應(yīng)用PC12細(xì)胞損傷模型篩選中藥活性成分的研究進(jìn)展

嵇源源， 楚小晶， 王劍文

(蘇州大學(xué)藥學(xué)院，江蘇蘇州 215123)

PC12細(xì)胞是大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤分化的細(xì)胞株，是一種兒茶酚胺細(xì)胞，能合成貯存并釋放適量的兒茶酚胺 (主要是多巴胺和去甲腎上腺素)，具有典型的神經(jīng)細(xì)胞特征，常用于神經(jīng)細(xì)胞死亡方式和神經(jīng)毒性損害研究［1］。PC12細(xì)胞曾經(jīng)用于抗神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的藥物如雷帕霉素、L-肌肽等的開(kāi)發(fā)［2-3］。目前，有關(guān)PC12細(xì)胞應(yīng)用于天然藥物的神經(jīng)損傷保護(hù)機(jī)制的研究報(bào)道也日漸增多［4-5］，在具有神經(jīng)保護(hù)作用的天然藥物篩選中，PC12細(xì)胞模型已逐漸得到廣泛應(yīng)用。但尚未見(jiàn)PC12細(xì)胞體外損傷模型建立方法以及利用該模型進(jìn)行中藥活性成分篩選的文獻(xiàn)綜述。本文將系統(tǒng)介紹PC12細(xì)胞建立的體外模型、方法和具有保護(hù)活性的中藥活性成分，為神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病天然藥物開(kāi)發(fā)研究提供依據(jù)和參考。

1 PC12建立的體外模型

PC12細(xì)胞表面存在大量的神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體，神經(jīng)生長(zhǎng)因子可誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化成交感神經(jīng)元樣細(xì)胞，從而在形態(tài)生理生化及功能方面更接近于神經(jīng)元，是體外研究神經(jīng)細(xì)胞分化及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的主要模型［6］。未分化的PC12可看作未成熟的神經(jīng)元，建立體外模型時(shí)通常采用未分化的PC12細(xì)胞。

1.1 帕金森病的細(xì)胞損傷模型 許多神經(jīng)毒素如6-羥基多巴胺 (6-hydroxydopamine)，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶 (MPTP)，農(nóng)藥殺蟲(chóng)劑魚(yú)藤酮、百枯草等在體內(nèi)可以引起帕金森病，病理機(jī)制包括氧化應(yīng)激、抑制線(xiàn)粒體氧化呼吸鏈、神經(jīng)元的凋亡等。應(yīng)用上述神經(jīng)毒素?fù)p傷PC12細(xì)胞，建立帕金森模型可進(jìn)行帕金森病理觀察和細(xì)胞生物化學(xué)變化等方面的測(cè)定。

1.1.1 MPP+損傷模型 MPTP是一種神經(jīng)毒素，在腦內(nèi)可轉(zhuǎn)化為MPP+，最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元變性、死亡。選用MPP+(200～600 μmol/L)分別作用PC12細(xì)胞12～48 h，最佳建模條件為500 μmol/L MPP+損傷細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率為56%［7］?；钚蕴烊划a(chǎn)物紅景天苷［7］、芍藥苷［8］等對(duì)其損傷具有保護(hù)作用。

1.1.2 百草枯損傷模型 百草枯是一種除草劑，結(jié)構(gòu)類(lèi)似于MPP+，也可用來(lái)建立帕金森模型。以百草枯 (200～1 000 μmol/L)分別損傷PC12細(xì)胞12～48 h建立體外模型，24 h細(xì)胞活力為49.11% ～81.12%，最佳造模條件為800 μmol/L百草枯損傷PC12細(xì)胞24 h［9-10］。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯［10］及五味子乙素［11］等對(duì)該模型都具有保護(hù)作用。

1.1.3 6-羥基多巴胺損傷模型 6-羥基多巴胺神經(jīng)毒素能選擇性作用于兒茶酚胺能神經(jīng)元，是多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的毒劑。采用6-羥基多巴胺損傷PC12細(xì)胞建立模型，具有時(shí)間濃度依賴(lài)性，PC12細(xì)胞經(jīng)過(guò)250 μmol/L 6-羥基多巴胺24 h和36 h的損傷后細(xì)胞存活率為63%和45%，選用250 μmol/L，24 h為最佳造模條件［12］。谷精草提取物［13］、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯［14］等對(duì)該模型具有保護(hù)功能。

