均由南京建成生物工程研究所提供，批號20111020);主要儀器:HX—300動物呼吸機(jī) (成都泰盟科技有限公司)，XD—7100單道心電圖機(jī) (上海醫(yī)用電子儀器廠)，754紫外-可見分光光度計(jì) (上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn))。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物模型制備 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組 (等容量蒸餾水)、模型組 (等容量蒸餾水)、復(fù)方丹參片組 (0.052 g/kg)，根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)的劑量設(shè)計(jì)［4］將無患子皂苷組分為無患子皂苷大劑量組 (0.486 g/kg)、無患子皂苷小劑量組(0.054 g/kg)。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，各組大鼠分別按照相應(yīng)劑量灌胃給藥，每天1次，連續(xù)7 d。實(shí)驗(yàn)方法［4］略做改進(jìn)，末次藥后20 min，以戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，將大鼠仰位固定于手術(shù)臺上，作頸正中切口，分離氣管并行氣管內(nèi)插管，連接小型動物呼吸機(jī) (動物呼吸機(jī)設(shè)定潮氣量為18，呼吸頻率為58次/min，吸呼比為2∶1)。經(jīng)左上肢、右上肢、左下肢和右下肢皮下插入心電圖引導(dǎo)電極，實(shí)施Ⅱ?qū)?lián)心電圖監(jiān)測。左胸部消毒剪毛后自左側(cè)3～4肋間開胸，小心剪開心包膜，暴露心臟，以6-0無損傷縫合線于肺動脈圓錐及左心耳間迅速結(jié)扎冠脈左前降支，打活結(jié)，閉胸。各組動物在結(jié)扎30 min后迅速打開結(jié)扎線進(jìn)行再灌注180 min。假手術(shù)組僅開胸，穿線不結(jié)扎，其余操作同模型組。

2.2 指標(biāo)檢測及方法

2.2.1 監(jiān)測心電圖 篩選出正常心電圖的大鼠，監(jiān)測并分別記錄各鼠手術(shù)前、結(jié)扎即刻，再灌注即刻及再灌注后60 min、120 min、180 min的標(biāo)準(zhǔn)Ⅱ?qū)?lián)心電圖，用游標(biāo)卡尺測量 S-T 段升高值［5］。

2.2.2 血清酶學(xué)和心肌梗死面積 再灌注180 min后，腹主動脈取血6 mL后3 000 r/min離心10 min，分別測定LDH、SDH的水平;剖取心臟并立即用冰生理鹽水沖洗去除心臟殘血，用濾紙吸干心臟，電子天平稱定質(zhì)量后進(jìn)行TTC染色，按照試劑盒要求操作可發(fā)現(xiàn)，因脫氫酶還原TTC而缺血危險(xiǎn)區(qū)變?yōu)榧t色，因脫氫酶消失而梗死區(qū)變?yōu)榘咨瑢⒐Ｋ绤^(qū)和非梗死區(qū)用刀片切割分離，梗死范圍以梗死區(qū)占缺血區(qū)質(zhì)量的百分比表示。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 無患子皂苷對心電圖S-T段的影響 與假手術(shù)組大鼠比較，模型組在缺血及再灌注即刻時(shí)心電圖S-T段顯著抬高，提示造模成功 (P＜0.01);與模型組比較，大劑量組大鼠的心電圖S-T段下降較為明顯 (P＜0.01)，其余各藥物組均有明顯下降趨勢，說明無患子皂苷能有效減輕模型大鼠S-T段的抬高，詳見表1。

表1 無患子皂苷對心肌缺血再灌注模型大鼠心電圖S-T段的影響 (ΔS-T，mv)(±s，n=10)

表1 無患子皂苷對心肌缺血再灌注模型大鼠心電圖S-T段的影響 (ΔS-T，mv)(±s，n=10)

注:與假手術(shù)組相比，##P＜0.01;與模型組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別 缺血再灌注5 min 30 min 5 min 60 min 120 min 160 min假手術(shù)組 －0.03±0.01 0.02±0.01 0.02±0.01 0.03±0.01 0.03±0.01 0.04±0.01模型組 －0.38±0.10## 0.38±0.12## 0.38±0.15## 0.36±0.10## 0.36±0.15## 0.31±0.14##無患子皂苷小劑量組 0.30±0.11 0.22±0.03* 0.20±0.10 0.25±0.08* 0.22±0.08* 0.21±0.08*無患子皂苷大劑量組 0.19±0.07* 0.17±0.05* 0.12±0.07＊＊ 0.16±0.04＊＊ 0.15±0.07＊＊ 0.14±0.10＊＊復(fù)方丹參片組 0.20±0.05* 0.19±0.08* 0.17±0.04＊＊ 0.22±0.03* 0.21±0.07* 0.15±0.03＊＊

3.2 無患子皂苷對血清酶釋放的影響 術(shù)后再灌注180 min，模型組大鼠血清中SDH水平較假手術(shù)組明顯降低(P＜0.01)，LDH的水平顯著高于假手術(shù)組 (P＜0.01);與模型組比較，無患子皂苷能明顯升高大鼠血清中SDH的水平，并顯著降低LDH的水平 (P＜0.05，P＜0.01)，結(jié)果見表2。

