金欣口服液對(duì)RSV感染BALB/c小鼠TLR7 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

戴啟剛， 汪受傳， 徐建亞， 李佳曦， 梁曉鑫， 李 濤， 孫寒丹

(南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科研究所，江蘇南京 210029)

呼吸道合胞病毒 (respiratory syncytial virus，RSV)感染呼吸道后通過誘導(dǎo)上皮細(xì)胞分泌細(xì)胞因子、趨化因子等炎性介質(zhì)，引起支氣管痙攣產(chǎn)生氣道高反應(yīng)［1］，是世界范圍內(nèi)嬰幼兒病毒性下呼吸道感染最主要的病毒病原，中醫(yī)藥治療RSV感染有良好的臨床療效。前期臨床和實(shí)驗(yàn)研究顯示金欣口服液 (原名清肺口服液)是治療小兒病毒性肺炎的有效中藥制劑［2］，有拮抗RSV作用［3-5］?，F(xiàn)代相關(guān)研究已證實(shí)Toll樣受體 (Toll-like receptor，TLRs)與RSV感染密切相關(guān)［6］，TLRs介導(dǎo)的信號(hào)通路既可激活天然免疫又可調(diào)節(jié)獲得性免疫，參與天然免疫系統(tǒng)對(duì)病毒的識(shí)別，在抗病毒感染中發(fā)揮了重要的作用［7-9］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)13個(gè)TLRs成員，TLR7是與RSV關(guān)系最為密切的TLRs之一［10］。TLR7通過識(shí)別病毒單鏈RNA(single-stranded RNA，ssRNA)以依賴髓樣分化因子-88(MyD88)的信號(hào)通路活化免疫細(xì)胞，介導(dǎo)抗病毒免疫。

本實(shí)驗(yàn)以RSV感染BALB/c小鼠引發(fā)肺炎，觀察小鼠肺組織中TLR7 mRNA、蛋白表達(dá)及金欣口服液對(duì)它們的作用，探討金欣口服液可能的抗病毒作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí) BALB/c小鼠，8～10周齡，雌性，18～22 g，揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心，許可證號(hào):SCXK(蘇)2007-0001，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心;呼吸道合胞病毒A亞型 (Long株)，武漢國(guó)家典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 藥品 金欣口服液 (浸膏):全國(guó)名老中醫(yī)、南京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)兒科研究所所長(zhǎng)汪受傳教授經(jīng)驗(yàn)方，由炙麻黃3 g、苦杏仁10 g、生石膏20 g、黃芩6 g、葶藶子10 g、桑白皮10 g、前胡10 g、虎杖12 g組成，按比例取藥，用10倍量水浸泡藥物30 min，先煎生石膏30 min后，再將其他藥放入大火煮沸后小火煎煮30 min，取出藥汁，藥材中再加入8倍量水依上法煎煮，合并兩次藥汁用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀低壓濃縮為質(zhì)量濃度為1.351 g/L的金欣口服液;利巴韋林顆粒 (新博林)，50 mg/包，四川百利藥業(yè)有限責(zé)任公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H51023508，批號(hào)110647。

1.3 主要儀器 電泳槽、Trans-Blot_SD半干轉(zhuǎn)印槽，美國(guó)Bio-rad;超低溫冰箱，美國(guó)Theromo公司;BioPhotometer蛋白核酸分析儀、MJ mini梯度PCR儀、高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)、面包式離心機(jī)、移液槍，德國(guó)Eppendorf公司;漩渦振蕩器、水平搖床，江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠;電子天平，上海天平儀器廠;制冰機(jī)，美國(guó)Scotsman公司;Lightrcycler實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，德國(guó)Roche公司。

1.4 主要試劑 RNA提取試劑盒RNAiso plus、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，日本TAKARA公司;TLR7引物，上海生工生物技術(shù)有限公司;β-Actin抗體、羊抗兔HRP標(biāo)志二抗，美國(guó)CST公司;TLR7多克隆抗體，美國(guó)abcam公司;蛋白裂解液RIPA(增強(qiáng)型)、PMSF，碧云天生物技術(shù)有限公司;TRIS base、甘氨酸，北京索萊寶公司;光明牌脫脂奶粉，光明乳業(yè)有限公司;5倍上樣緩沖液、預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Marker(10～170 kDa)，南京生興生物技術(shù)有限公司;29∶1丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺混合物 (Acr-Bis)、10%十二烷基磺酸鈉 (SDS)、過硫酸銨 (AP)，美國(guó)伯樂;PVDF膜 (0.45 μm孔徑)，Millipore;封口膜，Parafilm;膠片，柯達(dá)公司;余為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組 選用清潔級(jí)健康BALB/c小鼠，8～10周齡，雌性，18～22 g。動(dòng)物分兩大組:72 h組 (RSV首次滴鼻72 h后采集標(biāo)本)、144 h組 (RSV首次滴鼻144 h后采集標(biāo)本);每大組又分為5小組，正常組、RSV感染模型組、利巴韋林組、金欣高劑量組、金欣等效劑量組。每組15只小鼠。利巴韋林組給予臨床等效劑量46 mg/(kg·d)，金欣等效劑量組給予臨床等效劑量27.6 g/(kg·d)，金欣高劑量組給藥138 g/(kg·d)(相當(dāng)于臨床等效劑量的5倍)。藥物實(shí)驗(yàn)組每日劑量分2次灌胃，正常組與RSV組灌胃同等劑量的生理鹽水。