1.1.4 魚(yú)藤酮損傷模型 魚(yú)藤酮是從醉魚(yú)豆屬植物毛魚(yú)藤Derris ellipticaBenth的根、葉中分離出的主要化學(xué)成分，可透過(guò)細(xì)胞膜存在于線(xiàn)粒體，抑制線(xiàn)粒體呼吸鏈復(fù)合物I，發(fā)揮細(xì)胞毒作用［15］。魚(yú)藤酮常用于建立帕金森的細(xì)胞模型［16］，對(duì)PC12細(xì)胞的損傷具有濃度依賴(lài)性 (0.5～1.0 mmol/L)，細(xì)胞的存活率從 76.01% 降低到 58.87%［17］。槲皮素［18］、Bu-7［19］等活性天然產(chǎn)物具有保護(hù)作用。

1.2 阿爾茲海默病模型

β-淀粉樣蛋白 (Aβ)損傷模型 原代培養(yǎng)的神經(jīng)元建立阿爾茲海默病模型能夠相對(duì)較好地模擬在體神經(jīng)元的病變，但存在培養(yǎng)系統(tǒng)不穩(wěn)定，重復(fù)性和同一性較差等問(wèn)題，因此PC12細(xì)胞越來(lái)越多的用于研究阿爾茲海默病病理，在實(shí)驗(yàn)研究中經(jīng)常采用Aβ的活性片段Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡建立阿爾茲海默病的細(xì)胞模型［20］，損傷的濃度通常為20 ～30 μmol/L，時(shí)間為 24 h。雷公藤提取物［21］、人參皂苷 Rb1［22］等均有保護(hù)作用。

1.3 其他損傷模型 近年來(lái)，帕金森病和阿爾茲海默病的細(xì)胞模型的研究中發(fā)現(xiàn)幾乎全部的神經(jīng)毒素都能使PC12細(xì)胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激，氧化應(yīng)激是凋亡的中介物，凋亡又被認(rèn)為是神經(jīng)退化性疾病病理變化的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，因而有更多研究者建立PC12的氧化模型研究其機(jī)制。在體內(nèi)，各種途徑可以產(chǎn)生的活性氧 (ROS)，包括過(guò)氧化氫(H2O2)、一氧化氮 (NO)、過(guò)氧自由基等，其中H2O2是最常用的外源刺激PC12的氧化物質(zhì)，0.5 mmol/L H2O2處理細(xì)胞后，細(xì)胞存活率降至50%左右［23-24］。

與給予氧化損傷相對(duì)的是在PC12細(xì)胞上建立氧糖剝奪模型 (oxygen-glucose-deprivation)，即使用無(wú)糖無(wú)血清培養(yǎng)基，置于充入95%N2和5%CO2的低氧小室，隨著時(shí)間的增加 (12～48 h)，細(xì)胞活力逐漸下降 (68% ～20%)［25-26］。此外，氯胺酮［27］、甲醛［28］、酒精［29］及單壁碳納米管［30］等也可引起PC12的損傷。

2 對(duì)PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用的天然產(chǎn)物

通過(guò)PC12細(xì)胞建立的上述各種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，可以篩選對(duì)PC12細(xì)胞有保護(hù)作用，具有治療疾病潛能的有效物質(zhì)。近年來(lái)已通過(guò)此模型篩選得到多種中藥活性成分。