3.3 無患子皂苷對心肌梗死范圍的影響 再灌注180 min后，解剖取得大鼠心臟并進(jìn)行TTC染色，模型組心肌梗死區(qū)面積較大且梗死嚴(yán)重，與假手術(shù)組比較有顯著性差異 (P＜0.01)，說明復(fù)制動物模型成功;無患子皂苷各劑量組與模型組相比較，均能使大鼠的心肌梗死范圍減少，其中無患子皂苷大劑量組效果顯著 (P＜0.01)，說明無患子皂苷能有效降低模型大鼠心肌的梗死率，結(jié)果見圖1。

表2 無患子皂苷對心肌缺血再灌注模型大鼠SDH和LDH的影響 (±s，n=10)

表2 無患子皂苷對心肌缺血再灌注模型大鼠SDH和LDH的影響 (±s，n=10)

注:與假手術(shù)組相比，##P＜0.01;與模型組相比，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

組別 SDH/(U·mg－1prot)LDH/(U·mg－1prot)假手術(shù)組181.2±3.6 6 583.2±325.6模型組 165.4±2.3## 8 569.4±218.7##無患子皂苷小劑量組 171.9±4.2* 7 893.6±256.3*無患子皂苷大劑量組 179.4±5.7＊＊ 6 952.7±385.6＊＊復(fù)方丹參片組 173.5±4.9* 7 290.1±299.5＊＊

4 討論

圖1 無患子皂苷給藥后對心肌缺血再灌注模型大鼠心肌梗死率的影響 (±s，n=10)

冠狀動脈結(jié)扎法主要通過狹窄或閉塞冠狀動脈造成心肌缺血或梗塞，最大的優(yōu)點(diǎn)為臨床相關(guān)性好［6］。缺血導(dǎo)致心肌損害，而再灌注就象雙刃劍，通過改善心肌氧供和限制心肌細(xì)胞“自溶”來減少梗死面積，同時(shí)引起心臟局部細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的失衡及某些細(xì)胞因子、黏附分子的過度表達(dá)［7］，在一定程度上加重了再灌注的損傷。本實(shí)驗(yàn)通過制備大鼠心肌缺血再灌注損傷模型，觀察無患子皂苷對其心電圖S-T段、血清酶學(xué)以及心肌梗死范圍的作用。結(jié)果顯示，無患子皂苷各劑量組模型大鼠的心電圖S-T段呈明顯的下降，并能顯著降低LDH和升高SDH的活性，減少心肌梗死率的發(fā)生 (P＜0.01)。

實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，心肌缺血再灌注時(shí)，心肌產(chǎn)生大量的氧自由基，由于氧自由基可轉(zhuǎn)化成羥氧自由基作用于細(xì)胞膜，損害心肌細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)大量的乳酸脫氫酶 (LDH)釋放，加劇了心肌缺血再灌注的損傷［8］。LDH是參與各組織糖酵解過程中主要的酶，代表著機(jī)體無氧代謝能力的高低，是無氧氧化的標(biāo)志酶［9］，對心肌能量代謝有重要的影響。SDH為有氧代謝-三羧酸循環(huán)的限速酶和線粒體的標(biāo)志酶，主要分布于線粒體內(nèi)膜，其活性可反映三羧酸循環(huán)的強(qiáng)弱［10］。心肌缺血再灌注時(shí)，LDH的異常可引起無氧酵解能力代償性的提高，導(dǎo)致LDH釋放進(jìn)一步增強(qiáng)，SDH活性下降，而心肌能量代謝發(fā)生異常;心肌受損后，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)易被破壞而導(dǎo)致心肌酶大量釋放入血，相關(guān)心肌酶釋放量均異?！，F(xiàn)代研究表明，心肌缺血缺氧，心肌組織嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，LDH水平明顯增加，其升高程度與心肌梗死程度相平行［11］，當(dāng)SDH活性下降，能量代謝平衡被破壞，則引起心肌收縮紊亂［12］，引發(fā)心肌損傷。本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)，無患子皂苷能夠改善實(shí)驗(yàn)性大鼠心肌缺血的癥狀，能夠降低心肌缺血是發(fā)生的過氧化水平［4］，改善心肌缺血再灌注損傷時(shí)的心肌酶學(xué)指標(biāo)及白介素、TNF-α、NF-κB 等炎性因子水平［13-14］，并能夠降低原發(fā)性高血壓及腎性高血壓大鼠的血壓并改善高血壓大鼠的血管活性物質(zhì)，保護(hù)損傷血管［15-16］，而本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，無患子皂苷各劑量組與模型組相比，S-T段抬高趨勢和心肌梗死面積均有所減少，并可顯著升高SDH和降低LDH的活性，表明無患子皂苷對心肌缺血再灌注損傷起到一定的保護(hù)作用，而高血壓時(shí)心、腦、腎靶器官的損傷是其致死的主要原因，尤其是心臟這一血液循環(huán)的關(guān)鍵部位，這保護(hù)心臟這一重要靶器官也是高血壓治療、提高患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵。西藥治療在降壓方面有較好的效果，但其對于靶器官則沒有直接的保護(hù)作用，如果將中西醫(yī)合用，則能夠在降壓的同時(shí)，保護(hù)重要臟器，明顯提高患者的生活質(zhì)量。無患子皂苷既能降低實(shí)驗(yàn)性高血壓大鼠的血壓，又對心臟有一定的保護(hù)作用，并能夠改善大鼠心肌缺血和缺血再灌注損傷。

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