2.2 造模及給藥方式 健康BALB/c小鼠于無病原體環(huán)境中常規(guī)飼養(yǎng)3 d后開始正式實(shí)驗(yàn)。行乙醚淺麻后滴鼻TCID50RSV 50 μL/只 (正常組滴鼻同體積無血清DMEM培養(yǎng)基)，每天滴鼻2 h后給相應(yīng)藥物灌胃，72 h組RSV滴鼻3 d、灌胃3 d，144 h組RSV滴鼻3 d、灌胃5 d，具體方案如圖1。觀察小鼠反應(yīng)，若有首次滴鼻RSV造模48 h后，出現(xiàn)發(fā)熱、寒戰(zhàn)、蜷臥、豎毛、厭食、流涕、呼吸頻率加快等為陽性反應(yīng)，示造模成功。

圖1 實(shí)驗(yàn)造模及給藥方案流程圖

2.3 肺組織的采集 用乙醚將小鼠麻醉后開胸取肺組織，置于－70℃保存，分別取5只肺組織用于realtime PCR檢測(cè)TLR7 mRNA水平，5只肺組織用于 Western Blot檢測(cè)TLR7蛋白表達(dá)水平。

2.4 Realtime PCR檢測(cè)肺組織中TLR7 mRNA水平 液氮中加RNAiso plus 1 mL研磨肺組織，按說明書提取組織總RNA，瓊脂糖凝膠電泳及生物分光光度計(jì)對(duì)RNA定性及定量分析，按照RT-PCR試劑盒說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，SYBR Green realtime PCR法檢測(cè)TLR7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平，TLR7引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn) ［11］，TLR7:正義鏈5'-CTGGAGTTCAGAGGCAACCATT-3'，反義鏈 5'-GTTATCACCGGCTCTCCATAGAA-3';內(nèi)參β-actin:正義鏈5'-GCCTTCCTTCTTGGGTAT-3'，反義鏈 5'-GTCTTTACGGATGTCAACG-3'。Real time PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性10 s，95℃變性5 s，55℃退火10 s，72℃延伸15 s，共45個(gè)循環(huán)，同時(shí)做熔解曲線。重復(fù)3次。Real-Time PCR結(jié)果采用相對(duì)定量法計(jì)算，2－ΔΔCt方法是Real-Time PCR實(shí)驗(yàn)中分析基因表達(dá)相對(duì)變化的一種簡(jiǎn)便方法［12］，ΔΔCt=(Ct樣本 －Ct內(nèi)參)受試組－ (Ct樣本－Ct內(nèi)參)對(duì)照組。

2.5 Western Blot法檢測(cè)肺組織TLR7蛋白表達(dá) 液氮中研磨肺組織，每100 mg肺組織中加入500 μL增強(qiáng)型RIPA與PMSF混合液 (兩者比例100∶1)裂解，4℃下13 000 r/min離心30 min，取上清，即為所提取之小鼠肺組織總蛋白。BCA法蛋白定量并根據(jù)結(jié)果調(diào)整使各樣品總蛋白含量一致，5倍上樣緩沖液蛋白變性，5%濃縮膠及10%分離膠SDSPAGE凝膠電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)印，5%TBST脫脂奶粉封閉2 h，1∶500兔源性TLR7一抗4℃孵育過夜、1∶500羊抗兔二抗孵育2 h，ECL法顯色，膠片壓片。ImageJ軟件分析蛋白條帶灰度值，以β-actin作為內(nèi)參照蛋白進(jìn)行校準(zhǔn)，采用目標(biāo)蛋白條帶灰度值/β-actin條帶灰度值來表示TLR7蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，單因素方差分析 (One-Way ANOVA)對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 RSV感染BALB/c小鼠模型復(fù)制 依2.2項(xiàng)造模方法予RSV滴鼻48 h后，BALB/c小鼠出現(xiàn)精神萎糜、體溫升高 (測(cè)肛溫)、寒戰(zhàn)、活動(dòng)減少、蜷臥、豎毛、流涕、呼吸頻率加快、厭食等陽性反應(yīng)，每一組BALB/c小鼠呈現(xiàn)扎堆現(xiàn)象，示造模成功。