2.1 具有保護(hù)作用的植物提取物 銀杏葉提取物 (EGb)是從銀杏科植物銀杏Ginkgo biloba的葉片中提取的有效成分，在百草枯誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡模型中，EGb761的成分是24%黃酮苷，6%萜類(lèi)和其他組成成分，預(yù)處理后細(xì)胞存活率由 53.3% 上升到 82.4%［9］。EGb761對(duì) H2O2、MPP+造成的PC12細(xì)胞損傷均有保護(hù)作用［31-32］。菟絲子是臨床常用中藥，為旋花科植物菟絲子Cuscucta chinensisLam.干燥成熟的種子。菟絲子提取物 (100 mg/L)能提高M(jìn)PP+損傷的PC12細(xì)胞存活率約28.7%，凋亡比率由31.9% ±2.8%降低到6.3% ±0.16%［33］。枸杞提取物對(duì)MPP+誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞神經(jīng)毒性具有保護(hù)作用，能夠抗氧化及恢復(fù)谷胱甘肽 (GSH)水平，MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率從57.45% ±10.45% 上升至79.15% ±9.93%［34］。谷精草為谷精草科植物谷精草Eriocaulon buergerianumKoern.的干燥帶花莖的頭狀花序，對(duì)6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與降低NO的產(chǎn)生量和一氧化氮合酶 (iNOS)的表達(dá)量有關(guān)［13］。雷公藤提取物保護(hù)Aβ?lián)p傷的PC12細(xì)胞，其機(jī)制與拮抗細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加和抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)［21］。貫葉連翹Hypericum perforatumL.富含黃酮類(lèi)化合物，可以保護(hù)H2O2作用的PC12細(xì)胞，增加細(xì)胞存活率，降低乳酸脫氫酶 (LDH)的水平［35］。

2.2 活性成分

2.2.1 黃酮類(lèi) 原花青素在Aβ25-35誘導(dǎo)PC12的損傷中可以抑制凋亡以及細(xì)胞在S期的阻滯，使p53蛋白的表達(dá)增加［36］，進(jìn)而增加細(xì)胞存活率，保護(hù)PC12細(xì)胞。葛根素對(duì)Aβ［37］、MPP+［38-39］、H2O2［40］誘導(dǎo) PC12 的損傷均有抗凋亡的保護(hù)作用，降低對(duì)PC12細(xì)胞的損傷。木犀草素通過(guò)抑制神經(jīng)突生長(zhǎng)，增加細(xì)胞的抗氧化能力保護(hù)細(xì)胞［41］。H2O2可以引起PC12細(xì)胞鈣通道蛋白的調(diào)節(jié)異常和ROS的爆發(fā)，槲皮素通過(guò)拮抗該作用提高細(xì)胞存活率［42］。

黃芩苷和黃芩素是一種黃酮類(lèi)化合物，可以抑制PC12細(xì)胞缺血性損傷后ROS的產(chǎn)生以及p38的激活，從而保護(hù)PC12細(xì)胞［43］。黃芩素可以抑制H2O2引起的PC12細(xì)胞的氧化損傷和凋亡［44］。燈盞乙素的結(jié)構(gòu)是4，5，6-三羥基黃酮-7-葡萄糖醛酸苷，對(duì)低氧糖模型具有保護(hù)作用，可以減少LDH釋放，降低Ca2+水平和凋亡率［45］。金絲桃苷又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，在H2O2以及叔丁基過(guò)氧化氫誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的模型中，通過(guò)抗氧化抑制PC12細(xì)胞凋亡［46］。從豆科植物中提取的黃豆苷元和染料木苷對(duì)6-羥基多巴胺具有細(xì)胞毒保護(hù)作用［47］。淫羊藿苷是從淫羊藿Epimedium davidiiFranch中提取的黃酮類(lèi)化合物，可以抑制tau蛋白的過(guò)磷酸化，保護(hù)Aβ對(duì)PC12細(xì)胞的損傷［48］。Bu-7(化合物1)是從黃皮Clausena lansium中提取的一種類(lèi)黃酮，通過(guò)恢復(fù)線(xiàn)粒體膜電位，抑制魚(yú)藤酮誘導(dǎo)蛋白的過(guò)磷酸化，調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá)保護(hù)PC12細(xì)胞，且化合物1本身不會(huì)引起細(xì)胞的凋亡［19］。橙皮素也可保護(hù)H2O2損傷的PC12 細(xì) 胞［49］。從 知 風(fēng) 草Eragrostis ferruginea(Thumb)Beauv中提取了1種新黃酮化合物7-demethylageconyflavone(化合物2)和5種已知黃酮化合物tricin(化合物3)、ageconyflavone A(化合物4)、corylin(化合物5)、nectandrin B(化合物6)、4-ketopinoresinol(化合物7)均能使PC12細(xì)胞的EC50升高［50］?；衔锝Y(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