3.2 金欣口服液對(duì)肺組織中TLR7 mRNA的表達(dá)水平的影響 Realtime PCR檢測(cè)肺組織中TLR7 mRNA水平，結(jié)果如表1所示。72 h組RSV模型組TLR7 mRNA水平為正常組的2.17倍，＞2倍示結(jié)果有意義。金欣高劑量組、等效劑量組TLR7 mRNA水平與RSV模型組比較有顯著差別 (P＜0.01、P＜0.05)。144 h組RSV模型組TLR7 mRNA水平為正常組的1.13倍，無意義。各組間TLR7 mRNA表達(dá)比較無顯著差別。表明感染早期 (72 h)TLR7 mRNA的表達(dá)增加;當(dāng)不再感染RSV，并隨著治療的深入，144 h組TLR7 mRNA的表達(dá)漸恢復(fù)至正常水平。

3.3 金欣口服液對(duì)肺組織中TLR7蛋白表達(dá)水平的影響Western Blot法檢測(cè)肺組織TLR7蛋白表達(dá)水平，顯影結(jié)果如圖2所示。用Image J軟件分析TLR7蛋白、內(nèi)參β-actin條帶灰度值。用 (TLR7/β-actin灰度值比) /(TLR7/β-actin灰度值比)正常組表示TLR7蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，并進(jìn)行組間比較，結(jié)果如表2所示。72 h組中RSV模型組的TLR7蛋白表達(dá)高于正常組 (P＜0.01);與RSV模型組相比，金欣高劑量組、等效劑量組明顯降低TLR7蛋白表達(dá)(P＜0.01、P＜0.05)，兩者之間同樣存在著量-效關(guān)系。144 h組中實(shí)驗(yàn)各組TLR7蛋白表達(dá)均低于正常組 (P＜0.01)，金欣組TLR7蛋白表達(dá)高于RSV模型組，但相比無差異性。表明感染早期 (72 h)，TLR7蛋白表達(dá)增加，到了144 h TLR7蛋白表達(dá)下降，金欣口服液使之趨向正常水平。

表1 RSV感染BALB/c小鼠肺組織中TLR7 mRNA表達(dá)水平(±s，n=5)

表1 RSV感染BALB/c小鼠肺組織中TLR7 mRNA表達(dá)水平(±s，n=5)

注:與 RSV模型組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。

2 － ΔΔCt 72 h組 144 h組RSV模型組2.17 ±0.22 1.13 ±0.23利巴韋林組 1.40 ±0.16＊＊ 0.93 ±0.06金欣高劑量組 1.18±0.09＊＊ 0.88±0.29金欣等效劑量組 1.81 ±0.26* 1.07 ±0.14 F 23.244 4.357 P 0.000 0.027

圖2 RSV感染BALB/c小鼠肺組織TLR7蛋白表達(dá)顯影圖

表2 RSV感染BALB/c小鼠肺組織中TLR7蛋白相對(duì)表達(dá)水平 (ˉx ± s，n=5)

4 討論

TLR7是Toll-like受體家族中與RSV關(guān)系最為密切的成員之一［10］，參與對(duì)細(xì)菌、病毒、寄生蟲和真菌感染的免疫應(yīng)答。當(dāng)RSV入侵機(jī)體時(shí)，TLR7可識(shí)別RSV ssRNA，從而激活髓樣分化因子MyD88依賴的信號(hào)通路，通過調(diào)節(jié)通路下游因子—干擾素調(diào)節(jié)因子7(IRF7)引起IFN-α的表達(dá)［13］。IFN-α在病毒感染早期可抑制病毒的復(fù)制，是自然免疫重要的組成部分。Lund等用泡狀口腔炎病毒 (VSV)全身感染野生型和TLR7－/－小鼠，結(jié)果野生型小鼠血清中IFN-α水平明顯升高，而TLR7－/－小鼠血清中只有低水平的IFN-α［14］;Xu等發(fā)現(xiàn)慢性乙肝患者漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDCs)受損后引起 TLR7下調(diào)，從而導(dǎo)致 IFN-α水平下降［15］。

金欣口服液是汪受傳教授治療小兒病毒性肺炎的臨床驗(yàn)方，具有拮抗RSV作用。本實(shí)驗(yàn)通過設(shè)計(jì)72 h、144 h兩個(gè)實(shí)驗(yàn)大組，每個(gè)實(shí)驗(yàn)大組又設(shè)計(jì)正常組、RSV感染模型組、利巴韋林組、金欣高劑量組、金欣等效劑量組5個(gè)實(shí)驗(yàn)小組，來觀察金欣口服液對(duì)TLR7 mRNA及TLR7蛋白表達(dá)的影響及其隨藥物作用時(shí)間延長(zhǎng)的變化趨勢(shì)。結(jié)果表明，金欣口服液能下調(diào)RSV感染早期TLR7 mRNA及TLR7蛋白的表達(dá)，從而在病程早期即提高機(jī)體的抗病毒效應(yīng)。而隨著RSV感染的停止和治療的持續(xù)，TLR7 mRNA及TLR7蛋白的表達(dá)下調(diào)，金欣口服液使之逐漸趨向正常水平，表明機(jī)體趨向恢復(fù)。

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