2.2.2 生物堿類(lèi) Neoechinulin A(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2)是海洋真菌中提取的吲哚類(lèi)生物堿，它通過(guò)降低三磷酸腺苷 (ATP)水平保護(hù)魚(yú)藤酮損傷的PC12細(xì)胞［51］。在MPP+建立的帕金森模型中，Neoechinulin A可以改善線(xiàn)粒體復(fù)合物Ⅰ的合成而減少細(xì)胞毒作用［52］。

小檗堿是一種苯并異喹啉類(lèi)季銨型生物堿。Kwon等研究小檗堿對(duì)陜西省爾茲海默病引起的細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)它能抑制細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞存活率［53］。胡椒堿通過(guò)抗氧化作用保護(hù)MPP+損傷的PC12細(xì)胞［54］。

2.2.3 酚酸類(lèi) 表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯占綠茶多酚的25%～40%左右，是綠茶中的主要活性成分。表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)百草枯［10］、MPP+［55］、6-羥基多巴胺［14］誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡均具有保護(hù)作用。益智仁原兒茶酸對(duì)H2O2［56］，MPP+［57］、魚(yú)藤酮［58］損傷的 PC12 細(xì)胞通過(guò)抗凋亡發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。

圖1 幾種具有神經(jīng)保護(hù)活性的黃酮類(lèi)化合物的結(jié)構(gòu)式

圖2 Neoechinulin A結(jié)構(gòu)式

2.2.4 糖苷類(lèi)物質(zhì) 紅景天苷屬于類(lèi)苯基丙烷苷類(lèi)，在MPP+的損傷過(guò)程中可以提高PC12細(xì)胞的存活率，并且首次發(fā)現(xiàn)紅景天苷可通過(guò)抑制NO通路來(lái)保護(hù)PC12細(xì)胞對(duì)抗MPP+誘導(dǎo)的凋亡［7］。紅景天苷也可保護(hù)低糖低血清、H2O2損傷的 PC12 細(xì)胞［25，59］。松果菊苷是葡糖苷類(lèi)化合物，可以保護(hù)H2O2損傷的PC12細(xì)胞，提高細(xì)胞的存活率，降低凋亡率［60］。芍藥苷可以保護(hù)MPP+以及酸損傷引起PC12細(xì)胞的自噬，下調(diào)LC-3等自噬蛋白的表達(dá)［8］。南嶺柞木苷G(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖3)與聚集狀的Aβ25-35共同孵育，可提高細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率從34.26%降低到22.62%，并伴隨ROS的產(chǎn)生［61］。

圖3 南嶺柞木苷結(jié)構(gòu)式

2.2.5 皂苷類(lèi) 人參皂苷是三萜皂苷，包含多種成分:人參皂苷Rg1通過(guò)抑制NF-κB的激活保護(hù)H2O2損傷的PC12細(xì)胞［62］。通過(guò)增加細(xì)胞存活率，抑制LDH和NO的釋放保護(hù)Aβ?lián)p傷的PC12［63］。人參皂苷Rb1通過(guò)清除ROS，抗氧化保護(hù)Aβ對(duì)PC12的損傷［22］。人參皂苷Rb3在氧糖剝奪模型中起保護(hù)作用［64］。人參皂苷Rd在氧糖剝奪模型和H2O2損傷模型中，均提高抗氧化酶的活性起到抗氧化的作用而保護(hù) PC12細(xì)胞［65］。人參皂苷Re在 Aβ或無(wú)血清對(duì)PC12造成的損傷中，提高細(xì)胞存活率、降低LDH水平，保護(hù)細(xì)胞受損［66］。遠(yuǎn)志皂苷是五環(huán)三萜類(lèi)皂苷，保護(hù)H2O2造成的PC12細(xì)胞的損傷［67］。低氧可以誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的損傷，大蒜總皂苷可以保護(hù)低氧誘導(dǎo)PC12細(xì)胞的損傷［68］。

2.2.6 萜類(lèi) 桃葉珊瑚苷 (結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4)屬于環(huán)烯醚萜苷類(lèi)，對(duì)H2O2損傷的PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用［69-70］，增加細(xì)胞存活率，降低凋亡率。梓醇主要存在于地黃Rehmannia glutinosa等植物中，在氧糖剝奪和氧化損傷模型中起神經(jīng)保護(hù)作用［71-72］。胡黃連苷-Ⅱ (結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖 4)可以協(xié)助PC12細(xì)胞抵抗H2O2的氧化損傷作用［73］。MPP+或H2O2損傷PC12細(xì)胞后，齊墩果酸、烏索酸能提高細(xì)胞存活率［74］?？屏_索酸 (結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4)來(lái)源于大花紫薇Lagerstroemia speciosa的提取物，在低氧糖模型中，可顯著提高細(xì)胞活力，降低上清液LDH水平，增強(qiáng)損傷細(xì)胞內(nèi)Na+-K+ATP酶活，保護(hù)PC12細(xì)胞［75］。白果內(nèi)酯是銀杏葉提取物的主要有效成分，對(duì)于Aβ?lián)p傷的PC12細(xì)胞具有保護(hù)作用［76］。

2.2.7 苯丙素類(lèi) 和厚樸酚與厚樸酚是具有酚式羥基的木脂體，可以保護(hù)Aβ對(duì)PC12細(xì)胞的神經(jīng)毒性作用［77］。五味子乙素是從五味子中提取出來(lái)的活性物質(zhì)，可以保護(hù)百草枯對(duì)PC12細(xì)胞的損傷［11］。紫花前胡素提高了PC12細(xì)胞對(duì)Aβ氧化損傷的抵抗作用［78］。蛇床子素通過(guò)減少產(chǎn)生降低MPP+對(duì)PC12細(xì)胞的損傷，抑制凋亡，達(dá)到保護(hù)目的［79］。

圖4 幾種具有保護(hù)作用的萜類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)式

2.2.8 其他 姜黃素是二酮類(lèi)化合物，低濃度姜黃素可以拮抗魚(yú)藤酮、MPP+致PC12細(xì)胞的損傷［80-81］。姜黃素也可以抑制Aβ對(duì)PC12細(xì)胞的氧化損傷［82］、減弱H2O2對(duì)PC12細(xì)胞的損傷［23］。花生四烯酸可以抑制低氧引發(fā)的細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的升高，保護(hù)PC12細(xì)胞［83］。大麻二酚 (結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖5)能拮抗 Aβ1–42導(dǎo)致的PC12細(xì)胞內(nèi)亞硝酸鹽的增加，使細(xì)胞免于損傷［84-85］。

圖5 大麻二酚結(jié)構(gòu)式

3 結(jié)語(yǔ)

對(duì)PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用的中藥活性成分，具有開(kāi)發(fā)成為治療神經(jīng)性疾病天然藥物的潛在價(jià)值，在細(xì)胞水平上的研究表明保護(hù)的機(jī)制與ROS以及凋亡有關(guān)，活性天然產(chǎn)物針對(duì)凋亡途徑的關(guān)鍵步驟進(jìn)行保護(hù)，例如拮抗細(xì)胞內(nèi)鈣超載［22］，抑制 ROS 和氮氧基 (NO·)的產(chǎn)生［7，66］，導(dǎo)致下游凋亡蛋白的調(diào)節(jié)［42］。研究PC12細(xì)胞的損傷保護(hù)機(jī)制，可以針對(duì)靶點(diǎn)篩選大量化合物，為神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病藥物開(kāi)發(fā)研究提供依據(jù)。目前，PC12的細(xì)胞模型仍在不斷的發(fā)展和進(jìn)步中，新的誘導(dǎo)物蛋白酶體抑制劑能有效地抑制泛素-蛋白酶體系［86］，中藥活性成分在該模型上尚未進(jìn)行篩選研究。PC12細(xì)胞易獲得、可傳代，可以快速方便的進(jìn)行初期篩選，然后在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步在神經(jīng)元和動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行神經(jīng)藥理研究，達(dá)到有效提高研究效率，節(jié)約研究成本之目的，PC12細(xì)胞模型的建立對(duì)于神經(jīng)退行性疾病的天然藥物篩選具有重要意義。

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